抗新型鵝星狀病毒Cap蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

摘要：制備抗新型鵝星狀病毒Cap蛋白的單克隆抗體，為建立基于病毒Cap蛋白的快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建pET-32a-ORF2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21、IPTG誘導(dǎo)，原核表達(dá)出新型鵝星狀病毒Cap蛋白，并對其分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot鑒定。結(jié)果表明，重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)且具有一定的免疫學(xué)活性。以原核表達(dá)的Cap蛋白為免疫原，免疫6～8周齡BALB/c雌性小鼠，對免疫后血清效價為陽性的小鼠取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。做間接ELISA篩選出陽性克隆，并以有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行3次亞克隆，成功篩選出1株分泌抗新型鵝星狀病毒Cap蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1D7，采用腹水法大量制備單克隆抗體，效價可達(dá)1∶64 000。鑒定出1D7的亞型為IgM。1D7分別與重組Cap蛋白和接種新型鵝星狀病毒的LMH細(xì)胞進(jìn)行Western Blot分析，發(fā)現(xiàn)該單抗既能識別重組Cap蛋白又能與新型鵝星狀病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：鵝星狀病毒；Cap蛋白；原核表達(dá)；單克隆抗體

中圖分類號：S852.65⁺7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0204-05

收稿日期：2023-04-22

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（23）3077］；橫向課題“雛鵝痛風(fēng)病因確定和防控方法初探”。

作者簡介：代 格（1997年—），女，河南信陽人，碩士研究生，主要從事禽類重大疫病的診斷與防控。E-mail：daigedg123@163.com。

通信作者：趙冬敏，博士，研究員，研究方向?yàn)榍蓊愔卮笠卟〉脑\斷與防控，E-mail：zhaodongmin126@126.com；薛 峰，博士，教授，研究方向?yàn)槿双F共患病防制新技術(shù)及其病原學(xué)基礎(chǔ)，E-mail：xuefeng@njau.edu.cn。

鵝星狀病毒（goose astrovirus，GoAstV）主要靶器官是腎臟。2014年，Liu等在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了鵝星狀病毒HN1G株^［1］。在此之前，國內(nèi)尚未涉及鵝感染禽星狀病毒的報道^［2］。2016年開始，我國各地陸續(xù)出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀為主的雛鵝疾病^［3］。2016—2017年我國學(xué)術(shù)界逐漸從痛風(fēng)雛鵝體內(nèi)分離到鵝星狀病毒，目前已在全國多地流行。

星狀病毒是正鏈單股RNA病毒、無囊膜，因呈現(xiàn)星狀結(jié)構(gòu)得名，直徑一般為28～30 nm，呈二十面體對稱，基因組全長依種屬差異而有所不同。鵝星狀病毒基因組包括2個非編碼區(qū)：5′UTR、3′UTR；3個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）：ORF1a、ORF1b和ORF2；以及1個poly-A尾^［4］。其中，ORF2負(fù)責(zé)編碼的是星狀病毒唯一的衣殼蛋白（capsid protein，Cap）^［5］。

Cap蛋白（VP90）主要負(fù)責(zé)病毒顆粒的組裝。在細(xì)胞內(nèi)，VP90的C末端被水解，生成大小約 70 ku 的VP70。胰蛋白酶再將VP70進(jìn)一步剪切為VP34、VP27、VP25^［6］。核衣殼的殼體結(jié)構(gòu)由VP34折疊構(gòu)成，衣殼表面的纖突由VP27、VP25共同構(gòu)成，其中，VP27與殼體連接緊密與殼體蛋白VP34共同決定病毒的感染能力^［7］。衣殼蛋白既能作為星狀病毒的結(jié)構(gòu)屏障，又介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞激發(fā)免疫應(yīng)答^［8］。

目前，鵝星狀病毒感染對我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大危害^［9］，診斷是防控該病的重要手段。本研究以原核表達(dá)的新型鵝星狀病毒Cap蛋白為免疫原，免疫6～8周齡BALB/c雌性小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合和連續(xù)3次亞克隆，成功制備出相應(yīng)的單克隆抗體，為進(jìn)一步建立快速準(zhǔn)確診斷新型鵝星狀病毒的診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和實(shí)驗(yàn)動物

鵝星狀病毒毒株、雞肝癌細(xì)胞（LMH）、重組質(zhì)粒pET-32a-Cap均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。6～8周齡BALB/c小鼠，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 主要試劑

His-tag單抗，購自碧云天生物公司；DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，購自TaKaRa公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，購自中杉金橋；PVDF膜，購自Immobilon有限公司；HT、HAT以及弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑，購自SIGMA公司。

1.3 重組Cap蛋白的表達(dá)與鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-Cap轉(zhuǎn)化BL21，獲得的陽性菌液1∶100接種氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)至D_{600 nm} 值為0.6～0.8，加入1∶1 000的IPTG 37 ℃、120 r/min誘導(dǎo)表達(dá) 5 h，收集菌體。菌體反復(fù)凍融3次后，采用1×PBS重懸，冰上超聲破碎。離心分離上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.4 小鼠免疫

以原核表達(dá)的鵝星狀病毒Cap蛋白作為免疫原，100 μg/只；與弗氏完全佐劑等體積混合并乳化后，分多點(diǎn)皮下注射6～8周齡BALB/c小鼠，0.2 mL/只。每隔2周，皮下多點(diǎn)注射相同劑量的弗氏不完全佐劑乳化的免疫原。第3次免疫10 d后，尾尖采集少量血液，取血清，利用間接ELISA檢測免疫小鼠血清效價，并于融合前3 d再次加強(qiáng)免疫。

1.5 免疫小鼠血清效價ELISA檢測

原核表達(dá)的Cap蛋白用0.05 mol/L碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH值9.6）稀釋至2 μg/mL，4 ℃過夜，包被于酶標(biāo)板。隔天PBST洗滌3次。加入5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h。小鼠血清由1∶200倍比稀釋至1∶204 800作為一抗，同時設(shè)立空白老鼠血清陰性對照、PBST空白對照，37 ℃孵育 60 min。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）作為二抗，37 ℃孵育60 min；顯色、終止后讀取D_{450 nm}值，P/Ngt;2.1 可判定為陽性。

1.6 細(xì)胞融合與篩選

無菌取免疫效價達(dá)到1∶102 400的小鼠的脾臟，制備單細(xì)胞懸液，與SP2/0進(jìn)行融合。以重組GoAstV Cap蛋白為篩選抗原，做間接ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測結(jié)果為陽性的上清。以同樣為pET-32a載體的重組禽流感NS1蛋白為對照抗原，利用間接ELISA對上述陽性上清進(jìn)行篩選。選取前者陽性值高后者為陰性的細(xì)胞株，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。經(jīng)3次亞克隆后，擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的陽性細(xì)胞株。

1.7 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性檢測

將雜交瘤細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)20代，分別取其第5、10、15、20代細(xì)胞上清測定效價。

1.8 單克隆抗體腹水的制備

將無菌液體石蠟注入8周齡BALB/c 小鼠腹腔。1周后，再將陽性雜交瘤細(xì)胞5×10⁵個/只注入小鼠腹腔，待小鼠腹部明顯腫大時抽取腹水。收集的腹水8 000 r/min離心10 min，去除上層的油脂和沉淀，吸取中間清亮液體。

1.9 單克隆抗體效價的測定

原核表達(dá)的Cap蛋白用包被液稀釋至 2 μg/mL，4 ℃過夜包被于酶標(biāo)板，封閉，收取的小鼠腹水1∶200、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000 倍比稀釋作為一抗孵育于酶標(biāo)板，同時設(shè)立陰性和空白對照。二抗孵育、顯色、終止后，讀取D_{450 nm}值，并計(jì)算P/N值。

1.10 單克隆抗體亞類鑒定

采用Sino Biological公司試劑盒對單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。使用PBS緩沖液將試劑盒中的IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3亞型的捕獲抗體分別做1∶200稀釋后，100 μL/孔，孵育于酶標(biāo)板。陽性雜交瘤培養(yǎng)上清為一抗，試劑盒中陽性對照試劑用PBS 1∶200稀釋，陰性對照為SP2/0上清。其他步驟與普通的間接ELISA相同。

1.11 單克隆抗體特異性鑒定

將鵝細(xì)小病毒、禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨坦布蘇病毒分別包被于酶標(biāo)板，以雜交瘤培養(yǎng)上清為一抗，做ELISA檢測單抗特異性。

1.12 單克隆抗體Western Blot鑒定

1.12.1 單抗與重組Cap蛋白的Western Blot分析

原核表達(dá)的Cap蛋白適量稀釋，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，同時設(shè)立pET-28a空載體蛋白對照。以制備的單抗腹水為一抗（1∶500），HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgM為二抗（1∶10 000），進(jìn)行Western Blot分析。

1.12.2 單抗與鵝星狀病毒的Western Blot分析

將LMH細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板，長至單層后換上維持液，以1∶1 000接種筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的鵝星狀病毒。同時設(shè)立未接毒細(xì)胞對照。培養(yǎng)48 h后吹下細(xì)胞，用裂解液充分裂解，離心取上清，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜。4 ℃封閉過夜，以制備的單抗腹水為一抗（1∶500），同樣的方法進(jìn)行單克隆抗體Western Blot鑒定。

1.13 單抗中和試驗(yàn)

細(xì)胞瓶中培養(yǎng)的LMH細(xì)胞吹成細(xì)胞懸液均勻鋪在96孔細(xì)胞板上。待LMH細(xì)胞長至單層，將單抗腹水用維持液作1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀釋，與等體積新型鵝星狀病毒細(xì)胞毒（200 TCID₅₀）振蕩混勻，37 ℃孵育1 h。分別加入長至單層的LMH細(xì)胞中，同時設(shè)置不接種病毒的空白對照和不與抗體孵育的接毒對照。放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，倒出上清，加入-20 ℃預(yù)冷的細(xì)胞固定液（甲醇∶丙酮=1∶1），常溫固定30 min。陰性孔中加入1∶500稀釋的空白小鼠血清，空白、待檢和陽性孔中均加入1∶500稀釋的鵝星狀病毒Cap蛋白免疫的陽性小鼠血清，37 ℃孵育1 h。以Aloxa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗（1∶500），37 ℃，孵育 1 h。熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.14 單抗在鵝星狀病毒免疫組化分析中的應(yīng)用

28羽1日齡雛鵝隨機(jī)分為2組，14 羽/組。第1組為對照組，接種PBS，第2組頸部皮下接種鵝星狀病毒，劑量為105.6 TCID₅₀，取死亡雛鵝腎臟制作組織切片，利用單抗1D7進(jìn)行免疫組化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Cap蛋白的表達(dá)與鑒定

收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體后超聲波裂解，SDS-PAGE電泳分別分析破碎上清、沉淀。由圖1可知，Cap蛋白以包涵體形式表達(dá)，并在110 ku處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期相符。將包涵體洗滌3次，采用8 mol/L尿素溶解后，采用IMPLEN超微量分光光度計(jì)測定蛋白濃度為2 mg/mL。

2.2 小鼠血清免疫效價的測定

利用重組Cap蛋白免疫小鼠，三免后10 d采集血清，測定小鼠血清效價，結(jié)果顯示，4只免疫小鼠效價均已達(dá)到1∶102 400。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立

取效價最高的免疫小鼠，無菌采集脾臟制備單細(xì)胞懸液，與對數(shù)生長期的SP2/0進(jìn)行融合，通過間接ELISA篩選到1株針對Cap蛋白的雜交瘤細(xì)胞，命名為1D7。對1D7按有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，連續(xù)3次亞克隆后獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

2.4 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性

利用間接ELISA檢測5、10、15、20代雜交瘤細(xì)胞上清。由表1可知，效價均不低于1∶160，對照蛋白ELISA效價均為陰性，表明1D7分泌單克隆抗體穩(wěn)定。

2.5 單克隆抗體腹水的制備與效價測定

待小鼠腹部膨大時采集腹水，采集3次后對小鼠施行安樂死。將3次采集的腹水混合后，利用間接ELISA進(jìn)行效價測定，結(jié)果表明腹水效價達(dá) 1∶64 000，對照蛋白ELISA為陰性。

2.6 單克隆抗體亞類鑒定

采用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒，對1D7分泌的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。由圖2可知，該單克隆抗體重鏈為IgM亞型，輕鏈為κ型。

2.7 單克隆抗體特異性鑒定

由間接ELISA結(jié)果（表2）可知，1D7細(xì)胞株培養(yǎng)上清僅與鵝星狀病毒呈陽性反應(yīng)，與鵝細(xì)小病毒、禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨坦布蘇病毒均不發(fā)生反應(yīng)，說明該單克隆抗體能特異性識別GoAstV。

2.8 單克隆抗體Western Blot鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證1D7的特異性，分別用重組Cap蛋白和接種鵝星狀病毒的LMH細(xì)胞進(jìn)行Western Blot分析。由圖3、圖4可知，單克隆抗體1D7可與重組蛋白發(fā)生反應(yīng)， 并且能夠識別新型鵝星狀病毒感染細(xì)胞中Cap蛋白前體VP90和VP70，說明1D7是具有良好Western Blot反應(yīng)性的單克隆抗體。

2.9 單抗中和試驗(yàn)

鵝星狀病毒細(xì)胞毒與不同稀釋度的單抗腹水孵育后，再用于感染LMH細(xì)胞。通過IFA觀察鵝星狀病毒對LMH細(xì)胞的感染情況，由圖5可知，隨著與病毒孵育的腹水濃度的提高，熒光數(shù)量逐漸減少，說明該單抗對新型鵝星狀病毒具有一定的中和作用。

2.10 免疫組化檢測結(jié)果

由死亡雛鵝組織切片的免疫組化（圖6）可知，攻毒組雛鵝腎臟有不同程度地陽性表達(dá)。腎臟的腎小管、集合管及腎小體內(nèi)均可見棕黃色陽性表達(dá)，集合管上皮細(xì)胞、近端小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核以及腎小體內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞核呈強(qiáng)陽性，遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核及胞漿呈弱陽性；而PBS對照組腎臟未見明顯陽性。

3 討論與結(jié)論

鵝星狀病毒感染是近年來新發(fā)的一種禽類傳染病，該病毒主要感染2～25日齡雛鵝，15日齡以內(nèi)雛鵝最易感，死亡率一般為15%～36%，最高可達(dá)50%^［10］。對我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了極大危害，診斷是防控該病的有效手段之一。目前，除傳統(tǒng)診斷方法外，也建立了一些針對鵝星狀病毒的分子生物學(xué)診斷方法。這些方法雖準(zhǔn)確、可靠，但所需時間長、成本較高，不能滿足臨床快速診斷的需要，但目前還沒有開發(fā)出有關(guān)鵝星狀病毒的快速診斷試劑。

星狀病毒單克隆抗體的制備在其他禽類上已取得了一定的進(jìn)展。趙偉在昆蟲細(xì)胞中原核表達(dá)雞星狀病毒衣殼蛋白，并以此為免疫原免疫BABL/c小鼠，成功篩選出針對CAstV-Cap蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株^［11］。楊彬彬以DAstV C－NGB株為免疫原，采用ORF2重組蛋白作為抗原進(jìn)行篩選，獲得7 株穩(wěn)定分泌抗 DAstV ORF2蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞^［12］。鵝星狀病毒作為一種近年來新發(fā)的病毒，有關(guān)防控與診斷方法的研究還較少，目前關(guān)于鵝星狀病毒單克隆抗體制備的報道也很少，有待進(jìn)一步研究。

本研究以原核表達(dá)的鵝星狀病毒Cap蛋白免疫6～8周齡BALB/c小鼠，經(jīng)過一定的免疫程序后，小鼠血清抗體效價達(dá)到1∶102 400，說明原核表達(dá)的Cap蛋白具有良好的免疫原性。將陽性小鼠脾臟制成脾細(xì)胞懸液，經(jīng)融合、篩選和3次亞克隆后成功篩選到1株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1D7。經(jīng)鑒定該單克隆抗體可與GoAstV發(fā)生Western Blot反應(yīng)，后續(xù)可以利用該單克隆抗體建立針對GoAstV的快速診斷方法。

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