抗菌肽PAJE 對(duì)金黃色葡萄球菌及其SCVs 的殺菌作用機(jī)制研究

高思琦　楊新建　朱德琪　關(guān)明瑋　寇云婷　滿程　焦健

摘要：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及其小菌落突變體（small colony variants，SCVs）感染是影響畜禽健康的主要問(wèn)題。然而，傳統(tǒng)抗生素治療面臨持續(xù)和復(fù)發(fā)性感染以及耐藥性等許多挑戰(zhàn)。抗菌肽PAJE具有廣譜抗菌性，為深入探究抗菌肽PAJE的生物學(xué)特性及其對(duì)S. aureus 和SCVs殺菌作用機(jī)制，對(duì)其抗菌活性、穩(wěn)定性、生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，抗菌肽PAJE對(duì)S. aureus 和SCVs細(xì)胞膜滲透力達(dá)54.7%和62.9%，同時(shí)通過(guò)上調(diào)Agr調(diào)控系統(tǒng)、下調(diào)SigB調(diào)控系統(tǒng)及生物膜相關(guān)基因的表達(dá)，從而極大程度地抑制生物膜形成。此外，較高溫度及pH穩(wěn)定性為抗菌肽PAJE提供了更好的加工、存儲(chǔ)和環(huán)境耐受性。綜上所述，抗菌肽PAJE可作為治療S. aureus和SCVs及其生物膜感染的潛在候選肽之一，為替抗減抗類(lèi)產(chǎn)品研發(fā)提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；小菌落突變體；抗菌肽PAJE；生物膜

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0878

中圖分類(lèi)號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）05015611

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見(jiàn)的人畜共患菌，在畜牧業(yè)中可引發(fā)奶牛乳房炎[12]、禽類(lèi)腹膜炎等疾病[3]，降低牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量，影響乳制品生產(chǎn)[4]，造成禽類(lèi)胃腸穿孔[5]，給畜牧業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該菌感染以萬(wàn)古霉素（vancomycin，Van）和阿莫西林等抗生素治療為主[67]，但在抗生素使用過(guò)程中，S. aureus 形成生物膜的能力增強(qiáng)，促進(jìn)其定殖于上皮細(xì)胞，免疫防御逃避能力增加，致使復(fù)發(fā)或持續(xù)感染[8]。部分逃逸的S. aureus 還會(huì)發(fā)生代謝途徑的改變，生成更難清除的小菌落突變體（small colonyvariants，SCVs）[9]。與S. aureus 相比，SCVs形成生物膜的能力增強(qiáng)[6]，增加了免疫耐受能力[10]。多種抗生素聯(lián)合用藥治療S. aureus 及SCVs感染[11]，極大程度上加重了生物膜的形成，致使多種耐藥性菌株出現(xiàn)，誘發(fā)持續(xù)性、復(fù)發(fā)性感染[12]，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的損失。

生物膜由胞外聚合物組成，有生物膜包裹的細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的耐受性是相應(yīng)浮游細(xì)胞的100～1 000倍[13]。慶大霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的SCVs形成生物膜的能力是S. aureus 的2倍[6]。持續(xù)使用抗生素或低抗生素劑量下，除出現(xiàn)抗生素修飾酶、細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的改變和外排泵等經(jīng)典的耐藥性機(jī)制外[14]，還可誘導(dǎo)SigB及Agr調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而增強(qiáng)其生物膜形成能力。SigB調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)基因上調(diào)，在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)了S. aureus 及SCVs產(chǎn)生物膜的能力[15]。Agr調(diào)控系統(tǒng)作為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)中極具代表性的調(diào)控因子，主要對(duì)生物膜的解離與分散進(jìn)行調(diào)控，當(dāng)Agr調(diào)控系統(tǒng)表達(dá)水平降低或agr基因缺失時(shí)更易出現(xiàn)局部慢性感染[16]。但由于調(diào)控方式多樣，不同的過(guò)程會(huì)出現(xiàn)相互矛盾的情況[17]，使生物膜出現(xiàn)多種變型，但都與生物膜形成能力的增強(qiáng)有關(guān)。因此，利用傳統(tǒng)抗生素對(duì)生物膜治療仍存在許多挑戰(zhàn)，亟需開(kāi)發(fā)新型有效藥物來(lái)治療S. aureus及SCVs生物膜感染。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一種具有多種作用模式的生物活性藥物，作為新型抗生物膜制劑應(yīng)用于感染治療，是非常有前途的抗菌候選藥物之一[1819]?？咕牟粌H能在細(xì)菌生物膜形成早期進(jìn)行干擾，防止細(xì)菌最初的粘附，還能通過(guò)促使微生物細(xì)胞脫離或殺死微生物細(xì)胞來(lái)破壞成熟的生物膜[20-22]。其殺菌模式是通過(guò)膜活性機(jī)制來(lái)抑制或消除病原微生物，而不是通過(guò)特異性位點(diǎn)結(jié)合或干擾細(xì)菌代謝[23]，極大程度上克服了傳統(tǒng)抗菌藥物的耐藥性問(wèn)題，成為一種有前途的抗生素替代品[24]。PAJE作為一種雜合肽，是將鳳蝶毒素的7 個(gè)氨基酸（RWKIFKK-NH2）與蜂王漿抗菌肽Jelleine-1 的8 個(gè)氨基酸（PFKISIHLNH2）進(jìn)行合成，雜合抗菌肽PAJE 對(duì)S. aureusKACC 10196 顯示出較強(qiáng)的抑菌活性，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為4 μmol·L?1[25]，本研究室通過(guò)抑菌試驗(yàn)初步驗(yàn)證其對(duì)S.aureus 及SCVs具有較好的抑菌活性，但作用機(jī)理尚不明確。為探究抗菌肽PAJE對(duì)S. aureus及SCVs的殺菌作用機(jī)理，本研究對(duì)其抗菌活性、穩(wěn)定性、生物學(xué)特性和作用機(jī)理進(jìn)行探討，為進(jìn)一步探究高效、安全、穩(wěn)定可抑制S. aureus 及SCVs的抗菌肽提供研究思路并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的菌株為S. aureus ATCC43300 與SCVs，其中S. aureus ATCC43300購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection）；SCVs由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。

TSA（tryptic soy agar）與TSB（tryptic soy broth）培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）用于S. aureus 和SCVs 生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。

抗菌肽PAJE由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，序列為RWKIFKKPFKISIHL-NH2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)菌株的培養(yǎng)與制備

將活化后的S. aureus 和SCVs按1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接至10 mL TSB培養(yǎng)基中，SCVs組需加入500 μL的慶大霉素（終質(zhì)量濃度5 μg·mL?1），置于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩（300 r·min?1）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（5×108CFU·mL?1）。

1.2.2 溶血性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[26]的方法，靜脈取血后收集于肝素鈉抗凝管，用0.9%生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，至上清液無(wú)色透明，制成8%（體積分?jǐn)?shù)）的紅細(xì)胞懸浮液。利用二倍梯度稀釋法將PAJE 稀釋至64、32、16、8、4、2 μg·mL?1。分別取50 μL 8%的紅細(xì)胞懸浮液和50 μL不同質(zhì)量濃度（64、32、16、8、4、2 μg·mL?1）的抗菌肽溶液至1.5 mL 離心管中，設(shè)置3組平行，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置孵育1 h，2 000 r·min?1 離心5 min，取100 μL上層清液置于96孔板中，使用酶標(biāo)儀在540 nm 處測(cè)量紫外吸光值。并以生理鹽水和0.1% Triton X-100紫外吸光值分別為0%和100%溶血對(duì)照。按照如下公式計(jì)算溶血度（%）。

1.2.3 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]的方法測(cè)定S. aureus 和SCVs的最小抑菌濃度（MIC）。首先，采用96孔板進(jìn)行試驗(yàn)，利用二倍梯度稀釋法將抗菌肽PAJE用生理鹽水稀釋至8、16、32、64 μg·mL?1；分別加入90 μL用TSB培養(yǎng)基稀釋至1×105 CFU·mL?1的S. aureus 和SCVs，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h，測(cè)定PAJE 對(duì)S. aureus 和SCVs的MIC。陰性對(duì)照組（萬(wàn)古霉素）和空白對(duì)照組（ddH2O）做相同處理，每組3 次重復(fù)?；贛IC試驗(yàn)結(jié)果，從上述有抑菌效果的孔中取100 μL培養(yǎng)物涂布于TSA平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)一步測(cè)定S. aureus 和SCVs的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration， MBC）。

1.2.4 抗菌肽PAJE穩(wěn)定性測(cè)定

抗菌肽PAJE穩(wěn)定性測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[27]?；罨疭CVs至對(duì)數(shù)期（OD600=0.37）、S. aureus 至對(duì)數(shù)期（OD600=1）后將菌液稀釋至1×105 CFU·mL?1。

將1 280 μg·mL?1的抗菌肽PAJE在不同溫度（40、60、80、100 ℃）孵育1 h、不同pH（pH=2、4、7、8、10）孵育4 h、3 000 U·mg?1胃蛋白酶和250 U·mg?1胰蛋白酶條件下分別孵育4 h，用生理鹽水將處理好的抗菌肽分別稀釋至128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg·mL?1。取不同試驗(yàn)組抗菌肽10和90 μL稀釋菌液混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，利用酶標(biāo)儀在600 nm 處測(cè)定抗菌肽PAJE 穩(wěn)定性。對(duì)照組為菌液、未處理組和各緩沖液（pH 2的甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH 4 的醋酸鈉緩沖液、pH 6的磷酸鈉緩沖液、pH 8的Tris-鹽酸緩沖液、pH 10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、250 U·mg?1胰蛋白酶溶液、3 000 U·mg?1 胃蛋白酶溶液和生理鹽水）。

1.2.5 抗菌肽PAJE 殺菌動(dòng)力學(xué)測(cè)定

抗菌肽PAJE 殺菌動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[28]。將S. aureus 和SCVs稀釋至1×105 CFU·mL?1。分別加入1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC 的抗菌肽PAJE作為試驗(yàn)組，加入2×MIC 的萬(wàn)古霉素為陽(yáng)性對(duì)照，未處理組為空白對(duì)照。將上述菌液置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，于0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和24.0 h分別取樣，10倍梯度稀釋后取10 μL菌液，利用流淚法將菌液滴至TSA固體培養(yǎng)基上。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。

1.2.6 抗菌肽PAJE對(duì)S. aureus 和SCVs生物膜抑制能力測(cè)定

利用結(jié)晶紫染色法[29]測(cè)定生物膜。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的S. aureus 和SCVs用TSB梯度稀釋至1×108 CFU·mL?1，每孔180 μL菌液和20 μL的1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC抗菌肽PAJE接種于96孔板中，作為試驗(yàn)組。TSB培養(yǎng)基加水為空白對(duì)照，菌液加水為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h。將每孔的上清液用移液槍小心吸棄，PBS溶液將剩余菌液清洗3次，自然晾干后向每孔中加入100 μL的2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛固定，90 min后吸棄固定液，PBS清洗2次；再向每孔中加入100 μL 0.1%的結(jié)晶紫溶液染色15 min，用蒸餾水沖洗掉多余染液，置于室溫干燥；最后向每孔中加入200 μL 95%乙醇溶解30 min，用酶標(biāo)儀在502 nm處測(cè)量吸光值。

1.2.7 抗菌肽PAJE對(duì)S. aureus 與SCVs相關(guān)基因表達(dá)

S. aureus 與SCVs 相關(guān)特性基因表達(dá)的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[30]。挑取活化后的S. aureus 和SCVs 單菌落于TSB 及含5 μg·mL-1 慶大霉素的TSB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，1%轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，并稀釋到1×108 CFU·mL?1，與2×MIC抗菌肽PAJE共培養(yǎng)2 h后，按RNAprep Pure細(xì)菌總 RNA 提取試劑盒（DP430）說(shuō)明書(shū)提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 作為熒光定量的模板，按ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用2-△△ CT法[31]，以PAJE處理組與未處理S. aureus 和SCVs作比較，對(duì)Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)及生物膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，>1為上調(diào)，<1為下調(diào)。引物如表1所示。

1.2.8 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察方法參考文獻(xiàn)[33]。用0.01 mol·L?1 PBS（pH 7.4）將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S. aureus 和SCVs稀釋至1×108 CFU·mL?1，加入抗菌肽至菌懸液終質(zhì)量濃度為4×MIC，37 ℃靜置孵育2 h。置于室溫下4 000 r·min?1 離心5 min，用PBS清洗菌體3次，于2.5％的戊二醛緩沖液（用0.01 mol·L?1 PBS 配置）、4 ℃過(guò)夜固定。用PBS洗滌菌體5次，每次7 min，加入1％的鋨酸緩沖液固定1 h。再用PBS洗滌菌體3次，用乙醇（50%?70%?85%?95%×2?100%×2）梯度脫水，每次15 min，使用臨界點(diǎn)干燥儀對(duì)樣品進(jìn)行干燥，用離子濺射儀使樣品表面形成一層金屬膜后，用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.9 抗菌肽PAJE對(duì)S. aureus 和SCVs細(xì)胞膜的作用

抗菌肽PAJE對(duì)S. aureus 和SCVs細(xì)胞膜的作用的測(cè)定參照文獻(xiàn)[34]。取S. aureus 和SCVs單菌落于培養(yǎng)基中過(guò)夜活化后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，4 000 r·min?1 離心5 min，棄上清，用0.01 mol·L?1PBS（pH 7.4）洗滌3 次，并用相同溶液稀釋成1×108 CFU·mL?1的菌懸液。取450 μL上述菌懸液加入50 μL 10×MIC 抗菌肽，使其終質(zhì)量濃度為1×MIC。置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱分別孵育30 和120 min，孵育結(jié)束后4 000 r·min?1 離心5 min，用0.01 mol·L?1 PBS緩沖液洗滌2次。上機(jī)前再加入0.5 mg·mL?1 PI（propidium iodide）染液至終質(zhì)量濃度為50 μg·mL?1，室溫下靜置孵育15 min，上流式細(xì)胞儀FACS-Calibur 記錄被PI 著染的陽(yáng)性細(xì)菌數(shù)，陰性對(duì)照組（無(wú)抗菌肽，0.01 mol·L?1 PBS緩沖液）做相同處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽PAJE 生物學(xué)特性分析

2.1.1 溶血性

溶血性和細(xì)胞毒性主要用來(lái)評(píng)價(jià)抗菌肽是否適宜靜脈注射以及對(duì)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞的損傷。由圖1可知，溶血度隨抗菌肽PAJE質(zhì)量濃度的降低而下降，且當(dāng)抗菌肽PAJE為32 μg·mL?1及以下時(shí)，溶血度低于5%，此時(shí)，抗菌肽PAJE的安全性較好。

2.1.2 抗菌肽PAJE對(duì)SCVs的MIC和MBC

如表2所示，抗菌肽PAJE對(duì)S. aureus 的MIC為8 μg·mL?1，MBC為16 μg·mL?1；對(duì)SCVs的MIC為16 μg·mL?1，MBC為32 μg·mL?1。

2.1.3 抗菌肽PAJE 穩(wěn)定性

通過(guò)測(cè)定溫度、pH和酶的穩(wěn)定性，研究抗菌肽PAJE在不同環(huán)境中的耐受性，結(jié)果（圖2）表明，胃蛋白酶及胰蛋白酶對(duì)抗菌肽PAJE的抑菌能力影響較大，經(jīng)胃蛋白酶處理后對(duì)S. aureus 和SCVs 的抗菌活性分別下降93.75%和87.50%，經(jīng)胰蛋白酶處理后對(duì)S. aureus和SCVs的抗菌活性均下降75.00%；pH對(duì)抗菌肽PAJE抑菌能力影響較小，僅在pH 2時(shí)對(duì)S.aureus的抗菌活性降低50.00%；溫度對(duì)抗菌肽PAJE 抑菌能力影響也較小，僅在100 ℃時(shí)對(duì)S. aureus 和SCVs的抗菌活性降至80%。由此表明，當(dāng)溫度≥100 ℃及在胰蛋白酶和胃蛋白酶的作用下會(huì)影響抗菌肽PAJE的抑菌活性；或pH≤2時(shí)會(huì)影響抗菌肽PAJE對(duì)S.aureus 的抑菌活性。

2.2 抗菌肽PAJE 殺菌動(dòng)力學(xué)分析

通過(guò)體外殺菌-時(shí)間曲線檢測(cè)不同質(zhì)量濃度抗菌肽PAJE的殺菌能力，結(jié)果（圖3）表明，經(jīng)過(guò)2×MIC、4×MIC 和8×MIC PAJE 處理后S. aureus 和SCVs在2.0 h內(nèi)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性，且效果均優(yōu)于CK 和2×MIC 萬(wàn)古霉素（2×MIC Van）。S. aureus 和SCVs 均在8×MICPAJE處理0.5 h后完全被抑制生長(zhǎng)。

2.3 抗菌肽PAJE 對(duì)S. aureus 和SCVs 抑制生物膜形成能力分析

在生物膜形成初期添加抗菌肽PAJE和萬(wàn)古霉素，觀察生物膜的形成情況。由圖4可知，抗菌肽PAJE能夠抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。經(jīng)1×至8×MIC PAJE處理2 h后，抑制S. aureus 及SCVs生物膜形成的效果優(yōu)于萬(wàn)古霉素，其抑制能力約為萬(wàn)古霉素的2倍。

不同質(zhì)量濃度PAJE抑制S. aureus 生物膜形成能力無(wú)顯著差異，由此表明，1×MIC即可達(dá)到較好的抑制效果；不同質(zhì)量濃度PAJE抑制SCVs生物膜形成能力存在顯著差異，其中2×MIC 和4×MIC處理的抑菌效果較好，又以2×MIC抑制能力最強(qiáng)（圖4）。

2.4 抗菌肽PAJE 對(duì)S. aureus 和SCVs 相關(guān)特性基因表達(dá)分析

由圖5 可知，抗菌肽PAJE 處理S. aureus 與SCVs后，Agr調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，與未處理S. aureus 相比上調(diào)0.19～18.80倍，其中agrA、agrB、agrC、agrD 極顯著上調(diào)（圖5A），與未處理SCVs 相比，上調(diào)0.02～2.58 倍，其中RNAIII、agrB、agrD 均極顯著上調(diào)（圖5B）；SigB調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，與未處理組S. aureus 和SCVs 相比，分別下調(diào)87.33%～92.81%和87.95%～67.55%，且與未處理組具有極顯著差異（圖5C、D）；生物膜相關(guān)基因的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，與未處理組相比分別下降45.82%～91.92% 和6.00%～95.97%，其中relQ、relP、rsh、codY、clfA 在S. aureus 和SCVs 中均極顯著下調(diào)（圖5E、F）。

2.5 掃描電鏡分析

利用掃描電子顯微鏡直接觀察未處理組和抗菌肽PAJE處理后的S. aureus 和SCVs細(xì)胞的形態(tài)和完整性，結(jié)果（圖6）顯示，未處理的S. aureus 和SCVs細(xì)胞形態(tài)完整，表面光滑；經(jīng)抗菌肽PAJE處理后，S. aureus 細(xì)胞的外面可觀察到一些絲狀粘附物質(zhì)；SCVs細(xì)胞表面呈現(xiàn)出小泡狀突起，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空洞或破裂現(xiàn)象。

2.6 抗菌肽PAJE 對(duì)S. aureus 細(xì)胞膜的作用分析

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗菌肽PAJE 對(duì)S. aureus 和SCVs質(zhì)膜的影響，結(jié)果（圖7）表明，未處理組中，PI染色的S. aureus 和SCVs細(xì)胞熒光率分別為0.155%和0.027%，細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜；經(jīng)抗菌肽PAJE處理后，S. aureus 和SCVs細(xì)胞膜受損，PI對(duì)細(xì)胞的穿透率分別為54.7%和62.9%。

3 討論

S. aureus 感染是影響畜牧生產(chǎn)的主要問(wèn)題之一，在抗菌藥物作用等應(yīng)激環(huán)境下形成SCVs具有持續(xù)及復(fù)發(fā)性感染，同時(shí)加重細(xì)菌耐藥性，而一線有效類(lèi)抗生素替代品缺乏，使其治療變得更為復(fù)雜[35]。此外，較難清除的生物膜是持續(xù)性感染的主要原因[19]，且SCVs產(chǎn)生物膜的能力更強(qiáng)[6]?；诳咕腜AJE具有廣譜抑菌活性[25]，本研究進(jìn)一步分析其生物學(xué)特性，并研究其對(duì)S. aureus 和SCVs的抑菌活性及其抗菌機(jī)制，為其后期的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

本研究利用溫度、pH及蛋白穩(wěn)定性對(duì)抗菌肽PAJE的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其溫度及pH穩(wěn)定性較高，但耐酶解能力較低，因此可考慮注射治療；但由于畜禽靜脈注射不方便等問(wèn)題，可通過(guò)改變肽鏈中氨基酸或個(gè)別氨基酸的構(gòu)型方式[3637]，也可通過(guò)替換為疏水氨基酸的方式[19，38]，增加其耐酶解能力，進(jìn)而達(dá)到方便口服或作為飼料添加劑用于防治 S. aureus 及其SCVs感染。

對(duì)抗菌肽PAJE抗生物膜能力及其生物膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析表明，抗菌肽PAJE處理后，S.aureus 及其SCVs 中Agr 調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，SigB調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，同時(shí)生物膜相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因與生物膜形成相關(guān)基因有著密切的關(guān)系，且在S. aureus 轉(zhuǎn)換為SCVs過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用[3940]。其中，sigB 是S. aureus 生物群落成熟的重要調(diào)節(jié)基因。缺乏sigB 導(dǎo)致agr 基因表達(dá)量增加，從而提高細(xì)胞外蛋白酶水平，改變蛋白水解酶活性，高水平的agr 基因表達(dá)具有抗菌作用[41]。sigB 是受生物膜形成相關(guān)基因CodY 直接調(diào)控的[40]，RsbU 可正向調(diào)控sigB[42]，與本研究結(jié)果一致。除此之外，clfB 等基因表達(dá)上調(diào)可增加生物膜的黏附作用[43]，進(jìn)一步增強(qiáng)感染能力。

利用掃描電鏡及流式細(xì)胞儀分析表明，經(jīng)抗菌肽PAJE處理后，S. aureus 的細(xì)胞壁皺縮，細(xì)胞膜破裂，PI可進(jìn)入受損的菌體，表明抗菌肽PAJE通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜相互作用致使細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這在其他抗菌肽中也有發(fā)現(xiàn)[4445]。

綜上所述，抗菌肽PAJE對(duì)溫度及pH的穩(wěn)定性較高，且抑菌效果較高，能抑制生物膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使其內(nèi)容物釋放，達(dá)到較為理想的抑菌殺菌效果。以上研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)S. aureus 和SCVs及其生物膜相關(guān)畜禽感染中的新肽藥物及其添加劑的研發(fā)提供了新思路。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）

基金項(xiàng)目：北京城市學(xué)院種子基金項(xiàng)目（KYZZ202005）。