不同哈茨木霉制劑對植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能的影響

摘要：為探究不同哈茨木霉制劑對植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能的影響，給木霉制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)，在陜西省咸陽市旬邑縣進(jìn)行大田試驗(yàn)，以煙草品種云煙99為材料，試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：CK（常規(guī)施肥），T1（常規(guī)施肥+15 kg/hm²"哈茨木霉A劑型），T2（常規(guī)施肥+15 kg/hm²哈茨木霉B劑型），T3（常規(guī)施肥+15 kg/hm²哈茨木霉C劑型），T4（常規(guī)施肥+15 kg/hm²哈茨木霉D劑型）。不同的哈茨木霉制劑對植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和作用的影響，通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行探究。結(jié)果表明，從真菌α多樣性來看，T1處理土壤真菌群落的多樣性和豐富性較對照明顯增加，其真菌總OTU數(shù)量和特有OTU數(shù)量也均明顯增加，T2和T3處理則較對照減少。不同哈茨木霉制劑處理與對照間共有優(yōu)勢菌株不同，說明哈茨木霉改變了土壤真菌優(yōu)勢菌群。在門水平對真菌群落組成和組間差異性的檢驗(yàn)分析中發(fā)現(xiàn)，T2和T3處理腐生型真菌的毛霉菌門相對豐度增加，而T1和T4處理腐生型真菌的子囊菌門相對豐度增加，各處理間的毛霉菌亞門和子囊菌門相對豐度差異明顯；在屬級分析中，T2處理根霉屬和球囊霉屬較對照相對豐度分別提高2.79、1.75百分點(diǎn)，T3和T4處理病理學(xué)營養(yǎng)型鐮刀菌屬較對照豐度分別降低1.81、0.48百分點(diǎn)。各處理間鏈格孢屬和球孢子菌屬存在顯著差異，其中T1和T4處理鏈格孢屬豐度占比顯著升高。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，不同哈茨木霉制劑處理均提高了土壤優(yōu)勢菌群數(shù)量，以T4處理增加最多，優(yōu)勢菌群為子囊菌門、假孢子蟲科和地星目等。綜上所述，T3處理對植煙土壤真菌菌群落結(jié)構(gòu)改善效果最佳。

關(guān)鍵詞：煙草；哈茨木霉；土壤；真菌；群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S435.72""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0215-07

有研究表明，植物抗病能力與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，大量發(fā)生的土傳類病害與之密切相關(guān)，土壤微生態(tài)失衡造成的致病菌大量繁殖并富集于植物根部是誘發(fā)土傳病害的根源^［1］。豐富的土壤微生物多樣性和適宜的群落組成是支持生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的重要因素，良好的土壤微生態(tài)環(huán)境也是促進(jìn)植物生長發(fā)育的首要條件之一^［2］。通過水合氧化鐵與棘孢木霉復(fù)合處理菠菜，菠菜的地上部和根系中砷含量分別減少了37%和34%，地上部和根系生物量分別提高了134%和138%，同時(shí)土壤中碳、氮、磷礦化和抗氧化活性密切相關(guān)的土壤酶活性大幅升高^［3］。黃君霞等研究發(fā)現(xiàn)，采用硫酸銨和木霉處理后，連作土壤微生物群落得到了明顯改善，土壤細(xì)菌豐度和數(shù)量明顯增加，有害真菌的數(shù)量減少^［4］。經(jīng)高錳酸鉀消毒后的土壤，增施木霉能較大程度改善土壤真菌群落結(jié)構(gòu)^［5］。劉正洋等研究認(rèn)為，施用木霉菌生物有機(jī)肥后增加了白菜—甘藍(lán)輪作下土壤微生物豐富度和多樣性，主要是增加了伯克氏菌屬和紅酵母屬等的相對豐度^［6］。郭成瑾等通過高通量測序后發(fā)現(xiàn)，木霉菌、細(xì)菌和放線菌在哈茨木霉協(xié)同小麥秸稈處理后的數(shù)量分別上升了 1 407.27%、75.36%和60.58%^［7］。Umadevi等研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉的施用降低了與致病相關(guān)細(xì)菌的豐度，同時(shí)宏基因組測序結(jié)果顯示，經(jīng)過木霉處理后的土壤中降解雜環(huán)芳香族化合物、苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)及其降解相關(guān)基因有著更高的豐度^［8］，這說明木霉制劑的應(yīng)用可以為植物修復(fù)土壤創(chuàng)造出適合的群落結(jié)構(gòu)。魯海菊等對枇杷根際添加木霉P3.9菌株得到的結(jié)果與上述相似，木霉菌改變了土壤真菌群落豐富度的同時(shí)對根際土壤有一定的修復(fù)作用^［9］。不同木霉對不同植物的根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響存在著一定的差異，但是土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)的改變離不開木霉對植物生長的有益影響^［10］。

近年來，世界上含木霉菌的商業(yè)化生防劑數(shù)量不斷增加，世界各地已經(jīng)注冊了250多種木霉的商業(yè)制劑，其中哈茨木霉SQR-T-037、哈茨木霉SH2303、綠色木霉LTR-2等在土壤改良、植物促生和病害防治方面都具有優(yōu)良的應(yīng)用前景^［11-12］。當(dāng)前木霉制劑主要類型包括可濕性粉劑、顆粒劑、懸乳劑和混配劑等，以新西蘭開發(fā)的Trichodry、Trichoflow等制劑和以色列研發(fā)的哈茨木霉T39發(fā)酵液所制成的Trichodex生防菌劑為代表產(chǎn)品，由木霉分生孢子發(fā)酵物與載體劑均勻混合而制成。懸乳劑是由植物油或礦物油與乳化劑等助劑組成的乳液配制而成，而混配劑是木霉孢子粉與化學(xué)殺菌劑按一定比例，選擇合適載體混合而成^［13］。陳凱等研究表明，木霉重組株L-15和野生株LTR-2所制備的可濕性粉劑對番茄立枯病的防治效果達(dá)到89.27%^［14］。吳曉儒等研究對比不同配方木霉顆粒劑對玉米莖腐病的防效，試驗(yàn)結(jié)果顯示各配方顆粒劑都有較好的生物防治效果及增產(chǎn)作用^［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉、綠色木霉等6種生防菌與化學(xué)農(nóng)藥百菌清進(jìn)行二元混配使用對百合貯存期鱗莖腐爛病防治效果達(dá)61.76%以上，哈茨木霉制劑的研發(fā)有利于減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，維護(hù)土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)條件

試驗(yàn)于2022年3—8月在陜西省咸陽市旬邑縣馬欄煙葉工作站（34.05°～35.22°N，108.44°～110.03°E）進(jìn)行。該地屬于低山丘陵，屬暖溫帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫14.5 ℃，年降水量660～750 mm。試驗(yàn)地前茬為谷子，土壤質(zhì)地為褐土，試驗(yàn)地基礎(chǔ)肥力：速效磷含量為14.38 mg/kg，速效鉀含量為 157.22 mg/kg，速效氮含量為149.87 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為7.87 g/kg，pH值為5.37。試驗(yàn)地施肥情況：復(fù)合肥（N、P2O5、K2O含量分別為10%、12%、18%）300 kg/hm²，硫酸鉀375 kg/hm²，重鈣75 kg/hm²。

1.2"試驗(yàn)材料

供試煙草品種為云煙99。

供試微生物菌劑為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩選的哈茨木霉菌株（Trichoderma harzianum），專利保藏號為CGMCC23294，依據(jù)該菌株研發(fā)的4種不同顆粒劑分別為A劑型以硅藻土為載體與哈茨木霉孢子混合、B劑型以麥飯石為載體與哈茨木霉孢子混合、C劑型以粉碎煙梗-麥飯石為載體與哈茨木霉孢子混合、D劑型以水熱炭-麥飯石為載體與哈茨木霉孢子混合，其活菌數(shù)均為 2×10⁹"CFU/g，隨煙苗移栽時(shí)施入。

1.3"試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置5個(gè)處理（表1），3次重復(fù)，小區(qū)面積300 m²，行距1.2 m，株距 0.55 m，按照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)管理辦法進(jìn)行大田管理。

1.4"樣品采集及測定方法

1.4.1"土壤樣品采集

煙苗移栽45 d后，拔出整株煙根，去除石礫以及動植物殘?bào)w，用刷子小心地把緊貼煙根上的土壤刷下來，收集到無菌塑料離心管中，放于-80 ℃超低溫冰箱中用于高通量測序。

1.4.2"土壤樣品DNA提取和PCR擴(kuò)增

土壤微生物高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。使用美國Omega Bio-Tek公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit（Omega Bio tek，Norcross，GA，USA）試劑盒提取土壤中微生物總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測DNA的提取質(zhì)量，NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度；采用上、下游引物（F：CTTGGSOCATTTAGAGGAAGTAA；R：GCTGCGTSOCTSOCASOCGATGC）對ITS基因ITS1可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增^［16］。

1.4.3"Illumina Miseq測序

把來自同一樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，利用Quantus^TMFluorometer（美國）對回收的產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用Illumina公司的TruSeqNano DNA LT LibraryPrep Kit進(jìn)行建庫，并在Illumina NovaSeq機(jī)器上利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（500 cycles）進(jìn)行2×250 bp的雙端測序。真菌對比數(shù)據(jù)庫為unite_8。數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫^［17］。

1.5"數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2019整理，IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析。方差分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA）法，差異顯著的指標(biāo)用最小顯著差法（LSD）進(jìn)行多重比較分析。使用美吉生物云平臺進(jìn)行聚類分析，使用聯(lián)川云平臺對OTU表進(jìn)行線性判別分析（LEfSe）。采用Canoco 5.0軟件用于冗余分析。將OTU分類表與FUNGuild（真菌）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對以進(jìn)行功能預(yù)測。圖表制作采用Excel 2019和Origin 8.0^［18］。

2"結(jié)果與分析

2.1"土壤真菌α多樣性

由表2可知，真菌群落覆蓋度在所有樣本中均達(dá)到99%，表明本次測序結(jié)果代表真實(shí)情況。與CK相比，所有處理的Simpson指數(shù)均有所降低，最明顯的是T2處理，降幅達(dá)42.86%。T1和T4處理Shannon指數(shù)分別顯著上升14.35%和14.97%，說明不同哈茨木霉制劑對土壤真菌群落均勻性和多樣性有顯著改善，其中T1、T2和T4處理效果顯著。T1及T3處理Chao1指數(shù)較CK分別升高了6.47%和3.17%，而T2和T4處理較CK降低了4.62%和1.09%，表明T1、T3處理有助于土壤真菌豐度，而T2和T4處理土壤真菌豐度有所降低，不同哈茨木霉制劑的施用影響了土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。

2.2"真菌群落組成Venn圖

圖1是不同哈茨木霉制劑對土壤真菌群落組成OTU的Venn分析圖，結(jié)果顯示各處理土壤真菌OTU總數(shù)量為T1gt;T4gt;CKgt;T3gt;T2，T1、T4處理能提高土壤真菌OTU數(shù)量，而T2和T3處理OTU數(shù)量相比CK有所下降。5個(gè)處理OTU總數(shù)量為287，各處理與CK共有OTU數(shù)量為122，占總OTU的42.51%。T1處理后OTU數(shù)量較CK增加最明顯，增加了11.11%，特有OTU個(gè)數(shù)為20，相比CK增加400%，占總OTU的6.97%。T4處理OTU數(shù)量增加了3.86%，特有OTU數(shù)量僅7個(gè)，相比CK增加75%，占總OTU的2.44%。不同哈茨木霉制劑能增加土壤真菌物種數(shù)量，改變其群落結(jié)構(gòu)。根霉屬（Rhizopus）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、蟻巢傘屬（Termitomyces）和腐皮殼菌屬（Valsa）為5個(gè)處理OTU中共有優(yōu)勢菌株。而Dacryopinax屬、嗜藍(lán)孢孔菌屬（Fomitiporia）、共頭霉屬（Syncephalastrum）和Polychaeton屬為不同哈茨木霉制劑處理后土壤共有優(yōu)勢菌株，表明哈茨木霉制劑處理后使土壤中的優(yōu)勢菌種發(fā)生了變化。

2.3"對門水平真菌群落組成和組間差異性的檢驗(yàn)

如圖2-a所示，在門水平土壤真菌主要優(yōu)勢門類為毛霉菌門（Mucoromycota）、子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota），它們的平均豐度占比為98.51%。真菌毛霉菌門（Mucoromycota）相對豐度表現(xiàn)為T2（50.87%）gt;T3（47.58%）gt;CK（46.66%）gt;T1（42.68%）gt;T4（42.57%），T2處理相比CK豐度提高4.21百分點(diǎn)，T1、T4處理分別下降3.98、4.08百分點(diǎn)。子囊菌門（Ascomycota）相對豐度表現(xiàn)為T4（42.77%）gt;T1（41.93%）gt;CK（37.51%）gt;T2（34.29%）gt;T3（33.09%），T1、T4處理提高較明顯，分別提高了5.26、4.42百分點(diǎn)，T2和T3處理下降了3.22、4.42百分點(diǎn)。擔(dān)子菌門（Basidiomycota）相對豐度表現(xiàn)為T3（12.34%）gt;T1（11.36%）gt;CK（10.49%）gt;T4（9.72%）gt;T2（8.59%），與CK相比較，T3處理有所升高，而T2降低最明顯，達(dá)到1.90百分點(diǎn)。油壺菌門（Olpidiomycota）相對豐度則T2、T3處理分別為5.08%和4.58%，T4處理低于CK，為3.28%，而T1處理最低，僅為2.99%。綜上，不同哈茨木霉制劑對主要真菌優(yōu)勢菌門占比影響較大。

如圖2-b所示，對每個(gè)處理間的真菌群落樣本優(yōu)勢菌門進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，各處理在毛霉菌門（Mucoromycota）、子囊菌門（Ascomycota）和油壺菌門（Olpidiomycota）間差異較明顯，且各處理毛霉菌門（Mucoromycota）和子囊菌門（Ascomycota）占比菌超過30%，毛霉菌門（Mucoromycota）和油壺菌門（Olpidiomycota）各處理豐度占比均表現(xiàn)為T2gt;T3gt;CKgt;T4、T1。

2.4"對屬水平真菌群落組成和組間差異性的檢驗(yàn)

如圖3-a所示，屬水平土壤真菌主要優(yōu)勢菌屬為根霉屬（Rhizopus）、球囊霉屬（Glomus）、毛霉屬（Mucor）、Lipomyces屬、鐮刀菌屬（Fusarium）、油壺菌屬（Olpidium），相對豐度均在3%以上，其在各處理中相對豐度分別為53.49%、49.09%、59.87%、46.10%和50.53%，平均達(dá)到51.82%。根霉屬（Rhizopus）相對豐度表現(xiàn)為T2（31.55%）gt;T1（29.65%）gt;CK（28.76%）gt;T3（26.15%）gt;T4（24.59%），與CK相比，T1、T2處理相對豐度明顯升高，分別提高0.89、2.79百分點(diǎn)，T3、T4處理有所降低。球囊霉屬（Glomus）相對豐度表現(xiàn)為T3（9.26%）gt;T4（8.44%）gt;T2（8.41%）gt;CK（6.66%）gt;T1（4.92%），除T1處理豐度下降1.74百分點(diǎn)外，其余各處理均有不同程度升高。T2、T3和T4處理毛霉屬（Mucor）相對豐度分別為5.28%、5.33%和5.55%，與CK（5.32%）數(shù)值接近，而T1處理相對豐度為3.58%，較CK降低1.74百分點(diǎn)。T2、T4處理Lipomyces屬相對豐度為5.08%、4.89%，較CK（4.33%）分別提高了0.75、0.56百分點(diǎn)，T1和T3處理菌有所下降。鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度表現(xiàn)為T1（4.67%）gt;T2（4.47%）gt;CK（4.26%）gt;T4（3.78%）gt;T3（2.45%），T3、T4處理明顯降低了鐮刀菌屬（Fusarium）豐度，同時(shí)T1、T4處理油壺菌屬（Olpidium）豐度也明顯降低。

由圖3-b所示，各處理在鏈格孢屬（Alternaria）、球孢子菌屬（Coccidioides）、Lizonia屬、匍柄霉屬（Stemphylium）、彎孢屬（Curvularia）等菌屬間存在顯著差異。T1和T4處理鏈格孢屬（Alternaria）豐度占比顯著高于其他處理，不同哈茨木霉制劑處理后土壤球孢子菌屬（Coccidioides）T3處理豐度最高，且T3處理Lizonia屬為0，與其他處理呈極顯著差異，T2處理匍柄霉屬（Stemphylium）豐度為0，同時(shí)T3處理豐度僅為0.046%，與其余處理間呈極顯著差異。

2.5"真菌LEfSe多級物種差異判別分析

對土壤真菌從門到屬水平進(jìn)行LEfSe分析和LDA判別，結(jié)果見圖4，設(shè)定LDA閾值為3.0。結(jié)果顯示，CK處理土壤高度富集的微生物為麥角菌科（Clavicipitaceae），T1處理土壤優(yōu)勢菌株為座囊菌綱（Dothideomycetes）、假球殼目（Pleosporales）和孢腔菌科（Pleosporaceae），T2處理土壤中高度富集的微生物有石耳目（Umbilicariales）和Umbilicariaceae科，T3處理土壤中優(yōu)勢菌株為球囊菌綱（Glomeromycetes）、梅奇酵母科（Metschnikowiaceae）、爪甲團(tuán)囊菌科（Onygenaceae）等，而T4處理則為子囊菌門（Ascomycota）、假孢子蟲科（Pseudoperisporiaceae）、地星目（Geastrales）等，不同哈茨木霉制劑處理后土壤主要富集真菌物種不同，說明其對土壤主要真菌群落有較大影響。

3"討論與結(jié)論

不同的哈茨木霉制劑對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯的改變，T2和T3處理真菌群落的多樣性和均勻性有所提高，T1和T3處理的豐富性明顯增加，T1和T4處理的總OTU數(shù)量較對照增加，T2和T3處理略有下降，其中特有OTU數(shù)量最多的是T1處理，明顯高于對照。對門水平上真菌群落組成及差異性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T2處理毛霉菌門豐度較對照明顯增加。毛霉菌是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，其豐度增加有助于土壤蛋白質(zhì)分解，促進(jìn)土壤蛋白質(zhì)循環(huán)^［19］。T1和T4處理土壤優(yōu)勢菌株子囊菌門豐度顯著增加，子囊菌門豐度增加能加快土壤中木質(zhì)化植物殘骸分解，促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化^［20］。各處理間子囊菌門豐度存在顯著差異。對屬水平分析結(jié)果顯示，T2處理根霉屬、球囊霉屬、毛霉屬等有益菌群豐度明顯升高，而T4處理對能引起煙草根腐病的鐮刀菌屬和引致甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒的油壺菌屬豐度較對照顯著降低^［21-22］。不同哈茨木霉制劑菌劑對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響差異較大，能夠提高調(diào)節(jié)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，減少病原菌數(shù)量，降低煙草病害發(fā)生，這與向立剛等研究結(jié)果^［23］一致。各處理在鏈格孢屬、Lizonia屬、匍柄霉屬間呈極顯著差異。對土壤真菌從門到屬水平進(jìn)行LDA判別分析發(fā)現(xiàn)，施用不同哈茨木霉制劑后，土壤主要富集的真菌物種均有不同程度增加，其中T3處理增加最明顯。各處理在屬水平，真菌群落結(jié)構(gòu)受主成分影響，與CK間均存在較大差異。土壤速效磷、速效鉀、堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量在門水平與毛霉菌門和子囊菌門表現(xiàn)出正相關(guān)，在屬水平與毛霉屬、Lipomyces、介球囊霉屬等呈正相關(guān)，大多數(shù)子囊菌門和毛霉菌門多為腐生菌，作為分解者在循環(huán)中扮演著重要角色^［24］。

本研究中真菌群落主要由腐生型營養(yǎng)真菌構(gòu)成，該真菌通過加快土壤中動植物殘?bào)w和動物糞便的分解等，提高土壤養(yǎng)分，促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)一步增強(qiáng)煙株長勢^［25-26］。病原真菌數(shù)量的減少說明哈茨木霉通過自身的生防機(jī)制消滅了一定數(shù)量的病原菌，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，印證了木霉良好的生防效果。

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