基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接探討黃芪-丹參治療肝纖維化的作用機(jī)制

趙一鵬 繆玲 鐘亞玩 徐坤敏 黃娜娜 周云松 胡芳

摘要：目的? 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接研究黃芪-丹參治療肝纖維化作用機(jī)制。方法? 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺對黃芪、丹參有效成分及其相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選；利用GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫平臺對肝纖維化作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用String和David數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)、GO生物過程與KEGG通路分析。通過AutoDock Vina對成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。結(jié)果? 黃芪-丹參中共獲得有效成分76個，與肝纖維化對應(yīng)的靶點(diǎn)64個；GO生物過程102條，信號通路155條，主要涉及的信號通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路等。分子對接顯示黃芪、丹參中槲皮素、木犀草素、山柰酚和丹參酮ⅡA等與核心靶點(diǎn)AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6均具有較好的親和力。結(jié)論? 黃芪-丹參治療肝纖維化的作用機(jī)制具有“多成分、多靶點(diǎn)、多信號通路”的特點(diǎn)，為今后的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃芪-丹參；肝纖維化；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

中圖分類號：R575? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.004

文章編號：1006-1959（2024）04-0021-06

The Mechanism of Huangqi-Danshen in the Treatment of Liver Fibrosis

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Yi-peng1，MIAO Ling2，ZHONG Ya-wan2，XU Kun-min2，HUANG Na-na2，ZHOU Yun-song2，HU Fang2

（1.The Second Clinical Medical College of Guizhou University of Chinese Medicine，Guiyang 550000，Guizhou，China;

2.Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine，

Guiyang 550000，Guizhou，China）

Abstract：Objective? To study the mechanism of Huangqi-Danshen in the treatment of liver fibrosis by network pharmacology and molecular docking.Methods? The TCMSP database platform was used to screen the effective components and related targets of Huangqi and Danshen. GeneCards and OMIM database platforms were used to screen the targets of liver fibrosis. Cytoscape software was used to construct the "drug-component-disease-target" network diagram， and String and David databases were used to analyze the PPI network， GO biological process and KEGG pathway of the targets. Molecular docking of components and targets was performed by AutoDock Vina.Results? A total of 76 active ingredients and 64 targets corresponding to liver fibrosis were obtained from Huangqi-Danshen. There were 102 GO biological processes and 155 signaling pathways. The main signaling pathways involved were AGE-RAGE signaling pathway， IL-17 signaling pathway， TNF signaling pathway， and hypoxia-inducible factor 1 （HIF-1） signaling pathway in diabetic complications. Molecular docking showed that quercetin， luteolin， kaempferol and tanshinone ⅡA in Radix Astragali and Radix Salviae Miltiorrhizae had good affinity with core targets AKT1， TP53， VEGFA， TNF and IL-6.Conclusion? The mechanism of Huangqi-Danshen in the treatment of liver fibrosis has the characteristics of "multi-component， multi-target and multi-signal pathway"， which provides a reference for future experimental research.

Key words：Huangqi-Danshen;Liver fibrosis;Network pharmacology;Molecular docking

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指在各種病因的作用下，肝星狀細(xì)胞（heapatic stellate cell，HSC）被誘導(dǎo)激活為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFP），并且導(dǎo)致肝細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）產(chǎn)生和降解之間的不平衡，導(dǎo)致正常肝功能受損，最后引起肝纖維化[1]。慢性肝炎、脂肪肝以及其他一些肝臟疾病都可發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌，因此對肝纖維化進(jìn)行早期診斷與治療具有很重要意義。最新資料表明[2]，全世界每年約有2百萬人死于肝病，其中肝硬化，肝癌為終末期肝病死亡的重要原因；肝硬化致死率由第13位增加到第11位，肝癌致死率由20位增加到16位。由于肝臟疾病具有高復(fù)發(fā)率、低死亡率等特點(diǎn)，因而越來越引起醫(yī)學(xué)界重視。我國肝病患者約有3千萬人，肝硬化在全世界范圍內(nèi)死亡人數(shù)為11%[3]；隨著社會老齡化程度的增加以及生活方式的改變，我國肝臟疾病發(fā)病率呈逐年增長趨勢。肝纖維化在各種慢性肝病進(jìn)展至終末期肝病的進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，因此早期干預(yù)肝纖維化是預(yù)防慢性肝病發(fā)展為終末期肝病的一種有效手段。近年來中醫(yī)藥抗肝纖維化研究結(jié)果備受關(guān)注，中藥具有多層次、多靶點(diǎn)、多途徑的藥理作用表現(xiàn)出更大優(yōu)越性，引起了國內(nèi)外專家學(xué)者的重視[4]。氣虛血瘀為肝纖維化的基本病機(jī)，因此對肝纖維化治療以益氣活血為主。黃芪、丹參分別為益氣，活血之要品，為中醫(yī)益氣活血類常配伍藥。本文擬以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思想和方法為依托，探討黃芪-丹參有效成分、作用靶點(diǎn)以及通路間關(guān)系，研究黃芪-丹參抗肝纖維化作用機(jī)制，以期為肝纖維化臨床治療提供參考依據(jù)。

1資料與方法

1.1黃芪-丹參有效成分、靶點(diǎn)篩選? 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）獲取黃芪、丹參有效成分與靶點(diǎn)，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2肝纖維化靶點(diǎn)篩選? 利用Genecards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳（OMIM）在線數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/），以“hepatic fibrosis”作為檢索詞，尋找肝纖維化疾病靶點(diǎn)。其中，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥10為篩選條件。

1.3藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? 將藥物、有效成分、疾病與作用靶點(diǎn)進(jìn)行整理，通過Cytoscape（http：//www.cytoscape.org/）構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? 在STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中導(dǎo)入黃芪-丹參治療肝纖維化的作用靶點(diǎn)，以“Homo sapiens”為篩選條件獲取核心靶點(diǎn)，通過Cytoscape 3.9.1（http：//www.cytoscape.org/）構(gòu)建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO生物過程和KEGG通路富集分析? 在David數(shù)據(jù)庫（https：//dvid.ncifcrf.gov/）對共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物過程與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。其中，篩選條件P＜0.05，對P值位于前15的通路進(jìn)行可視化分析。

1.6分子對接? 將PPI網(wǎng)絡(luò)利用NetworkAnalyzer進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過“degree”的方式排序，將基因分值位于前5的靶點(diǎn)選取為受體，將黃芪-丹參核心成分選取為配體，通過AutoDock Vina將受體和配體進(jìn)行對接，結(jié)果以最低結(jié)合能進(jìn)行比較。

2結(jié)果

2.1黃芪-丹參有效成分、靶點(diǎn)的篩選? 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中對黃芪、丹參進(jìn)行檢索，分別獲得17個和59個有效成分，共76個有效成分，通過數(shù)據(jù)庫獲取作用靶點(diǎn)247個，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2.2黃芪-丹參治療肝纖維化的作用靶點(diǎn)? 在Genecards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別輸入“hepatic fibrosis”進(jìn)行檢索，獲得589個疾病靶點(diǎn)。通過Venny2.1軟件獲得黃芪-丹參有效成分與肝纖維化的共同靶點(diǎn)64個，見圖1。

2.3藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)? 通過Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，獲得247個藥物靶點(diǎn)，589個疾病靶點(diǎn)，64個共同靶點(diǎn)，見圖2。結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA等在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，說明這些成分可能是治療肝纖維化的核心成分。

2.4黃芪-丹參治療肝纖維化靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)? 在String數(shù)據(jù)庫中對藥物疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，然后導(dǎo)入Cystoscap，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，涉及64個節(jié)點(diǎn)、1167條邊，見圖3。其中，絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的度值明顯高于其他靶點(diǎn)，說明它們在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。

2.5 GO生物過程和KEGG通路富集分析? 將藥物與疾病64個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO生物過程和KEGG通路分析。以P＜0.05為篩選條件，選取P值較小的前15個進(jìn)行氣泡圖可視化。獲得GO條目102個，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、信號受體激活劑活性、受體配體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合等生物過程，見圖4。獲得信號通路155條，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路等，見圖5。

2.6分子對接? 通過PPI網(wǎng)絡(luò)，選取度值較大的5個作用靶點(diǎn)和4個有效成分進(jìn)行分子對接，通過對接分值選擇最優(yōu)構(gòu)型，見表1。平均對接分值-7.06 kcal/mol，其中，丹參酮ⅡA（tanshinone iia）和TNF對接分值-8.32 kcal/mol，槲皮素（quercetin）和VEGFA對接分值-8.15 kcal/mol，見圖6、圖7。

3討論

近年來，隨著人類物質(zhì)文明和生活方式的高度發(fā)展，人類的疾病譜已經(jīng)變的錯綜復(fù)雜，然而這些復(fù)雜疾病在發(fā)生和發(fā)展中常涉及“多臟腑、多靶點(diǎn)、多基因及多信號通路”。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有“多靶點(diǎn)、多信號通路”的特點(diǎn)，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通信號路的作用，與當(dāng)前的疾病治療理念相符合，因此研究中藥與多成分、多靶點(diǎn)、多通路的相關(guān)性，對于闡述疾病發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)具有重要價值。

本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、山柰酚和丹參酮ⅡA為黃芪-丹參的主要有效成分，可以作用于大量的肝纖維化靶點(diǎn)，它們都屬于黃酮類化合物，主要存在于自然界，具有抗炎、抗氧化等作用[5]。蔣煒等[6]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對體外培養(yǎng)的HSC具有明顯的調(diào)控作用。陳文龍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中，榭皮素具有明顯的保護(hù)作用。Ma JQ等[8]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠降低細(xì)胞色素P450 2E1和促炎標(biāo)志物的表達(dá)。Cummins CB等[9]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠誘導(dǎo)HSC凋亡，下調(diào)α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)。Xu T等[10]研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚可抑制膠原蛋白的合成和HSC的活化。丹參酮ⅡA能夠抑制TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4表達(dá)，激活Smad7表達(dá)，從而抑制HSC的活化[11-13]。以上研究表明，黃芪-丹參的有效成分對肝纖維化的治療是有效的，具有重要的研究價值。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)，度值比較高的蛋白是AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6，說明這些可能為治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)。AKT1屬于AKT激酶之一，Akt1可抑制HSC的活化，抑制促肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)[14]。TP53屬于肝癌的啟動基因，如果伴有乙型肝炎病毒感染，更易發(fā)展為肝硬化[15]。VEGFA能夠誘導(dǎo)肝臟內(nèi)的血管新生，以及內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖等[16]。TNF來源于巨噬細(xì)胞和免疫細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)免疫的能力，不僅是免疫系統(tǒng)主要的調(diào)節(jié)成分，也是炎癥性疾病治療的主要手段，但如果機(jī)體受到感染或組織受到損傷時其又會被激活，誘導(dǎo)和維持炎癥的發(fā)生[17，18]。此外，TNF具有細(xì)胞毒性作用，可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[19]。IL-6是重要的炎癥因子，能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞受損以及纖維組織增生，使得慢性炎癥持續(xù)發(fā)展[20]?？梢姡卫w維化的發(fā)生、發(fā)展離不開這些靶點(diǎn)，主要涉及HSC的活化、肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)、血管新生、細(xì)胞增殖以及炎癥因子表達(dá)等。

GO生物過程主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、信號受體激活劑活性、受體配體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，對于黃芪-丹參治療肝纖維化具有重要意義。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)IL-17信號通路、TNF信號通路和缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路是治療肝纖維化的特征性信號通路。IL-17在病毒性肝炎、酒精性肝病以及自身免疫性肝炎中呈高表達(dá)狀態(tài)。IL-17A可以通過激活Kupffer細(xì)胞與HSC導(dǎo)致IL-6、TNF-α與TGF-β1產(chǎn)生。IL-17還能夠通過STAT3誘導(dǎo) HSC活化增值。在肝纖維化小鼠中，敲除IL-17A與IL-17RA的小鼠，肝纖維化明顯減輕[21，22]。TNF-α能夠抑制活化的HSC增殖和MMP產(chǎn)生。TNF-α還可以誘導(dǎo)肝內(nèi)皮細(xì)胞和核因子相關(guān)細(xì)胞因子κB的激活，對肝細(xì)胞造成炎性損傷[23]。有文獻(xiàn)報(bào)道[24]，在各種肝纖維化模型中，HIF-1α的表達(dá)均顯著高于正常組，且肝纖維化程度越嚴(yán)重，HIF-1α的表達(dá)也越高。研究發(fā)現(xiàn)[25]，在肝纖維化模型中，通過敲除HIF-1α，VEGF的表達(dá)會下降，說明HIF-1α可調(diào)控VEGF的表達(dá)而導(dǎo)致肝纖維化。

最后，分子對接結(jié)果顯示，黃芪-丹參主要的有效成分槲皮素、木犀草素和山柰酚與丹參酮ⅡA等與核心靶點(diǎn)AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6能夠很好地結(jié)合，對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，初步闡述黃芪-丹參藥對治療肝纖維化可能涉及多成分、多靶點(diǎn)、多信號通路等，豐富了治療肝纖維化的理論基礎(chǔ)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dewidar B，Meyer C，Dooley S，et al.TGF-β in Hepatic Stellate Cell Activation and Liver Fibrogenesis-Updated 2019[J].Cells，2019，8（11）：1419.

[2]Asrani SK，Devarbhavi H，Eaton J，et al.Burden of liver diseases in the world[J].J Hepatol.2019;70（1）：151-171.

[3]Li M，Wang ZQ，Zhang L，et al.Burden of Cirrhosis and Other Chronic Liver Diseases Caused by Specific Etiologies in China， 1990-2016： Findings from the Global Burden of Disease Study 2016[J].Biomed Environ Sci，2020，33（1）：1-10.

[4]陸倫根，尤紅，謝渭芬，等.肝纖維化診斷及治療共識（2019年）[J].實(shí)用肝臟病雜志，2019，22（6）：793-803.

[5]鄒強(qiáng)，李丹琦，劉學(xué)貴，等.紫花苜蓿中黃酮類化合物抗肝癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中南藥學(xué)，2023，21（3）：685-691.

[6]蔣煒，鄧治林，李福昌.槲皮素對人肝星狀細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響與其細(xì)胞周期研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2018，47（9）：1179-1182.

[7]陳文龍，戴富臻，邵正勇，等.槲皮素對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化抑制作用和肝保護(hù)作用[J].中國免疫學(xué)雜志，2021，37（1）：46-50.

[8]Ma JQ，Li Z，Xie WR，et al.Quercetin protects mouse liver against CCl？-induced inflammation by the TLR2/4 and MAPK/NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol，2015，28（1）：531-539.

[9]Cummins CB，Wang X，Nunez Lopez O，et al.Luteolin-Mediated Inhibition of Hepatic Stellate Cell Activation via Suppression of the STAT3 Pathway[J].Int J Mol Sci，2018，19（6）：1567.

[10]Xu T，Huang S，Huang Q，et al.Kaempferol attenuates liver fibrosis by inhibiting activin receptor-like kinase 5[J].J Cell Mol Med，2019，23（9）：6403-6410.

[11]孫瑞芳，劉立新，張海燕，等.丹參酮ⅡA對小鼠肝纖維化的干預(yù)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29（11）：1012-1017.

[12]張彩華，李驄，李華軍，等.丹參酮ⅡA干預(yù)肝纖維化模型大鼠相關(guān)信號通路相關(guān)因子的表達(dá)[J].中國組織工程研究，2015，19（27）：4345-4350.

[13]魏國微，李克躍.丹參酮ⅡA對血管緊張素II誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞TGF-β1/Smads通路的影響[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，38（2）：36-40.

[14]Reyes-Gordillo K，Shah R，Arellanes-Robledo J，et al.Akt1 and Akt2 Isoforms Play Distinct Roles in Regulating the Development of Inflammation and Fibrosis Associated with Alcoholic Liver Disease[J].Cells，2019，8（11）：1337.

[15]Khemlina G，Ikeda S，Kurzrock R.The biology of Hepatocellular carcinoma： implications for genomic and immune therapies[J].Mol Cancer，2017，16（1）：149.

[16]Yang L，Kwon J，Popov Y，et al.Vascular endothelial growth factor promotes fibrosis resolution and repair in mice[J].Gastroenterology，2014，146（5）：1339-50.e1.

[17]Lopetuso LR，Mocci G，Marzo M，et al.Harmful Effects and Potential Benefits of Anti-Tumor Necrosis Factor （TNF）-α on the Liver[J].Int J Mol Sci，2018，19（8）：2199.

[18]Fischer R，Maier O.Interrelation of oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease： role of TNF[J].Oxid Med Cell Longev，2015，2015：610813.

[19]Aggarwal BB.Signalling pathways of the TNF superfamily： a double-edged sword[J].Nat Rev Immunol，2003，3（9）：745-756.

[20]Xia Y，Protzer U.Control of Hepatitis B Virus by Cytokines[J].Viruses，2017，9（1）：18.

[21]Meng F，Wang K，Aoyama T，et al.Interleukin-17 signaling in inflammatory， Kupffer cells， and hepatic stellate cells exacerbates liver fibrosis in mice[J].Gastroenterology，2012，143（3）：765-776.e3.

[22]Tan Z，Qian X，Jiang R，et al.IL-17A plays a critical role in the pathogenesis of liver fibrosis through hepatic stellate cell activation[J].J Immunol，2013，191（4）：1835-1844.

[23]Patel P，Khan N，Rani M，et al.The expression of HIV-1 Vpu in monocytes causes increased secretion of TGF-β that activates profibrogenic genes in hepatic stellate cells[J].PLoS One，2014，9（2）：e88934.

[24]Moczydlowska J，Miltyk W，Hermanowicz A，et al.HIF-1 α as a Key Factor in Bile Duct Ligation-Induced Liver Fibrosis in Rats[J].J Invest Surg，2017，30（1）：41-46.

[25]Copple BL，Bai S，Burgoon LD，et al.Hypoxia-inducible factor-1α regulates the expression of genes in hypoxic hepatic stellate cells important for collagen deposition and angiogenesis[J].Liver Int，2011，31（2）：230-244.

收稿日期：2023-04-13；修回日期：2023-04-25

編輯/王萌