藤黃健骨膠囊通過SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號通路抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠成骨細胞凋亡

安方玉, 王霞霞, 顏春魯,3)*, 孫 柏, 汪春梅, 柳 穎, 常偉榮, 宋佳眙, 王玉潔, 馬海珍, 張 蕊, 陳振東, 袁萬英

(1)甘肅中醫(yī)藥大學教學實驗實訓中心, 蘭州 730000;2)甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院中醫(yī)外科教研室, 蘭州 730000;3)甘肅省中醫(yī)藥研究中心, 蘭州 730000;4)甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院免疫教研室, 蘭州 730000;5)甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學教學部, 蘭州 730000;6)定西市中醫(yī)醫(yī)院, 甘肅 定西 743099)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種中老年女性絕經(jīng)后最常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松,該類患者絕經(jīng)后卵巢分泌的雌激素減少,導致全身骨骼發(fā)生骨流失,其發(fā)病機制是破骨細胞介導的骨吸收大于成骨細胞介導的骨形成,破壞骨穩(wěn)態(tài),造成了骨丟失[1]。沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(silent mating type information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是一種NAD+依賴性脫乙酰酶,已有研究發(fā)現(xiàn),SIRT1在骨質(zhì)疏松患者骨組織中呈低表達[2],在外周血單核細胞中活性也顯著降低[3],因此,SIRT1與骨質(zhì)疏松密切相關。另有研究表明,去卵巢(ovariectomized,OVX)大鼠股骨組織中SIRT1表達下降,補充雌激素后其表達量迅速回升,表明SIRT1的表達水平與雌激素呈正相關[4]。因此,作為雌激素缺乏誘發(fā)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松,SIRT1是參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病的關鍵分子,但SIRT1調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的具體機制尚不清楚。

中醫(yī)認為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松屬于“骨痹”和“骨枯”等范疇[5],其主要病理機制以“腎虛精虧”為本,“瘀血阻絡”為標,因此,中醫(yī)治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松遵循“補腎壯骨,活血通絡”的原則。本研究選用具有“補腎活血”作用的藤黃健骨膠囊(tenghuangjiangu capsule,TJC),其主要由熟地黃、鹿銜草、骨碎補(燙)、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤和萊菔子等組成,諸藥合用,具有“補腎壯骨,活血止痛”的功效。本課題組前期研究表明,藤黃健骨膠囊具有類雌激素的作用,對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有明確療效[6],但其治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的具體機制仍不明確。綜上,本文通過藤黃健骨膠囊干預去卵巢大鼠模型(PMOP大鼠),觀察其對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號通路中關鍵分子表達的影響,闡明藤黃健骨膠囊通過SIRT1信號通路調(diào)控骨代謝的機制,為臨床上防治PMOP提供實驗與理論依據(jù),同時為中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用12周齡SD雌性大鼠60只,體重200±20 g,購自甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物繁殖中心,實驗動物質(zhì)量合格證編號:SCXK(甘)2020-0001。該實驗嚴格遵循甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會制定的原則進行。

1.2 藥物與試劑

藤黃健骨膠囊(甘肅省西峰制藥有限責任公司,規(guī)格0.25 g/粒,批號:210108);戊酸雌二醇片(estradiol valerate tablets,ESV)(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,規(guī)格1 mg/片,批號:676A);SIRT1兔單克隆抗體和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor-γ co activation factor-1α,PGC-1α)兔單克隆抗體(Abcam,批號分別為:GR3283936-26和GR328393626);GAPDH、核因子-E2相關因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)、Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)和胱天蛋白酶9(caspase-9)兔單克隆抗體(Immuno Way,批號分別為:014121、138901、135601和136201);Bcl-2和胱天蛋白酶(caspase-3)兔單克隆抗體(Gene Tex,批號分別為:42970和822105972);TUNEL染色試劑盒(Elabsocience,批號:AK0584ZN2627)。

1.3 實驗儀器

Arcadia C型生物組織石蠟包埋機(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司);IX51型數(shù)碼顯微鏡(日本OLYMPUS);Quantstudio3熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientifc);Chemi Doc XRS凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD)。

1.4 藥物劑量換算

藤黃健骨膠囊(TJCs)的人用劑量是2 g/d,人(70 kg)與大鼠(200 g)的體表面積系數(shù)0.018計算得:2 g/d×0.018/0.2 kg=0.18 g/kg/d,此劑量為藤黃健骨膠囊的中劑量。則藤黃健骨膠囊的干預劑量分別為:高劑量(hTJC)0.36 g/kg/d、中劑量(mTJC)0.18 g/kg/d、低劑量(lTJC)0.09 g/kg/d。陽性對照藥戊酸雌二醇片的人用劑量是1 mg/d,同樣換算得:1 mg×0.018/0.2 kg=0.09 mg/kg/d,依此劑量為戊酸雌二醇片的干預劑量,作為陽性對照。

1.5 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型構建

依據(jù)參考文獻[7],PMOP大鼠模型構建步驟如下:大鼠麻醉后,采取俯臥位,備皮后消毒手術區(qū)皮膚;沿背部后正中線作縱形切口長約1.0～1.5 cm,找到卵巢并結(jié)扎子宮角后摘除卵巢,然后傷口逐層縫合,同樣方式切除對側(cè)卵巢。而假手術組大鼠只切卵巢附近白色脂肪組織,注意術后保溫。

1.6 動物分組及干預

建模8周時,大鼠隨機分為去卵巢模型組(OVX)、陽性對照組(ESV)、不同劑量TJC治療組(hTJC、mTJC、lTJC),每組10只,另外設置10只作為假手術組(Sham)。陽性對照組和TJC治療組分別給予相應藥物灌胃,假手術組和模型組則給予蒸餾水灌胃,連續(xù)灌胃2月。干預結(jié)束后手術完整切取大鼠左側(cè)和右側(cè)整個股骨組織,TUNEL染色觀察成骨細胞的凋亡情況;qPCR檢測SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子基因轉(zhuǎn)錄水平變化;雙重免疫熒光染色和Western印跡觀察SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子蛋白質(zhì)水平等。

1.7 TUNEL染色觀察成骨細胞的凋亡情況

將切片浸入蛋白酶K工作液37 ℃ 20 min;加入100 μL TdT 平衡緩沖液(equilibration buffer) 37 ℃ 20 min,加入50 μL標記工作液,37 ℃避光反應60 min;加DAPI工作液,室溫下避光反應5 min,對細胞核進行復染;PBS洗滌后用含抗熒光淬滅劑的封片劑進行封片。熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。DAPI染色的細胞核呈藍色,陽性凋亡細胞呈綠色。使用Image J分析軟件分別進行總細胞(藍色)和凋亡細胞(綠色)計數(shù);凋亡率為凋亡細胞數(shù)目/總細胞數(shù)×100%。

1.8 雙重免疫熒光染色觀察SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子表達變化

骨鈣素(osteocalcin,BGP)為成骨細胞特異性標志物,采用雙重免疫熒光分別檢測大鼠股骨組織中BGP蛋白與SIRT1、PGC-1α、Nrf2蛋白質(zhì)共表達的情況,具體方法如下:將切片置于3%的H2O2避光10 min;100 mmol甘氨酸中和15 min;封閉液室溫封閉1 h;棄封閉液后在切片組織上同時滴加BGP抗體(1∶200)和SIRT1(1∶100)/PGC-1α(1∶100)/Nrf2(1∶100)4 ℃孵育過夜;滴加二抗室溫避光孵育l h;然后用DAPI染核3 min,用PBS-Triton洗3次再用抗熒光淬滅劑封片;熒光倒置掃描顯微鏡觀察,Image J分析數(shù)據(jù)。判定標準根據(jù)試劑說明書:BGP呈綠色,SIRT1、PGC-1α、Nrf2呈紅色,DIPA細胞核呈藍色,雙染的共定位陽性細胞經(jīng)疊加后呈黃色。

1.9 qPCR測定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子轉(zhuǎn)錄水平變化

Trizol試劑提取右側(cè)股骨組織及股骨細胞中總RNA,使用YEASEN公司生產(chǎn)的試劑盒和實時熒光定量分析試劑盒分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進行qPCR目的基因的擴增反應,分析SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達。2-△△Ct法量化SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、NFATc1和Runx2相對表達水平。qPCR反應引物見Table1。

1.10 Western印跡測定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子表達變化

稱取0.1 g股骨組織,加入1 000 μL RIPA裂解液(980 μL RIPA+20 μL PMSF)12 000 r/min離心,所得上清液為總蛋白質(zhì);依據(jù)BCA試劑盒說明書測定各組樣品中的蛋白質(zhì)濃度,加入4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液,將各組樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜;用TBS-T緩沖液(含5%脫脂奶粉)在37 ℃將PVDF膜封閉1 h,滴加封閉液稀釋的一抗SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9于PVDF上,一抗工作液與PVDF膜4 ℃過夜孵育;第2 d,TBS-T緩沖液洗膜后加入二抗工作液室溫孵育1 h;使用ECL發(fā)光底物進行化學發(fā)光顯色,用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)拍照。用Image J圖像分析軟件進行處理與分析。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 藤黃健骨膠囊抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠成骨細胞凋亡

TUNEL染色觀察絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠股骨組織成骨細胞的凋亡情況,結(jié)果如Fig.1和Table 1所示。Sham組大鼠股骨組織中有少量綠色凋亡陽性細胞,OVX組大鼠股骨組織中出現(xiàn)大量綠色凋亡陽性細胞、其凋亡率(均值為85.86)比Sham組明顯增加(均值為38.28);而ESV組和hTJC組、mTJC組、lTJC組大鼠股骨組織中綠色凋亡陽性細胞均減少,其細胞凋亡率(均值為56.91、64.79、72.68、73.80)比OVX組明顯減少(均值為85.86),尤以ESV組和hTJC組綠色凋亡陽性細胞、細胞凋亡率減少最明顯。提示藤黃健骨膠囊可以抑制股骨組織成骨細胞的凋亡。

Fig.1 The effects of TJC on the osteoblastic apoptosis in rats with postmenopausal osteoporosis

Table 1 Effects of TJC on the apoptosis rate of osteoblast in rats with postmenopausal n=6)

2.2 藤黃健骨膠囊增強絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠成骨細胞SIRT1、PGC-1α、Nrf2免疫熒光強度

用雙重免疫熒光染色法,觀察SIRT1、PGC-1α和Nrf2在股骨成骨細胞中的表達情況(雙染共定位呈黃色),結(jié)果如圖Fig.2和Fig.3所示。與Sham組相比,SIRT1、PGC-1α和Nrf2在OVX組大鼠股骨成骨細胞中的表達(均值為4.47、6.17、2.84)均明顯低于Sham組(均值為33.28、14.43、17.84);PGC-1α在ESV組和hTJC組、mTJC組大鼠股骨成骨細胞中的表達(均值為12.23、11.27、9.07)均明顯高于OVX組(均值為6.17),SIRT1和Nrf2在ESV組和hTJC組、mTJC組、lTJC組大鼠股骨成骨細胞中的表達(均值為25.74/13.56、19.37/18.21、16.20/12.63、9.00/5.52)均明顯高于OVX組(均值為4.47/2.84)。提示藤黃健骨膠囊抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠成骨細胞凋亡與SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號軸有關。

Fig.2 The effects of TJC on the SIRT1, PGC-1α, Nrf2 protein expression of osteoblasts in rats with postmenopausal osteoporosis

Fig.3 The effects of TJC on the SIRT1, PGC-1α, Nrf2 fluorescence area of osteoblasts (BGP) in rats with postmenopausal osteoporosis

2.3 藤黃健骨膠囊對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子mRNA表達變化的作用

qPCR測定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果如Fig.4所示。與Sham組相比,OVX組股骨組織中STRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2和Bcl-2等mRNA的表達水平均明顯降低,而胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9等mRNA的表達水平明顯升高(P<0.01);與OVX組相比,ESV組和hTJC組、mTJC組Runx2 mRNA的表達水平明顯升高,ESV組和hTJC組、mTJC組、lTJC組STRT1、PGC-1α、Nrf2和Bcl-2等mRNA的表達水平均明顯升高,而胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9等mRNA的表達水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。提示藤黃健骨膠囊在轉(zhuǎn)錄水平通過激活絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號關鍵分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2、Runx2的表達,同時抑制該通路的胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的表達來抑制其成骨細胞凋亡。

Fig.4 The effects of TJC on the mRNA expression levels of key molecules of SIRT1/PGC-1α/Nrf2 pathway in rats with postmenopausal osteoporosis

2.4 藤黃健骨膠囊對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子蛋白質(zhì)表達的影響

利用Western印跡測定SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路關鍵分子蛋白質(zhì)表達的變化,結(jié)果如Fig.5所示。與Sham組相比,模型組股骨組織中SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2和Bcl-2等分子表達水平均明顯降低,而胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9等分子表達水平則均明顯升高(P<0.01);與模型組相比,ESV組和hTJC組、mTJC組Nrf2和Runx2等分子表達水平均明顯升高,而胱天蛋白酶9分子表達明顯降低,ESV組和TJC組、mTJC組、lTJC組SIRT1、PGC-1α和Bcl-2等分子表達水平也均明顯升高,而胱天蛋白酶3分子表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。提示藤黃健骨膠囊在翻譯水平通過激活絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型鼠SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號關鍵分子SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2、Runx2的表達,同時抑制該通路的胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的表達來抑制其成骨細胞凋亡。

Fig.5 The effects of TJC on the protein expression levels of key molecules of SIRT1/PGC-1α/Nrf2 pathway in rats with postmenopausal osteoporosis

3 討論

利用祖國醫(yī)學結(jié)合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病特點,將其歸屬“骨痹”范疇,認為其主要病機以“腎虛精虧”為本,“瘀血阻絡”為標,當以“補腎活血”為根本[8,9]。藤黃健骨膠囊方中重用君藥熟地黃,能夠發(fā)揮滋陰補血、益精填髓之功效;淫羊藿、肉蓯蓉、骨碎補和鹿銜草等作為臣藥合用具有補腎強骨、益精生髓、除濕止痛之功效;佐藥雞血藤能夠發(fā)揮補腎益精、通經(jīng)活血之功效;使藥萊菔子可以發(fā)揮理氣健骨之功效;諸藥合用,共湊補腎精填和活血止痛的功效[10]。課題組前期研究結(jié)果已證實,藤黃健骨膠囊能夠通過改變OVX模型大鼠股骨生物力學性能來修復其骨微結(jié)構的破壞[6],但具體的調(diào)控機制未明。

在正常情況下,骨組織中成骨細胞和破骨細胞處于動態(tài)平衡以維持骨代謝穩(wěn)態(tài);而絕經(jīng)期女性因卵巢功能衰退引起雌激素水平下降,使得成骨細胞減少、破骨細胞增多,破壞了成骨與破骨的平衡,導致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[11,12]。研究結(jié)果證實,SIRT1是調(diào)控成骨細胞與破骨細胞穩(wěn)態(tài)的關鍵分子[13]。目前也有研究證實,骨質(zhì)疏松患者血清中SIRT1表達量較健康體檢者顯著下降[14]。本研究結(jié)果也證實,OVX模型鼠SIRT1的表達在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平均顯著降低,且雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示其成骨細胞中SIRT1的熒光表達面積也顯著降低,與上述述研究報道結(jié)果一致。而藤黃健骨膠囊可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。但是SIRT1的下調(diào)具體是通過什么樣的分子機制來調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松成骨細胞與破骨細胞之間的穩(wěn)態(tài),藤黃健骨膠囊治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是否與SIRT1有關,目前尚未深入研究。

SIRT1和PGC-1α等分子是PGC-1α/Nrf2信號通路的重要組成成分[15]。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1的激活能上調(diào)PGC-1α的表達,從而促進成骨分化,推測SIRT1作為PGC-1α的上游調(diào)控因子來發(fā)揮促進成骨分化的作用[16-18]。其他研究結(jié)果進一步證實,SIRT1可以調(diào)節(jié)成骨細胞的凋亡來影響其骨形成[19,20]。Liu等人發(fā)現(xiàn),SIRT1抑制劑EX527通過抑制SIRT1來抑制SIRT3的活性并促進p66Shc表達,增強細胞內(nèi)活性氧水平,促進H2O2誘導的成骨細胞凋亡[21]。Wang等人提出,激活PGC-1α/Nrf2通路,可提高抗氧化應激能力,并參與炎癥反應、細胞凋亡等生物過程[22],其他研究也發(fā)現(xiàn),PGC-1α同時可以激活Nrf2的表達[23,24]。本研究結(jié)果也顯示,OVX模型鼠SIRT1、PGC-1α、Nrf2的表達在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平均顯著降低,且雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示,其成骨細胞中SIRT1、PGC-1α、Nrf2的熒光表達面積也均明顯升高,這一結(jié)果與上述研究報道趨于一致。而藤黃健骨膠囊可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象,證明藤黃健骨膠囊治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松可能與SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號通路的激活密切相關。

此外,Deng等人又提出,SIRT1通過脫乙酰化p53和升高Bax/Bcl-2比值來誘導成骨細胞凋亡[25,26]。而另有研究則進一步證實,Bcl-2的上調(diào)表達和Bax、Caspase-3、Caspase-9的下調(diào)表達與Nrf2信號通路的激活密切相關,而Nrf2信號通路的激活又能夠抑制成骨細胞的凋亡,從而減少骨丟失[27]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn),藤黃健骨膠囊能夠抑制OVX模型鼠成骨細胞的凋亡率,上調(diào)Nrf2、Runx2、Bcl-2的mRNA表達水平及蛋白質(zhì)表達水平,下調(diào)Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達水平及蛋白質(zhì)表達水平。由此推測,藤黃健骨膠囊可能通過SIRT1介導的Nrf2信號軸來發(fā)揮抗PMOP作用。

綜上,藤黃健骨膠囊可能通過激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號通路中成骨細胞生成因子RUNX2的表達來促進PMOP的成骨形成,也能夠通過激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2信號通路中SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Bcl-2表達和抑制促凋亡蛋白質(zhì)Caspase-3、Caspase-9表達來抑制PMOP的成骨細胞凋亡,進而維持PMOP的骨代謝平衡,最終發(fā)揮療效。