基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)定喘湯治療慢性阻塞性肺疾病的作用機(jī)制及驗(yàn)證研究

徐國(guó)睿 馮湘儀 曲 怡 王建波 劉海濤 馬永鋼 張立德

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,沈陽(yáng),110847; 2 中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng),110847;3 遼寧中醫(yī)藥大學(xué),沈陽(yáng),110847; 4 解放軍總醫(yī)院京西醫(yī)療區(qū),北京,100144)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是一種常見的、可預(yù)防的和可治療的疾病,其特征是持續(xù)的呼吸道癥狀和氣流受限,這是由氣道和(或)肺泡異常引起的,常見于接觸大量有毒顆粒或氣體等原因[1]。由于世界人口老齡化程度加劇,COPD的發(fā)病率及死亡率也在逐年遞增,且COPD的并發(fā)癥較多,如呼吸衰竭、肺源性心臟病等,所以COPD是世界3大死亡原因之一。世界銀行進(jìn)行的一項(xiàng)研究估計(jì),2010年中國(guó)COPD病例數(shù)為25 658 483例,2020年為42 527 240例,2030年為55 174 104例,中國(guó)COPD的診斷率(被診斷為COPD的患者人數(shù)除以通過流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的COPD病例數(shù))在23.61%～30.00%之間。接受門診治療的COPD患者的比例約為50%,而入院率在8.78%～35.60%之間。一項(xiàng)覆蓋7個(gè)省份的全國(guó)性調(diào)查發(fā)現(xiàn),COPD患者的正規(guī)醫(yī)療率僅為7.9%,這就要求改善COPD的預(yù)防和管理。中國(guó)COPD患者仍有大量的衛(wèi)生服務(wù)需求未得到滿足[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療COPD主要以抗炎、抗感染、化痰、解痙平喘、擴(kuò)張支氣管等手段為主,其中激素治療效果顯著,但會(huì)引起一系列不良反應(yīng),且會(huì)影響體內(nèi)的多巴胺及5-羥色胺含量,影響人體情緒,誘發(fā)抑郁、焦慮等,且長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用激素會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、胃應(yīng)激性潰瘍等疾病。近些年很多研究表明,中西醫(yī)結(jié)合治療COPD可減少西藥帶來的不良反應(yīng),并協(xié)同增強(qiáng)其藥物作用[3]。定喘湯源自《攝生眾妙方》,其藥物組成為：麻黃、白果、桑白皮、紫蘇子、半夏、杏仁、款冬花、黃芩、甘草。方中麻黃宣肺散邪以平喘,白果斂肺定喘而祛痰,共為君藥,一散一收,既可加強(qiáng)平喘之功,又可防麻黃耗散肺氣。紫蘇子、杏仁、半夏、款冬花降氣平喘,止咳祛痰,共為臣藥。桑白皮、黃芩清泄肺熱,止咳平喘,共為佐藥。甘草調(diào)和諸藥為使。諸藥合用,使肺氣宣降,痰熱得清,風(fēng)寒得解,則喘咳痰多諸癥自除。因此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析定喘湯治療COPD的作用機(jī)制,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,旨在為中醫(yī)藥治療COPD的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 靶點(diǎn)篩選

1.1.1 定喘湯活性化合物的篩選 本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索定喘湯中各味中藥(白果、半夏、甘草、黃芩、款冬花、麻黃、桑白皮、杏仁、紫蘇子)的有效成分,并根據(jù)口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選,最后得到各個(gè)藥物有效成分。

1.1.2 定喘湯靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物相關(guān)靶點(diǎn)(Related Targets),利用UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/),選擇參數(shù)為人類物種(Human)和已驗(yàn)證的(Reviewed)數(shù)據(jù)庫(kù),得到標(biāo)準(zhǔn)名稱(Targets Symbol),經(jīng)過以上數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)即為中藥有效成分相關(guān)靶點(diǎn)。將各個(gè)單味藥靶點(diǎn)進(jìn)行整合即為定喘湯靶點(diǎn)。

1.1.3 藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)換 UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.uniprot.org/)是國(guó)際公認(rèn)和標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白質(zhì)序列和注釋數(shù)據(jù)的綜合資源數(shù)據(jù)庫(kù)。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換。

1.1.4 COPD靶點(diǎn)獲取 疾病靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)采集于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https：//omim.org/)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Therapeutic Target Database,TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.drugbank.ca/),以COPD為關(guān)鍵詞檢索,采集COPD對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因。將定喘湯成分靶點(diǎn)與COPD靶點(diǎn)取交集,通過R語(yǔ)言繪制韋恩圖。

1.1.5 中藥-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過交集靶點(diǎn)推測(cè)出中藥有效成分,構(gòu)建中藥有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape V 3.8.0軟件對(duì)有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,節(jié)點(diǎn)(Node)代表中藥所含有效成分與交集靶點(diǎn);邊(Edge)代表中藥成分與交集靶點(diǎn)之間聯(lián)系,根據(jù)中藥有效成分與交集靶點(diǎn)之間連接情況篩選定喘湯治療COPD關(guān)鍵成分。

1.1.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)與核心靶點(diǎn)篩選 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,將研究物種設(shè)定為“人”(“Homo Sapiens”),最低互動(dòng)得分設(shè)置為高等置信度[“highes confidence(0.900)f],其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。然后利用Cytoscape V3.8.0軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?選取度(Degree)、介數(shù)中心度(Betweenness Centrality)和中心性(Closeness Centrality)都大于中位值的靶點(diǎn)為定喘湯治療COPD的作用機(jī)制核心靶點(diǎn)。

1.1.7 富集分析 通過R4.1.2,引用“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”包,進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析。做出GO term生物過程(Biological Process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)三合一柱狀圖。通過R 4.1.2,用“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”“pathview”包,進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,并繪制KEGG富集柱狀圖。

1.1.8 核心化合物-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇核心基因,在PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)找到影響該基因的藥物成分2D結(jié)構(gòu),用Chem3D軟件分別進(jìn)行3D優(yōu)化。通過UniProt尋找到對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì),然后用PMV-1.5.6軟件進(jìn)行去水加氫等預(yù)處理。使用AutoDockTools-1.5.6軟件將篩選得到的化合物與目標(biāo)蛋白進(jìn)行對(duì)接。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)選用人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(Human TypeⅡ Alveolar Epithelial Cells,HAECⅡ,貨號(hào)：CP-H209,普諾賽,批號(hào)：CP-H209),細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基額外加入雙抗,培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為37 ℃,5%CO2,每48 h更換1次培養(yǎng)基,3 d傳代一次,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),用胰蛋白酶-EDTA消化液消化3 min,接種于T25培養(yǎng)瓶,6孔板或96孔板中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物 定喘湯藥物顆粒(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,批號(hào)：7100232882)。

1.2.3 試劑與儀器 羅斯韋爾公園紀(jì)念研究所-1640培養(yǎng)液(Roswell Park Memorial Institute,RPMI,格來賽生命科技,批號(hào)：SH30809.01),脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,上海希格瑪高技術(shù)有限公司,批號(hào)：L2654-1MG),磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Solution,PBS,武漢普諾賽生命科技有限公司,批號(hào)：WH0021G11),特級(jí)胎牛血清(賽默飛世爾科技,批號(hào)：FB25015),細(xì)胞活力檢測(cè)試劑(Cell Counting Kit-8,碧云天生物技術(shù),批號(hào)：C0037),青鏈霉素混合液(索萊寶,批號(hào)：No.P1400),胰蛋白酶-EDTA消化液(凱基生物,批號(hào)：KGY0012),Trizol裂解液(碧云天生物技術(shù),批號(hào)：P1275601),引物設(shè)計(jì)合成(北京博邁德基因技術(shù)有限公司,批號(hào)：BMH89759),HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit試劑盒(康為世紀(jì),批號(hào)：CW2582M),UltraSYBR Mixture生物試劑(康為世紀(jì),批號(hào)：CW2601M),白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)人源檢測(cè)試劑盒(北京誠(chéng)林,批號(hào)：202105),白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)人源檢測(cè)試劑盒(北京誠(chéng)林,批號(hào)：202105);熒光定量PCR儀(ABI,美國(guó),型號(hào)：7500 Fast Real-Time PCR),梯度PCR儀器(ABI,美國(guó),型號(hào)：ABI Veriti梯度PCR儀器),超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher,美國(guó),型號(hào)：NanoDrop2000),微量冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher,美國(guó),型號(hào)：Sorvall ST 16R)。

1.3 方法

1.3.1 藥物制備 取藥物顆粒劑用熱水混合,完全融化后等待10 min,將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,條件為50 ℃,200 r/min,在真空冷凝干燥機(jī)中凍干處理48 h,將凍干物研磨成粉末制成凍干粉,取定喘湯凍干粉用適量超純水溶解,制備成母液,再以0.22 μm濾器過濾除菌,放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 給藥方法 將HAEC2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞增殖匯合度至80%～90%進(jìn)行傳代。設(shè)正常對(duì)照組、LPS組、LPS+定喘湯(低、中、高)劑量組。將細(xì)胞接種于6孔/96孔板,待細(xì)胞增殖匯合度至70%～80%后,給予LPS(5 mg/L)刺激細(xì)胞12 h,隨后加入不同濃度定喘湯凍干粉母液干預(yù)24 h。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.3.1 CCK8法檢測(cè)定喘湯對(duì)HAEC喘細(xì)胞增殖的影響 將細(xì)胞接種于96孔板中。在貼壁后造模組加入LPS(5 mg/L)刺激12 h,隨后加入不同濃度定喘湯24 h。加入10 μL CCK-8再孵育,尋找合適的時(shí)間點(diǎn)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.3.2 定量分析 PCR(Quantitative PCR,qPCR)檢測(cè)蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)、環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP Response Element Binding Protein,CREB)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B Cell Lymphoma 2,Bcl-2)、髓樣細(xì)胞白血病-1(Myeloid Cell Leukemia-1,Mcl-1)的mRNA表達(dá)將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種在6孔板中,細(xì)胞在造模治療結(jié)束后,每孔加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞,隨后使用萃取法提取總mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件：95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,34 s,40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增引物序列見表1,熔解反應(yīng)按ABI 7500儀器設(shè)定條件進(jìn)行。2-△△CT法對(duì)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 引物序列設(shè)計(jì)

1.3.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β與IL-6含量 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,離心20 min(2 000～3 000 r/min、離心半徑10 cm)進(jìn)行細(xì)胞分泌物成分檢測(cè);標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣;分別設(shè)空白孔,待測(cè)樣品孔,在酶標(biāo)板上待測(cè)樣品孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液40 μL,然后再加待測(cè)樣品10 μL;37 ℃溫育30 min;洗滌5次;每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL;溫育洗滌5次;每孔加入顯色劑A,B各50 μL,振蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min;每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng);以空白孔調(diào)零,450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔OD值。

2 結(jié)果

2.1 定喘湯成分篩選 通過篩選最后得到中藥有效成分相關(guān)靶點(diǎn)共274個(gè),其中杏仁19個(gè)、紫蘇子16個(gè)、白果21個(gè)、半夏13個(gè)、甘草92個(gè)、黃芩36個(gè)、款冬花22個(gè)、麻黃23個(gè)、桑白皮32個(gè)。

2.2 定喘湯與疾病靶點(diǎn)篩選 通過篩選最后得到14 789個(gè)有效成分,其中杏仁943個(gè)、紫蘇子883個(gè)、白果1 568個(gè)、半夏1 302個(gè)、甘草2 506個(gè)、黃芩1 203個(gè)、款冬花1 088個(gè)、麻黃3 921個(gè)、桑白皮1 375個(gè)。去除重復(fù),共有314個(gè)。在5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)COPD相關(guān)靶點(diǎn)篩選,得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)共有7 899個(gè)。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)6 369個(gè)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)353個(gè)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)64個(gè)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)869個(gè)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)244個(gè)。運(yùn)用R語(yǔ)言得到藥物與疾病的靶點(diǎn)交集共262個(gè),并繪制韋恩圖。見圖1。

圖1 COPD與定喘湯交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)組成復(fù)方的中藥、化合物、核心靶點(diǎn)以及疾病信息構(gòu)建定喘湯的“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖?？梢钥闯龆ù瓬ㄟ^調(diào)控CDKN1A、SP1、EGFR、FOXO1、MAPK14、AKT1等實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)-多化合物共同調(diào)控整個(gè)COPD的治療過程。見圖2。

圖2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI構(gòu)建 通過String數(shù)據(jù)庫(kù),獲得PPI關(guān)系圖。見圖3。再對(duì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析得出核心網(wǎng)絡(luò)。見圖4。依據(jù)Degree值由高到低排序依次為CDKN1A(42)、SP1(40)、EGFR(38)、FOXO1(38)、MAPK14(36)、AKT1(36)、MAPK3(36)、NR3C1(34)、JUN(34)、CCND1(34)、MAPK1(32)、MAPK8(32)、CTNNB1(26)、CEBPA(24)、NFKBIA(24)、ESR1(22)、STAT1(22)、RELA(22)、MYC(20)、TP53(20)、FOS(18)、RB1(18)、HIF1A(18)、STAT3(18)、PPARA(16)。

圖3 COPD-定喘湯交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集及KEGG通路分析

2.5.1 GO富集分析 通過GO富集分析散點(diǎn)圖。見圖5。分析得出基因參與的BP為對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對(duì)化學(xué)應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)、衰老、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、對(duì)乙醇的反應(yīng)、對(duì)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的反應(yīng)等;CC為膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、胞漿囊泡腔、質(zhì)膜筏、小窩、蛋白激酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白-依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等;MF為脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性,RNA聚合酶Ⅱ-特異性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、核受體活性、配體-活化轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合等。

圖5 GO富集分析氣泡圖

2.5.2 KEGG通路分析 通過富集分析發(fā)現(xiàn),定喘湯治療COPD信號(hào)通路主要包含炎癥相關(guān)通路、病毒感染通路、免疫信號(hào)通路、代謝過程等通路的改變,以P<0.05,Count值為標(biāo)準(zhǔn),取排名靠前,制作柱狀圖。見圖6。相關(guān)度最高的通路包括：脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、乙型肝炎、MAPK信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活、丙型肝炎、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、前列腺癌等。本研究共得出信號(hào)通路180條,本實(shí)驗(yàn)將研究目標(biāo)定位在與炎癥反應(yīng)相關(guān)的PI3K-AKT信號(hào)通路。見圖7。

圖6 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖7 PI3K-AKT信號(hào)通路示意圖

2.6 分子對(duì)接 將影響核心基因AKT1該基因的藥物成分quercetin與kaempferol分別與AKT1的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對(duì)接。見圖8。

圖8 定喘湯成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接(AKT1-kaempferol),(AKT1-quercetin)

2.7 定喘湯抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HAECⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)后,LPS組CCK8數(shù)值顯著降低,顯示了LPS的細(xì)胞毒性反應(yīng),而定喘湯可以顯著增加HAEC可細(xì)胞狀態(tài)與活力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中定喘湯中劑量組效果最為顯著。見表2。

表2 不同組別HAEC效細(xì)胞CCK8表達(dá)

2.8 定喘湯干預(yù)AKT、CREB、Bcl-2、Mcl-1的mRNA

表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較,LPS組HAEC組細(xì)胞AKT、Mcl-1 mRNA含量顯著增高,CREB、Bcl-2含量顯著降低(P<0.05);與LPS組比較,定喘湯中劑量組能夠顯著降低AKT、Mcl-1的mRNA表達(dá),升高CREB、Bcl-2的mRNA表達(dá)(P<0.05)。見表3。

表3 各組別AKT、CREB、Bcl-2、Mcl-1的mRNA表達(dá)

2.9 定喘湯減輕HAEC輕細(xì)胞IL-1β與IL-6炎癥介質(zhì)的分泌 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LPS組與空白組比較,IL-1β比、IL-6含量顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與LPS組比較,定喘湯中、高劑量組能夠顯著降低HAEC降細(xì)胞液中IL-1降、IL-6含量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同組別HAECⅡ細(xì)胞液IL-1β,IL-6含量

3 討論

COPD已經(jīng)成為全球性衛(wèi)生問題,也是導(dǎo)致我國(guó)居民肺部疾病死亡的主要原因之一,國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究均已證實(shí)煙草煙霧、空氣污染會(huì)導(dǎo)致肺組織內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)氧化應(yīng)激,不僅造成氣道氧化損傷,使得氣道炎癥反應(yīng)加劇,還會(huì)因此引起氣道重塑、氣流受限,導(dǎo)致肺功能受損。

定喘湯起源于《攝生眾妙方》,含有黃芩、麻黃、紫蘇子、甘草、桑白皮、款冬花、白果、杏仁、半夏9味中草藥,具有清肺降氣、化痰清熱的功效[4]。方中炙麻黃與白果兩藥合用既能增強(qiáng)平喘之功又能防麻黃辛散太過耗傷肺氣,一散一收、相反相成共為君藥[5]。麻黃主升,杏仁主降,升降相合。紫蘇子、杏仁還能潤(rùn)腸通便,肺與大腸相表里,大腸通,肺氣亦通。桑白皮、黃芩二者可制約麻黃之溫。杏仁、紫蘇子、款冬花、半夏皆能降氣平喘化痰止咳,還可防麻黃過于耗散[6]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索出定喘湯與COPD的相關(guān)靶點(diǎn)共262個(gè),通過構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)、GO富集分析和KEGG富集通路分析可以預(yù)測(cè)出定喘湯通過AKT1、STAT1、RELA、MYC、FOS、HIF1A、PPARA等基因,調(diào)控PI3K-AKT、Lipid and atherosclerosis等相關(guān)信號(hào)通路,從而減輕氣道炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能來達(dá)到治療的目的。其中GO富集分析表明,定喘湯治療COPD機(jī)制可能包含如下方面。1)氧化應(yīng)激：在COPD中存在氧化和羰基應(yīng)激,尤其是在急性加重期。COPD患者的肺泡巨噬細(xì)胞更加活躍,并以超氧化物自由基和過氧化氫的形式釋放更多的ROS[7]。ROS通過激活核因子κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)和激活蛋白-1(Activating Protein-1,AP-1)產(chǎn)生氣道炎癥反應(yīng)[8-9],導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。ROS還通過加強(qiáng)組胺的作用直接招募炎癥細(xì)胞,如嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,從而損傷肺組織并引起炎癥反應(yīng)[10]。同樣,COPD患者的外周血嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞釋放更多的ROS,尤其是在急性加重期間。COPD中氧化應(yīng)激和羰基應(yīng)激的標(biāo)志包括硝基酪氨酸濃度升高[11]。氧化應(yīng)激可在多種水平上激活NF-κB信號(hào)通路,COPD患者的NF-κB表達(dá)和激活增加,并與氣流受限相關(guān)[12]。2)氣道炎癥：炎癥細(xì)胞是超氧化物最重要的產(chǎn)生者,組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone Acetyltransferase,HAT)從組蛋白核心解螺旋DNA轉(zhuǎn)錄,而組蛋白脫乙酰酶(Histone Deacetylase,HDAC)通常的功能是通過羧基化和硝化過程(通過硝基酪氨酸的形成)縮回組蛋白核心的DNA以停止轉(zhuǎn)錄,ROS降低HDAC的活性,并可能增加HDAC的活性,ROS誘導(dǎo)HDAC2減少可能是糖皮質(zhì)激素敏感性降低的原因[13],作為調(diào)節(jié)HAT和HDAC的結(jié)果,ROS引起炎癥介質(zhì)基因如腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、IL-1和IL-8、NF-κB和AP-1的過量表達(dá),導(dǎo)致炎癥細(xì)胞進(jìn)一步募集,特別是嗜中性粒細(xì)胞和肺泡中的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS/RNS,給肺部帶來更多的氧化負(fù)擔(dān)。

PI3K及其下游介質(zhì)在COPD的肺和氣道重塑過程中上調(diào)[14]。COPD進(jìn)展過程中PI3K信號(hào)介導(dǎo)的差異表達(dá)意味著它們?cè)谶@種病理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。PI3K信號(hào)的任何失調(diào)不僅會(huì)激活控制轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生,這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)關(guān)鍵的炎癥介質(zhì),如精氨酸酶-1和IL-10,并抑制促炎標(biāo)志物的產(chǎn)生[15],還會(huì)影響肺泡免疫細(xì)胞,導(dǎo)致免疫反應(yīng)過度[16-17]。這種異常增強(qiáng)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)。這是COPD的特征。PI3K間接激活A(yù)KT,AKT是一種關(guān)鍵的蛋白激酶,在COPD中具有廣泛的下游靶點(diǎn)。AKT活化與PI3K活化相關(guān),與磷酸酶和張力蛋白同源物(Phosphatase and Tensin Homolog,PTEN)活性負(fù)相關(guān)。重要的是,PTEN在COPD患者的氣道上皮細(xì)胞和外周肺組織中下調(diào)。此外,吸煙后ROS生成下調(diào)PTEN,增強(qiáng)AKT磷酸化,反之亦然。支氣管上皮細(xì)胞中PTEN水平的降低也增加了單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1)和IL-8趨化因子、IL-6和其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和分泌,通過增強(qiáng)的PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)慢性炎癥反應(yīng)[18-19]。

ROS引起上皮細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化,損害膜功能并增加細(xì)胞的滲透性[20],從而誘導(dǎo)組織損傷。由脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成的丙烯醛和4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxyl-2-nonenal,4-HNE)等活性醛會(huì)對(duì)上皮細(xì)胞造成損害,這些對(duì)氣道上皮的損傷降低了上皮對(duì)吸入的氧化劑和其他損傷的保護(hù)能力,加劇了炎癥反應(yīng)[21]。在正常生理狀態(tài)下,Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(TypeⅡ Alveolar Epithelial Cells,AECⅡ)主要通過分泌肺泡表面活性物質(zhì)來維持肺泡表面張力[22]。在肺泡上皮細(xì)胞被有害因素刺激時(shí),AECⅡ可增殖分化為I型肺泡上皮細(xì)胞,修復(fù)受損的肺泡結(jié)構(gòu)。因此,人們普遍認(rèn)為AECⅡ是肺組織內(nèi)具有干性功能的肺泡上皮細(xì)胞[23]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn),在肺氣腫患者肺組織分離的AECⅡ細(xì)胞中,DNA損傷及修復(fù)功能出現(xiàn)明顯異常[24-25],表明AECⅡ參與了肺氣腫表型患者肺泡結(jié)構(gòu)的破壞過程。細(xì)胞凋亡是COPD重要的發(fā)病機(jī)制之一,其作用增強(qiáng)將導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞數(shù)量減少及功能障礙,常成為炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等致病機(jī)制作用的共同路徑[26]。所以,本次選用AECⅡ?yàn)閷?shí)驗(yàn)細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,定喘湯通過AKT1來調(diào)控AKT活化,進(jìn)一步影響PI3K活化,使支氣管上皮細(xì)胞中的炎癥介質(zhì)(IL-1β,IL-6)顯著減少,達(dá)到抗炎的作用。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式,通過對(duì)定喘湯各成分與COPD的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究,初步闡釋了定喘湯治療COPD的主要藥物成分、相關(guān)靶點(diǎn)以及有關(guān)通路,可以通過調(diào)整炎癥反應(yīng)和炎癥介質(zhì)等發(fā)揮治療作用。本文從分子對(duì)接技術(shù)和體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)2個(gè)方面驗(yàn)證,使研究結(jié)果具有指導(dǎo)意義,為中醫(yī)藥治療COPD的研究提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突聲明：無。