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    抗Cetuximab單克隆抗體制備及其雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

    2016-04-25 15:56:49王銳張道旭張雪亭梁秋波李鄭武
    中國科技博覽 2016年1期
    關(guān)鍵詞:單克隆抗體

    王銳 張道旭 張雪亭 梁秋波 李鄭武

    [摘 要]本研究利用Cetuximab 3次腹腔免疫6-8周齡BALB/c雌性小鼠。通過雜交瘤技術(shù)、間接ELISA 篩選技術(shù)及腹水制備等技術(shù)制備并獲得抗Cetuximab單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過細(xì)胞融合成功得到三株能穩(wěn)定分泌抗Cetuximab單抗的雜交瘤細(xì)胞株4C5、1F8和4B12,制備的腹水單克隆抗體純化后效價為10-6以上,三株抗體重鏈均為IgG1亞類,輕鏈類型均為k鏈。利用制備的單克隆抗體(Mab)建立Cetuximab單抗雙抗體夾心ELISA檢測方法,試驗(yàn)結(jié)果顯示,該檢測方法特異性良好,不與其他抗體及蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

    [關(guān)鍵詞]Cetuximab 單克隆抗體 雙抗體夾心ELISA

    中圖分類號:TM121.1.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B 文章編號:1009-914X(2016)01-0017-01

    Cetuximab是治療結(jié)直腸癌的一種治療性生物制品,其能夠與 EGFR 的內(nèi)源性配體EGF、TGF-α 競爭性地與EGFR 胞外配體區(qū)結(jié)合,抑制EGFR自身磷酸化,阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制生長因子激活細(xì)胞有絲分裂信號的下傳,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,且與抗腫瘤藥物合用具有協(xié)同作用。抗Cetuximab單克隆抗體的制備和其雙抗體檢測方法的建立為開展Cetuximab藥物代謝動力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

    1、材料

    佐劑購自SIGMA公司;西妥西單抗由哈藥集團(tuán)技術(shù)中心制備;6~8周齡Balb/c小鼠購自北京實(shí)驗(yàn)動物研究中心;SP2/0細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

    2、方法

    2.1 單克隆抗體的制備

    用純化的Cetuximab按照薩姆布魯克J等[1]報道的方法免疫5只Balb/c小鼠,經(jīng)過3次基礎(chǔ)免疫,選取效價最高(≥10000)的小鼠進(jìn)行強(qiáng)化免疫。3~4天后利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合,陽性雜交瘤篩選經(jīng)過3次克隆,挑選獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆建庫,陽性克隆細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后注射Balb/c小鼠腹腔內(nèi)誘生腹水,利用親和層析方法純化所得的小鼠腹水,進(jìn)行SDS-PAGE 純度鑒定和間接ELISA 測定抗體效價。

    2.2 雙抗體夾心ELISA檢測方法建立

    2.2.1 雙抗體夾心ELISA最佳反應(yīng)條件確定:參考李瑞等( 2005) 、焦奎等( 2004) 方法。

    2.2.2 雙抗體夾心ELISA方法特異性:按上述ELISA方法對鼠血清、人血清、猴血清、曲妥珠單抗及西妥昔單抗進(jìn)行檢測,以檢驗(yàn)該方法的特異性。

    2.2.3 雙抗體夾心ELISA方法的靈敏度:將濃度為4ug/mL的Cetuximab連續(xù)作4倍梯度稀釋,然后按照確定的ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行測定。根據(jù)P/N值大于2.1,陽性值大于0.2,檢驗(yàn)該方法的靈敏性。

    3、結(jié)果與分析

    3.1 單抗制備:通過Balb/c小鼠免疫、細(xì)胞融合、間接ELISA 篩選及細(xì)胞株克隆篩選獲得3株穩(wěn)定分泌Cetuximab單抗的雜交瘤細(xì)胞株4B12、1F8和4C5。用體內(nèi)誘生腹水法分別制備4B12、1F8和4C5三株雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗體,電泳純度均在95%以上(電泳結(jié)果見圖1)。純化后腹水抗體效價為10-6以上??贵w亞類鑒定結(jié)果顯示,所得的單克隆抗體重鏈為IgG1亞類,輕鏈為k鏈??贵w特異性鑒定結(jié)果顯示,抗體均能與市售西妥西單抗發(fā)生高親和力結(jié)合,但不與鼠IgG1和人IgG1發(fā)生交叉反應(yīng),說明其具有較好的特異性。

    3.2 Cetuximab單抗雙抗體夾心ELISA方法的確定

    3.2.1 包被:用碳酸鹽包被液稀釋純化的Cetuximab單抗至濃度1μg/mL,加入96孔酶標(biāo)板,每孔100 μL,4℃包被過夜;

    3.2.2 封閉:用PBST洗滌3次,拍干后,每孔加入300 μl 5%脫脂奶粉,37 ℃封閉1 h;

    3.2.3 一抗?jié)舛龋篜BST洗滌3次,拍干后,將待檢樣品進(jìn)行1:1000倍稀釋,Cetuximab標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行4倍稀釋(4000~1ng),每孔加入100 μL,37℃孵育1h;

    3.2.4 酶標(biāo)二抗:將HRP標(biāo)記羊抗人IgG-Fc抗體1:5000稀釋,每孔加入100 μL,37℃孵育1h;

    3.2.5 顯色時間:PBST 洗滌3次,拍干,加入底物液(OPD),室溫避光作用10min;

    3.2.6 終止:每孔加入50 μL終止液(2M H2SO4),輕輕振搖混勻,測定OD492 值。

    3.3雙抗體夾心ELISA檢測方法特異性的鑒定

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,檢測樣品中只有市售西妥西單抗出現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng),其他均為陰性,表明此方法特異性較好。結(jié)果見表1。

    3.4 雙抗體夾心ELISA 方法靈敏度的測定

    將純化抗原的濃度稀釋到4ug/mL,之后連續(xù)作4倍梯度稀釋,按照確定的ELISA 反應(yīng)條件進(jìn)行測定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法能檢測出約0.89ng / mL 的抗體樣本,顯示出良好的靈敏度。

    4、討論

    ELISA 檢測方法常受到反應(yīng)溫度、pH、時間、酶標(biāo)板的質(zhì)量等多種因素影響,因此有關(guān)ELISA 的各種條件都需要進(jìn)行優(yōu)化。本研究對所建立的ELISA方法的各步緩沖液系統(tǒng)、溶液濃度、孵育時間等條件進(jìn)行了摸索, 并最終確立反應(yīng)條件。經(jīng)驗(yàn)證,所建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法具有良好的靈敏性和特異性,為西妥西單抗的藥代動力學(xué)分析提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 薩姆布魯克 J,拉塞爾 DW(黃培堂,等譯).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京:科學(xué)出版社,2002,

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