香菇菌絲熱脅迫響應及耐熱綜合評價

劉萌　林辰壹　吳瑞　曹爽　梁志豪　張若楠

摘要：為研究不同香菇菌株菌絲對熱脅迫的響應，綜合評價其耐熱性，篩選出關(guān)鍵指標，以9個香菇菌株為試驗材料，在菌絲生長期分別進行25 ℃常溫培養(yǎng)（CK）和37 ℃熱脅迫處理，測定不同處理下菌絲的生長速度、干重、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）、蛋白質(zhì)羰基（protein carbonyl，PCO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、漆酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶及淀粉酶的生理活性，并通過相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)及聚類分析進行耐熱性綜合評價。結(jié)果表明，熱脅迫后菌絲的生長速度、干重較CK極顯著下降，而TBARS 、PCO含量和SOD、CAT、漆酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素及淀粉酶活性較CK極顯著上升，POD活性較CK顯著上升。其中，新秋 7的生長速度和漆酶、半纖維素、淀粉酶活性的降幅及TBARS含量的增幅最大，分別為66.55%、82.42%、46.03%、75.27%、23.64%；109的干重降幅最大，為77.81%；808的PCO含量增幅最大，為43.77%；212的SOD、POD活性增幅最大，分別為CK的1.64、4.48倍；久香秋 7的CAT增幅最大，為49.90%；1513的羧甲基纖維素酶活性降幅最大，為60.87%。相關(guān)性分析表明，SOD與POD活性呈極顯著正相關(guān)；POD活性與TBARS含量呈極顯著負相關(guān)。以耐熱性綜合評價D 值進行排序分類，將9個菌株劃分為3個類群，Ⅰ類包含212、久香秋7、238和0912；Ⅱ類包含9608、808、1513和109；Ⅲ類僅包含新秋7；3個類群的耐熱性表現(xiàn)為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ。經(jīng)逐步回歸分析建立了最佳回歸模型，篩選出菌絲生長速度、TBARS含量及SOD和 POD活性為耐熱性關(guān)鍵鑒定指標，可快速鑒定菌絲的耐熱能力。以上研究結(jié)果為南疆地區(qū)選育耐熱香菇核心種質(zhì)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：香菇；熱脅迫；生長速度；硫代巴比妥酸反應物；抗氧化酶

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0796

中圖分類號：S646.1+2 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）05009011

香菇（Lentinula edodes）作為一種高產(chǎn)、高效栽培作物，在我國經(jīng)濟作物中占據(jù)重要地位[1]。據(jù)統(tǒng)計，2020年我國香菇產(chǎn)量為1 188.21萬t，占全國食用菌總產(chǎn)量的29.26%，產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[2]。新疆南疆地區(qū)在香菇生產(chǎn)期存在環(huán)境溫度高、設(shè)施可控性差等問題，導致香菇生產(chǎn)出現(xiàn)越夏栽培困難、春季栽培時間短及秋季無法提前制棒等問題，嚴重降低了香菇生產(chǎn)茬次，限制了茬口安排。隨著“溫室效應”逐漸增強，極端高溫天氣出現(xiàn)的頻率大大提高，對香菇生產(chǎn)造成極大威脅，導致其大面積爛棒甚至絕收[3]。香菇菌絲生長的最適溫度為24～27 ℃[1]，且菌絲生長期為溫度最敏感時期，此時遭遇高溫將嚴重影響基質(zhì)的養(yǎng)分代謝，進一步影響出菇的產(chǎn)量和品質(zhì)[4-6]。香菇菌絲的耐熱性由多途徑調(diào)控[7]，是個復雜的性狀，其中產(chǎn)量、生理和形態(tài)性狀受脅迫影響變化最顯著[8]，因此通過形態(tài)指標、菌絲產(chǎn)量及其生理特征進行耐熱性評價、建立菌絲耐熱鑒定體系，對挖掘適宜當?shù)刭Y源和氣候特點的優(yōu)質(zhì)菌株尤為重要，可為當?shù)匾N和相關(guān)高產(chǎn)栽培提供理論及技術(shù)依據(jù)，對促進當?shù)叵愎疆a(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有現(xiàn)實意義。

高溫逆境下香菇生長響應是多元的、復雜的，高溫抑制香菇菌絲生長，造成活性氧（reactiveoxygen species，ROS）大量積累，破壞細胞膜穩(wěn)定性，造成一系列生理紊亂[2]。高溫脅迫生成的ROS 導致氨基酸側(cè)鏈被氧化，使蛋白質(zhì)羰基（protein carbonyl，PCO）含量增加，并攻擊膜系統(tǒng)，使膜脂脂肪的不飽和鍵被過氧化，造成硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量增加[9]。TBARS包含了大部分氧化傷害產(chǎn)生的醛酮類物質(zhì)，因而可作為衡量脂質(zhì)過氧化的重要指標[10]。王波等[4]研究發(fā)現(xiàn)，香菇菌絲在30 ℃的生長速度明顯低于26 ℃。劉兵[11]研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫使香菇菌絲的漆酶（laccases）、羧甲基纖維素酶（carboxy methyl cellulase）和淀粉酶（amylase）活性顯著降低，且隨著高溫脅迫時間的延長，胞外酶活性逐漸降低，進而影響菌絲在基質(zhì)中生長。周莎莎等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)40 ℃高溫脅迫后香菇菌絲的生長量明顯降低，超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性有不同程度的提高，表明高溫脅迫激發(fā)了菌絲抗氧化酶防御系統(tǒng)。高溫是香菇生產(chǎn)實踐中面臨的重要逆境脅迫，嚴重制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此，提高香菇菌絲耐熱性、篩選耐熱性評價和鑒定指標、探索和構(gòu)建菌絲耐熱評價方法具有重要意義。

本研究以菌絲生長時期作為耐熱關(guān)鍵期，選取9個不同香菇菌株為供試材料，以南疆蘋果木粉為培養(yǎng)基質(zhì)模擬香菇生產(chǎn)的營養(yǎng)環(huán)境，設(shè)置熱脅迫和對照處理，通過比較不同處理下各菌株的形態(tài)、菌絲生長和生理等相關(guān)指標，探究不同香菇菌株的耐熱性，明確熱脅迫下香菇菌絲內(nèi)部的生理過程變化特點。結(jié)合相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析及逐步回歸分析結(jié)果篩選香菇耐熱性評價的關(guān)鍵指標，以期為耐熱性香菇菌株種質(zhì)資源的創(chuàng)制、高產(chǎn)高效栽培提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試香菇菌株包括808、新秋7、0912、久香秋7、1513、212、9608、109及238共9個。其中，808為和田地區(qū)生產(chǎn)用菌株，由墨玉縣樹上老菌菌業(yè)有限公司提供；新秋7、0912、久香秋7、1513、212、9608、109及238菌株均由湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供。

1.1.2 供試材料

選取南疆和田地區(qū)當年修剪蘋果木枝椏，自然曬干后作為主料，要求新鮮、潔凈、干燥、無蟲、無霉、無異味。將主料和輔料麩皮打碎成粉末，過30～50目篩備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

蘋果木屑固體培養(yǎng)基配方為：蘋果木屑粉78 g，麩皮粉20 g，葡萄糖2 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)及熱脅迫處理

滅菌后的培養(yǎng)基倒入90 mm 的培養(yǎng)皿中制平板，每皿25 mL。打孔器取6 mm活化的菌種（菌落邊緣處）置于平板中央，用封口膜封好培養(yǎng)皿邊緣，并做好標記。熱脅迫處理（HT）為25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)6 d，置于37 ℃高溫條件下處理24 h，之后再轉(zhuǎn)入25 ℃下恢復培養(yǎng)6 d；以25 ℃常溫培養(yǎng)[11]為對照（CK）。

1.2.2 菌絲生長速度測定及形態(tài)觀察

采用十字交叉法[4]測定菌絲直徑。于菌絲熱脅迫處理后及恢復培養(yǎng)第6天分別測定菌絲直徑，計算菌絲的生長速度（mm·d-1）[4]，同時觀察菌絲形態(tài)變化。

1.2.3 干重的測定

取恢復培養(yǎng)6 d的9個菌株菌絲置于濾紙上，在60 ℃的烘干箱中烘干至恒重，測定干重，重復5次，取平均值。

1.2.4 抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的測定

分別取9個菌株37 ℃熱脅迫24 h及對照的菌絲各1 g，液氮研磨，冰浴條件下加入2.5 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）混勻，在4 ℃下7 200 r·min-1 離心15 min，取上清液進行抗氧化酶和氧化產(chǎn)物含量的測定。參照Kong等[13]方法測定TBARS含量，參照Levine等[14]方法測定PCO含量，采用氮藍四唑法[15]測定SOD活性，采用比色法[16]測定CAT活性，采用愈創(chuàng)木酚法[17]測定POD活性。

1.2.5 胞外酶活性的測定

取恢復培養(yǎng)6 d及對照的菌絲和培養(yǎng)基混合體1 g，研缽研磨后轉(zhuǎn)到試管，并加入蒸餾水定容至10 mL，25 ℃浸提4 h后過濾，4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液。采用鄰聯(lián)甲苯胺法[18]測定漆酶活性，采用DNS法測定羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶活性[19]。30 min內(nèi)1 g干培養(yǎng)物改變0.1個光密度值的酶活力為1 U。

1.3 數(shù)據(jù)處理及評價方法

采用Excel 2010 軟件整理數(shù)據(jù)，采用SPSS25.0 軟件進行方差分析、相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析及聚類分析。各指標的相對值和相對變化率的計算公式[2021]如下。

相對值=處理組測定值／對照組測定值×100% （2）

相對變化率=（處理組測定值?對照組測定值）/對照組測定值×100% （3）

按特征值大于1或累計貢獻率大于80%的準則提取主成分，利用隸屬函數(shù)將每個主成分上各菌株各主成分的得分值進行標準化[21]；然后計算各綜合指標的權(quán)重；進一步計算各菌株的耐熱綜合評價值（D 值），并以D 值進行聚類分析[2223]；選用D 值作為因變量，11個生長和生理指標相對值作為自變量進行逐步回歸分析，建立最優(yōu)回歸方程[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱脅迫下的響應指標分析

熱脅迫下，各菌株的菌絲較CK稀疏，且產(chǎn)生了“氧化應激”圈（圖1），9個香菇菌絲的生長速度和干重、TBARS和PCO含量及SOD、CAT、漆酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶活性與CK均存在極顯著差異，POD 活性與CK存在顯著差異（表1～3），表明熱脅迫對9個香菇菌絲的形態(tài)、生長和生理指標均產(chǎn)生不同程度的影響。

在熱脅迫下，9個香菇菌絲的生長速度、干重均較CK大幅度降低（表1），其中，新秋7生長速度的降幅最大，為66.55%。109干重的降幅最大，為77.81%。TBARS、PCO 含量及SOD、CAT、POD 活性較CK 大幅度上升（表2），其中，新秋 7 的TBARS含量和808的PCO含量增幅最大，分別為23.64% 和43.77%；212 的SOD、POD 活性增幅最大，分別為CK 的1.64、4.48 倍，但其TBARS 含量的增幅最小，為4.84%；久香秋 7的CAT活性增幅最大，為49.90%。熱脅迫后，9個菌絲的胞外酶活性較CK均有大幅度下降（表3），其中，新秋 7的漆酶、半纖維素、淀粉酶活性降幅最大，分別為82.42%、46.03%、75.27%；1513的羧甲基纖維素酶降幅最大，為60.87%。綜上所述，高溫脅迫后各菌株的生長、形態(tài)和生理指標均表現(xiàn)出不同程度的差異，表明不同菌株的代謝能力和溫度適應能力存在差異。

2.2 相對指標值及相關(guān)性分析

為了減少不同菌株自身代謝能力和高溫適應能力不同對耐熱性評價的干擾，計算了熱脅迫后9個菌株菌絲響應指標的相對值（表4），發(fā)現(xiàn)各值在不同菌株間變化幅度不同，說明無法根據(jù)某個單一指標的相對值直接判斷其耐熱性，需對各指標進行相關(guān)性分析，再進一步綜合評價。此外，在熱脅迫下，各響應指標相對值的變異系數(shù)在5.35%～35.86%，差異較大。由此可以看出，9個菌株的耐熱性差異較大，且試驗所選取的響應指標可用于耐熱評價。

相關(guān)性分析（圖2）表明，SOD與POD活性呈極顯著正相關(guān)；半纖維素酶活性與干重呈顯著正相關(guān)；POD活性與TBARS含量呈極顯著負相關(guān)。由此表明，在熱脅迫后菌絲SOD與POD活性、半纖維素酶活性與菌絲干重等指標間的響應表現(xiàn)具有一致性，而POD活性與TBARS含量則相反，表明TBARS含量的降低是通過SOD與POD活性共同協(xié)作完成的。此外，其他指標間也存在不同程度的相關(guān)性。

2.3 不同香菇菌株耐熱性綜合評價

在熱脅迫響應中，由于各指標間具有相關(guān)性，會導致選擇的指標在指標評價體系整體中具有相似的功能，掩蓋了各指標本身在指標體系整體中所具有的差異性，使各指標所反映的耐熱性信息存在不同程度的交叉與重疊現(xiàn)象。因此，無法用某一指標進行耐熱性評價，需要在此基礎(chǔ)上利用主成分分析法、隸屬函數(shù)法等將相關(guān)性指標整合成獨立的綜合指標進行評價。

2.3.1 基于各響應指標相對值的主成分分析

主成分分析結(jié)果（表5）表明，以特征值大于1為原則，得到2個主成分，方差解釋率分別為66.06%和14.20%，累計貢獻率為80.26%，說明2 這個主成分可代表11個性狀的大部分信息。2個主成分（Z1和Z2）對應的相關(guān)系數(shù)特征向量如下所示。

Z1 = 0.312X1-0.357X2-0.119X3+0.355X4+0.349X5+0.303X6+0.267X7+0.210X8+0.322X9+0.330X10+0.305X11 （4）

Z2 = 0.033X1+0.094X2+0.663X3+0.173X4+0.038X5-0.070X6+0.142X7-0.538X8+0.262X9-0.179X10+0.322X11 （5）

式中，X1代表生長速度；X2代表TBARS含量；X3 代表PCO 含量；X4 代表SOD 活性；X5 代表POD活性；X6代表CAT活性；X7代表漆酶活性；X8代表羧甲基纖維素酶活性；X9 代表半纖維素酶活性；X10代表淀粉酶活性；X11代表干重。

2.3.2 隸屬函數(shù)值分析

通過主成分分析得到2個主成分及其對應的特征向量，計算出其得分值和隸屬函數(shù)值。然后根據(jù)各成分貢獻率計算各主成分的權(quán)重，2個主成分的權(quán)重分別為0.82、0.18。根據(jù)權(quán)重和隸屬函數(shù)值，計算出各材料的綜合得分值（D），D 值為各材料的耐熱能力，D 值越大，表明該菌株的耐熱性越高。由表6可知，9個菌株的D 值表現(xiàn)為212>久香秋7>238>0912>9608>808>1513>109>新秋7。

2.3.3 聚類分析

根據(jù)D 值進行聚類分析，將9個香菇菌株耐熱能力分為3個類群，如圖3所示。類群Ⅰ包含212、久香秋7、238 和0912，其D 值≥0.68；類群Ⅱ包含9608、808、1513和109（0.31≤D≤0.53）；類群Ⅲ僅包含新秋7，其D 值≤0.10。此外，菌絲的生長速度、TBARS 含量及SOD、POD 活性在不同類群間差異較大，其中，類群Ⅰ上述4個指標的相對值分別為43%～55%、104%～109%、236%～264%和135%～150%；類群Ⅱ分別為37%～43%、109%～117%、116%～191% 和119%～130%；類群Ⅲ分別為34%、124%、107%及106%。

2.4 回歸模型的建立和耐熱評價指標的篩選

采用多元逐步回歸分析方法，以綜合評價值（D）為因變量，以各響應指標相對值為自變量建立最優(yōu)回歸方程，預測香菇耐熱性鑒定的數(shù)學回歸模型如下所示。

D=0.532+0.005X1-0.01X2+0.002X4+0.004X5 （6）

式中，X1、X2、X4、X5分別代表生長速度、TBARS含量及SOD、POD 活性的相對值，該方程的R2=0.997，F(xiàn)=604.10，達到極顯著性水平（P<0.01），表明這4個指標為耐熱性鑒定的關(guān)鍵響應指標。

將9個香菇菌株的上述4個關(guān)鍵指標的相對值代入方程，得到9個菌株的耐熱性預測值，分別為0.765、0.444、0.944、0.101、0.705、0.315、0.311、0.546和0.781，排序與主成分分析一致；將預測值與主成分分析的綜合評價值（D）進行相關(guān)性分析，可得出二者的相關(guān)系數(shù)r 為0.998，呈極顯著相關(guān)（P<0.01），說明該回歸方程對香菇菌絲的耐熱性預測具有較好的可靠性。

3 討論

3.1 菌絲的熱脅迫響應

當生物體處于高溫脅迫下，細胞會受到損傷甚至死亡，并產(chǎn)生一系列復雜的包括形態(tài)、生理生化的響應[2526]。本研究表明，熱脅迫處理明顯抑制菌絲的生長速度和生物量，其生長速度較CK降低33.45%～69.19%，干重降低22.19%～51.17%，由此表明，熱脅迫對菌絲生長速度的影響略大于菌絲生物量。同時，熱脅迫會引起機體氧化還原系統(tǒng)紊亂，產(chǎn)生大量ROS積累，造成氧化損傷，生物體通過激活自身抗氧化防御系統(tǒng)進行氧化應激行為[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱脅迫處理后菌絲的SOD、CAT、POD 活性上升，其中，212 的酶活性增幅較大，且TBARS含量的增長較少，表明在熱脅迫后菌株會通過提高抗氧化酶活性以此降低高溫造成的膜脂過氧化損傷，這與王倩等[27]研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在解除熱脅迫后，常溫恢復培養(yǎng)的香菇菌絲分泌胞外代謝酶的能力較對照組顯著下降，這與劉兵[11]研究結(jié)果一致。熱脅迫后，香菇菌絲通過提高抗氧化酶活性、降低TBARS含量等生理響應，有利于菌絲恢復生長。

3.2 菌絲的耐熱評價方法及關(guān)鍵指標的篩選

選育香菇耐熱品種至關(guān)重要，而高效的評價、鑒定方法是開展耐熱品種選育工作的基礎(chǔ)[24，28]。為篩選適宜的評價指標，前人開展了大量相關(guān)研究。趙妍等[5]利用雜交方法選育香菇耐高溫菌株時發(fā)現(xiàn)，菌絲生長速度為耐高溫菌株篩選的重要指標。周莎莎等[12]研究表明，菌絲TBARS、超氧陰離子含量及SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性可作為篩選菌絲耐熱能力的標準。宋爽等[8]對不同香菇種質(zhì)的耐熱性評價后，將SOD、CAT、POD活性及丙二醛（malonaldehyde，MDA）、脯氨酸含量等生理指標的耐熱系數(shù)標準化后進行聚類分析，將808劃分為耐熱能力較弱的菌株。本研究在進行耐熱性評價時，采用指標相對值進行評價，可以有效地克服品種本身差異所帶來的影響，更準確地對不同品種的耐熱性進行客觀評價；此外，采用相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析及聚類分析等方法，彌補了用單一指標或單一分析方法進行耐熱評價的不足，能更準確地反映香菇的耐熱能力，經(jīng)評價將808劃分為中等耐熱能力的菌株；同時，本研究采用多元逐步回歸分析建立了菌絲耐熱性的回歸模型，篩選出高溫脅迫后菌絲的生長速度、SOD活性、POD活性和TBARS含量為關(guān)鍵鑒定指標，為快速評價香菇的耐熱性提供了參考性狀，有利于提高耐熱品種的選育效率。

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（責任編輯：張冬玲）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（ 2021YFD1100607）；新疆維吾爾自治區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（XJARS-07）；大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（XJAU2022555）。