紅瑞木果多糖抗氧化活性的初步研究 *

高長久 李文超 張朝立 孟令鍇 王春輝

（牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

紅瑞木果（Swida albaOpiz）始載于《中華本草》，為山茱萸科山茱萸屬（梾木屬）植物紅瑞木［紅瑞山茱萸（Cornus albaL.）］的果實。紅瑞木的樹皮、枝葉和果實均可入藥，其果實入藥具有滋腎強壯等功效，主治腎虛腰痛、體弱羸瘦等病證［1］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其化學(xué)成分主要有黃酮類、多糖、苷類、酚酸、花青素、氨基酸等［2-5］，具有抑菌、抑酶、抗癌等藥理作用［6，7］。本研究采用羥基自由基（·OH）清除實驗、二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）清除實驗和三價鐵離子（Fe3+）還原實驗對紅瑞木果多糖的抗氧化活性進行評價，為其后續(xù)研究及開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑紅瑞木果多糖采用超聲輔助提取法從紅瑞木果中水提而得。正丁醇（浙江天諾化學(xué)有限公司，批號20211220）；三氯甲烷（南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號20221015）；DPPH·（上海麥克林生化科技有限公司，批號20230228）；雙氧水（H2O2）（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號20230517A）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（上海尚寶生物科技有限公司，批號20230608）；三氯化鐵（無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司，批號20220930）；抗壞血酸（Vc）（批號20220526）、硫酸亞鐵（FeSO4）（批號20211020）、水楊酸（批號20220618）、無水乙醇（批號20230112）、鐵氰化鉀（批號20230409）、三氯乙酸（批號20221201），均由福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 實驗儀器電子天平（廈門萊斯德科學(xué)儀器有限公司，型號QL620）；紫外可見分光光度計（山東霍爾德電子科技有限公司，型號HD-UV90）；多用途恒溫超聲波提取機（江蘇天翎儀器有限公司，型號TL-650CT）；高速離心機（青島精誠儀器儀表有限公司，型號JC-12L）；恒溫水浴鍋（上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司，型號HHWO2L）；漩渦混勻器（上海靳瀾儀器制造有限公司，型號JL-S）。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅瑞木果多糖預(yù)處理以功率400 W、時間6 min、溫度50 ℃、液料比25∶1 g/mL 的最佳條件對紅瑞木果進行水提，然后合并糖液并旋蒸濃縮。向糖液中加入Sevage試劑（正丁醇∶三氯甲烷=1∶3）并劇烈攪拌，再置于分液漏斗中靜置12 h，將底層蛋白液倒掉，直至不再出現(xiàn)蛋白層。將除蛋白后的多糖溶液濃縮到200 mL，裝入透析袋中透析。透析后的多糖溶液置于5000 mL 的大燒杯中，加滿無水乙醇，醇沉12 h 后離心（轉(zhuǎn)速：4000 r/min，時長：5 min，離心半徑：15 cm），留沉淀，晾干即得紅瑞木果多糖。取適量紅瑞木果多糖用蒸餾水配制濃度范圍為0.25～1.50 mg/mL 的多糖樣液，濃度梯度為0.25 mg/mL，即得0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL的紅瑞木果多糖樣液。

1.3.2 紅瑞木果多糖對DPPH·清除能力的測定參照鄧永蓉等［8］的方法，并作部分改動。取6 支試管，向各試管中分別加入2 mL 已配制好的6 個濃度梯度紅瑞木果多糖樣液，再向各試管分別加入2 mL 的DPPH·溶液（0.1 mmol/L），充分振蕩混勻，25 ℃避光水浴30 min，紫外517 nm 分別測定各支試管內(nèi)混合溶液的吸光度值，即得樣本吸光度值（A1）；其余操作不變，僅把多糖樣液替換為2 mL 的蒸餾水，即得陰性對照吸光度值（A0）；僅把DPPH·溶液替換為2 mL 的蒸餾水，即得樣本吸光度值（A2）。平行測定3次，選擇Vc作為陽性對照。

多糖對DPPH·清除率計算公式：DPPH·清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%。

公式中：A0為DPPH·+蒸餾水的吸光度，A1為多糖樣液+DPPH·的吸光度，A2為多糖樣液+蒸餾水的吸光度。

1.3.3 紅瑞木果多糖對·OH 清除能力的測定參照劉宇等［9］的方法，并作部分改動。取6支試管，向各試管中分別加入1 mL 的H2O2溶液（9 mmol/L）、1 mL 的FeSO4溶液（9 mmol/L）、1 mL 的蒸餾水和1 mL 的水楊酸無水乙醇溶液（9 mmoL），再向各試管中分別加入1 mL 已配制好的6個濃度梯度紅瑞木果多糖樣液；充分振蕩混合，37 ℃水浴35 min，紫外510 nm 下檢測樣本吸光度值（A1）；其余操作不變，僅把多糖樣液替換為1 mL 的蒸餾水，即得陰性對照吸光度值（A0）；僅把水楊酸溶液替換為1 mL 的蒸餾水，即得樣本吸光度值（A2）。平行測定3次，選擇Vc作為陽性對照。

多糖對·OH 清除率公式：·OH 清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%。

公式中：A0為水楊酸+蒸餾水的吸光度，A1為多糖樣液+水楊酸的吸光度，A2為多糖樣液+蒸餾水的吸光度。

1.3.4 紅瑞木果多糖對Fe3+還原力的測定參照薛小蘭等［10］的方法，并作部分改動。取6支試管，向各試管中分別加入1 mL 已配制好的6 個濃度梯度紅瑞木果多糖樣液，再向各試管中分別加入1 mL的PBS溶液（0.2 mol/L，pH 值=6.6）和1 mL 的鐵氰化鉀溶液（1%），50 ℃水浴25 min 后用冰塊快速冷卻，再分別向各試管中加入1 mL的三氯乙酸溶液（10%），充分振蕩混合，離心（轉(zhuǎn)速：3600 r/min，時長：10 min，離心半徑：15 cm），取上清液0.1 mL 置于另外的干凈長試管中，再向每個試管中加入3 mL 的蒸餾水和1 mL 的三氯化鐵溶液（0.1%），混合均勻，紫外700 nm 下檢測樣本吸光度值（A1）；其余操作不變，僅把多糖樣液替換為1 mL的蒸餾水，即得陰性對照吸光度值（A0）。平行測定3 次，選擇Vc 作為陽性對照。

多糖對Fe3+還原力公式：Fe3+還原力=A1-A0。

公式中：A0為三氯化鐵+蒸餾水的吸光度，A1為多糖樣液+三氯化鐵的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 紅瑞木果多糖對DPPH·的清除率在0.25～1.50 mg/mL 濃度范圍內(nèi)的紅瑞木果多糖溶液和Vc 溶液對DPPH·的清除率見圖1。紅瑞木果多糖和Vc 對DPPH·均有較好的清除能力，其清除率隨著濃度的增加而提高。當(dāng)紅瑞木果多糖溶液和Vc 溶液濃度達到1.5 mg/mL 時，二者清除率達到該濃度范圍內(nèi)的最大值，分別為79.3%和97.5%。

圖1 紅瑞木果多糖和Vc對DPPH·的清除率

2.2 紅瑞木果多糖對·OH的清除率在0.25～1.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)的紅瑞木果多糖溶液和Vc溶液對·OH的清除率見圖2。紅瑞木果多糖和Vc 對·OH 均有較好的清除能力，其清除率隨著濃度的增加而提高。當(dāng)紅瑞木果多糖溶液和Vc 溶液濃度達到1.5 mg/mL 時，二者清除率達到該濃度范圍內(nèi)的最大值，分別為60.6%和94.8%。

圖2 紅瑞木果多糖和Vc對·OH的清除率

2.3 紅瑞木果多糖對Fe3+的還原力在0.25～1.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)的紅瑞木果多糖溶液和Vc 溶液對Fe3+的還原力見圖3。紅瑞木果多糖和Vc 對Fe3+均有較好的還原能力，其還原力隨著濃度的增加而提高。當(dāng)紅瑞木果多糖和Vc濃度達到1.50 mg/mL時，二者還原力達到該濃度范圍內(nèi)的最大值，分別為0.565和0.856。

圖3 紅瑞木果多糖和Vc對Fe3+的還原力

3 討論

多糖（Polysaccharide）又稱多聚糖，在自然界廣泛分布于植物、動物和微生物中，是自然界含量最豐富的生物聚合物。天然多糖包括植物多糖、動物多糖和微生物多糖，是構(gòu)成細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的四大基本物質(zhì)之一，是一類具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗炎、抗疲勞和抗衰老等生物活性的生物大分子［11］。本研究主要采用·OH 和DPPH·清除實驗及Fe3+還原實驗對紅瑞木果多糖的抗氧化活性進行評價［12］。

初步研究發(fā)現(xiàn)，紅瑞木果多糖對DPPH·、·OH 具有不同程度的清除作用，對Fe3+具有還原作用，且存在明顯的量效關(guān)系。當(dāng)紅瑞木果多糖濃度達到1.50 mg/mL時，對兩種自由基的清除率分別為79.3%、60.6%，對Fe3+的還原力為0.565。表明紅瑞木果多糖具有一定的抗氧化活性，將來可能開發(fā)為一種有效的天然抗氧化劑。但由于本研究中紅瑞木果多糖為粗提物，對結(jié)果可能會有影響。所以，在本研究初步確定紅瑞木果多糖抗氧化活性的基礎(chǔ)上，今后將對粗多糖進行分離和純化，篩選出具有抗氧化活性的部位或單體，為今后紅瑞木果多糖的應(yīng)用提供依據(jù)。