馬鈴薯發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及其香氣成分分析

楊 莉，葉 英，陳碧欽，羅貞媛，劉 娜，文和明，李華健

（1.普洱學(xué)院，生物與化學(xué)學(xué)院，云南普洱 665000；2.廣南縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，云南廣南 663300；3.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南文山 663000）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.） 屬于茄科茄屬植物，是世界上僅次于小麥、稻谷和玉米的第四大糧食作物，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)和戰(zhàn)略地位[1-2]。馬鈴薯營養(yǎng)豐富，因其含有人體必需氨基酸（尤其是第一限制性氨基酸- 賴氨酸），以及高淀粉、高膳食纖維、低脂肪含量，深受消費(fèi)者喜愛，并且是生物活性化合物和抗氧化劑的良好來源，包括酚酸類（含量為49～1 400 mg/kg DM，其中主要為綠原酸）和抗壞血酸，多食馬鈴薯可提高血液和組織的抗氧化水平，對抗氧化應(yīng)激，降低膽固醇，有助于降低心血管疾病等多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。此外，馬鈴薯還含有豐富的維A6、維B1、維B2、維B6、葉酸、鉀、鎂、鐵和類胡蘿卜素等，在預(yù)防疾病和美容養(yǎng)顏等方面應(yīng)用潛力巨大[4-5]。

在《農(nóng)業(yè)部關(guān)于推進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)開發(fā)的指導(dǎo)意見》 （農(nóng)發(fā)[2016]1 號） 文件中指出：積極推進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)開發(fā)，意義十分重大[6]。我國作為馬鈴薯生產(chǎn)大國，在馬鈴薯精深加工方面卻相對滯后，產(chǎn)品附加值較低，加工產(chǎn)品單一，是制約我國馬鈴薯加工業(yè)發(fā)展的主要原因之一[7-8]。據(jù)報(bào)道，我國的馬鈴薯有50%以上用于鮮食，用于加工的僅占15%左右，還有10%～15%由于滯銷、貯藏不當(dāng)、病害等導(dǎo)致腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。目前，對馬鈴薯酒的研究主要集中在釀造工藝優(yōu)化及在釀酒過程中將馬鈴薯作為輔料添加對酒品質(zhì)的影響上，如何正文[11]、林巧等人[12]、蒙羅紅等人[13]、王健等人[14]對馬鈴薯酒發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，梁強(qiáng)等人[15]的研究表明，在米酒釀造過程中，適量添加馬鈴薯（25%～50%）可增加米酒中的粗纖維、維C、總酸含量和乙醇體積分?jǐn)?shù)，并減少粗蛋白、氨基酸和還原糖含量，降低糖酸比，起到均衡營養(yǎng)、改善口感、豐富香氣成分的作用；姚立華等人[16]也認(rèn)為馬鈴薯是一種新型的釀酒輔料，能提高黃酒的營養(yǎng)價(jià)值。對馬鈴薯發(fā)酵酒的香氣成分分析還鮮有報(bào)道。張佳笑等人[5]認(rèn)為酒曲包含多種微生物，用其發(fā)酵釀酒可賦予發(fā)酵酒特有的風(fēng)味和口感，制得的發(fā)酵酒營養(yǎng)豐富，天然健康，還具有一定的食療功效。為不斷開發(fā)新產(chǎn)品，拓寬馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展渠道，促進(jìn)提質(zhì)增效，本研究以馬鈴薯為原料，進(jìn)行單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，選出馬鈴薯發(fā)酵酒的最佳工藝條件，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 進(jìn)行香氣成分分析，以期為馬鈴薯發(fā)酵酒的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.），購自普洱市思茅區(qū)大興超市；白酒酒曲（酵母、根霉、復(fù)合酶制劑），安琪酵母有限責(zé)任公司提供；α - 淀粉酶，濟(jì)南萬豐有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

C21-IHO1KJ 型電磁爐，浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司產(chǎn)品；HPX-B80 型恒溫培養(yǎng)箱，廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品；CX-12000 型電子秤，東莞南城長協(xié)電子制造廠產(chǎn)品；JC-6800 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬鈴薯發(fā)酵酒的釀造工藝

采用張佳笑等人[5]的方法釀造馬鈴薯酒，釀造工藝如下：新鮮馬鈴薯→清洗去皮→切塊蒸制→打漿→液化→糖化→過濾→滅菌→接曲→發(fā)酵→殺菌→冷卻→馬鈴薯酒。

1.3.2 馬鈴薯發(fā)酵酒單因素試驗(yàn)

（1） 料液比對馬鈴薯發(fā)酵酒的影響。馬鈴薯漿液（熟化馬鈴薯∶水） 的配比為1∶2，1∶4，1∶5，1∶7（g∶mL），酒曲添加量為0.7%，α - 淀粉酶添加量為0.7%，并于30 ℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為48 h，觀察不同料液比發(fā)酵對酒品質(zhì)的影響，確定最佳料液比。

（2） α - 淀粉酶添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒的影響。將等量的馬鈴薯漿液中分別添加0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的α - 淀粉酶，并添加0.7%的酒曲，于30 ℃條件下發(fā)酵48 h，確定最佳α - 淀粉酶的添加量。

（3） 酒曲添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒的影響。將等量的馬鈴薯漿液中分別添加0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的酒曲，并添加0.7%的α - 淀粉酶，于30 ℃條件下發(fā)酵48 h，觀察酒曲添加量對酒品質(zhì)的影響，確定最佳酒曲添加量。

（4） 發(fā)酵溫度對馬鈴薯發(fā)酵酒的影響。將等量的馬鈴薯漿液中，添加0.7%的酒曲和α - 淀粉酶，分別于25，30，34，38 ℃條件下發(fā)酵48 h，觀察發(fā)酵溫度對酒品質(zhì)的影響，確定最佳發(fā)酵溫度。

（5） 發(fā)酵時(shí)間對馬鈴薯發(fā)酵酒的影響。將等量的馬鈴薯漿液中添加0.7%的酒曲和α - 淀粉酶，并于30 ℃條件下分別發(fā)酵24，36，48，60 h，觀察不同發(fā)酵時(shí)間對馬鈴薯發(fā)酵酒品質(zhì)的影響，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3 馬鈴薯發(fā)酵酒正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)助手軟件以馬鈴薯酒料液比（A）、α - 淀粉酶添加量（B）、酒曲添加量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D） 設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，進(jìn)行感官評定選出最優(yōu)工藝配方。

1.4 感官評定標(biāo)準(zhǔn)

參照張佳笑等人[5]的方法，請專業(yè)人員對產(chǎn)品進(jìn)行感官評分，根據(jù)評定標(biāo)準(zhǔn)分別對馬鈴薯酒的色澤、香氣、口感和風(fēng)味進(jìn)行評分。

感官評定標(biāo)準(zhǔn)[5]見表1。

表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)

1.5 香氣成分分析

（1） 香氣成分的提取。利用頂空固相微萃取法（Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）對香氣物質(zhì)進(jìn)行富集。稱取試樣1 g 于250 mL 頂空提取瓶→10.0 mL 沸水→60 ℃水浴平衡5.0 min→DVB/CAR/PDMS 提取頭（取樣前于250 ℃下在GCMS 進(jìn)樣口中陳化30 min） →人工固相微萃取手柄→60 ℃水浴提取60 min→氣相GC-MS 進(jìn)樣口進(jìn)行解吸附[17]。

（2） GC 條件。DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口和輸送線的溫度分別為280～270 ℃，載氣為氦→無分流進(jìn)樣。加熱步驟：于60 ℃條件下維持3.0 min→以4.0 ℃/min 的速度升至280 ℃→并維持2.5 min→60.5 min 的分析。

（3） MS狀態(tài)。電子離子源，溫度為220 ℃，70 eV電離能，33～600 U 的質(zhì)量掃描范圍。

（4） 定性和定量分析。依據(jù)王慧君等人[6]的研究，對樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了定性和定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3 次，采用軟件SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測定結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯發(fā)酵酒單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

料液比對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響見圖1。

圖1 料液比對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

由圖1 可知，感官評分先增加而后減小，在料液比為1∶5（g∶mL） 時(shí)感官評分最高為88.6 分，此時(shí)馬鈴薯酒色澤和品質(zhì)良好，酒香氣濃郁。當(dāng)料液比超過1∶5（g∶mL） 時(shí)，可溶性固形物較多，由于α - 淀粉酶量不變，漿液水解不完全，出現(xiàn)酸味，品質(zhì)降低，影響其口感。故馬鈴薯最佳料液比為1∶5（g∶mL）。

2.1.2 α - 淀粉酶添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

將不同添加量的α - 淀粉酶添加到馬鈴薯漿液中，觀察同一階段α - 淀粉酶對發(fā)酵馬鈴薯酒品質(zhì)的影響。

α - 淀粉酶添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響見圖2。

圖2 α - 淀粉酶添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

由圖2 可知，當(dāng)添加量為0.1%，0.3%，0.5%時(shí)，感官評分逐漸降低酒體品質(zhì)表現(xiàn)為偏酸，有異味，口感較差；當(dāng)α - 淀粉酶添加量為0.7%時(shí)，馬鈴薯酒色澤均勻、酒體清澈、酒香味濃郁、無異味，感官評分最佳為87.7 分；當(dāng)α - 淀粉酶的添加量大于0.7%時(shí)，馬鈴薯酒色澤混濁、有異味，口感反而下降[18]。因此，確定α- 淀粉酶的添加量為0.7%。

2.1.3 酒曲添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

酒曲添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響見圖3。

圖3 酒曲添加量對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

稱取不同的酒曲（0.30%，0.50%，0.70%，0.90%，1.10%） 進(jìn)行發(fā)酵，密封后放置于30 ℃條件下發(fā)酵。由圖3 可知，馬鈴薯酒的感官得分隨著酒曲添加量增加先升高而后降低，在添加0.7%的酒曲時(shí)，感官得分最高達(dá)86.7 分，口感醇香、無酸味。當(dāng)酒曲量太多時(shí)，產(chǎn)生異味，在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)添加酒曲過少會影響發(fā)酵的品質(zhì)，達(dá)不到預(yù)期的發(fā)酵效果。因此，確定酒曲最適添加量為0.7%。

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)品感官評分的影響

發(fā)酵溫度對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

向滅菌后的馬鈴薯漿液加入酒曲，分別放入溫度為25，30，34，38 ℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵。由圖4 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高感官評分先升高后降低，在30 ℃感官評分最佳為85.8 分，此時(shí)發(fā)酵酒色澤均勻一致，無雜質(zhì)，無異味，滋味較好。當(dāng)發(fā)酵溫度在25 ℃時(shí)無異味，口味較淡，可能是由于是溫度太低抑制了微生物的生長，導(dǎo)致微生物代謝太慢[19]；當(dāng)發(fā)酵溫度大于30 ℃時(shí)，馬鈴薯酒酸味明顯，且有異味。因此，確定馬鈴薯酒的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.1.5 不同發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品感官評分的影響

發(fā)酵時(shí)間對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對馬鈴薯發(fā)酵酒感官評分的影響

由圖5 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，感官評分呈先增加后減小的趨勢，發(fā)酵時(shí)間過短，酒的香氣不夠濃郁，口感差；發(fā)酵時(shí)間過長會使酒產(chǎn)生濃郁的酒香，無苦澀味[20]。因此，確定馬鈴薯酒最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.2 正交試驗(yàn)評定結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比（A）、α - 淀粉酶添加量（B）、酒曲添加量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為4 個(gè)單因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，影響馬鈴薯酒感官的因素主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，即發(fā)酵時(shí)間＞α - 淀粉酶添加量＞料液比＞酒曲添加量，最佳組合是A1B2C2D2，此時(shí)馬鈴薯發(fā)酵酒的色澤均勻，有濃郁的酒香味，無雜質(zhì)，無異味，無酸味，口感最佳。Zhao S D 等人[21]的研究也表明發(fā)酵時(shí)間對馬鈴薯作為輔料添加釀酒對酒品質(zhì)影響較大。由于正交試驗(yàn)理論最優(yōu)水平A1B2C2D2與實(shí)際最優(yōu)水平A1B2C3D3不一致，為判斷這2 個(gè)組合有無顯著性差異，對2 組試驗(yàn)進(jìn)一步比較驗(yàn)證。

正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)/分

由表3 可知，組合A1B2C2D2略高，即料液比1∶4（g∶mL），α - 淀粉酶添加量0.7%，酒曲添加量0.7%，發(fā)酵時(shí)間48 h 的馬鈴薯發(fā)酵酒評分最高，色澤透亮、酒香氣濃郁、口感最佳。

2.3 香氣成分指標(biāo)檢測結(jié)果

馬鈴薯酒中的香氣成分見表4。

表4 馬鈴薯酒中的香氣成分

由表4 可知，馬鈴薯酒香氣成分有6 類29 種物質(zhì)，主要包括有機(jī)酸3 種、11 種酯類、1 種酚類、8 種醇類、5 種烴類、1 種呋喃類。其中，乙酸乙酯、乙醇、辛酸辛酯、異辛酸、苯乙醇、丁二酸二乙酯、異戊醇相對含量較高，是馬鈴薯發(fā)酵酒揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分，與林巧[17]、李水玲[22]的研究結(jié)果相似。

醇類物質(zhì)主要在糖發(fā)酵和酵母代謝中產(chǎn)生，表現(xiàn)為甜香、花果香，是酒中重要的呈味物質(zhì)[18]。馬鈴薯酒中醇類物質(zhì)共檢測出8 種化合物，其中，苯乙醇含量較高，是由酵母利用糖或由苯丙氨酸代謝產(chǎn)生的高級醇，可賦予馬鈴薯酒豐富的風(fēng)味，還具有抑菌作用[23]。α - 松油醇可賦予馬鈴薯發(fā)酵酒檸檬味和丁香味，使其具有特殊的香氣[24-25]。

酯類是構(gòu)成酒香氣和呈味的主要成分，對酒的風(fēng)味有影響。馬鈴薯酒中檢測出酯類化合物有11 種，香氣成分中占比最大，是馬鈴薯酒的主要風(fēng)味成分。其中酯類以辛酸乙酯、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯為主，可以賦予馬鈴薯酒清香、果香味等[26]。其中辛酸乙酯感官表現(xiàn)為脂肪、奶油、蘑菇、椰子、水果、白蘭地酒味[27]；乙酸乙酯具有菠蘿甜果味，是甜酒中較為常見的一種香氣物質(zhì)[28]，促使酒體醇和，與其他香味成分相互影響、相互協(xié)調(diào)，使馬鈴薯酒香味優(yōu)美、醇厚[29]。

有機(jī)酸類主要物質(zhì)為異辛酸、乙酸，酒中的酸類物質(zhì)能帶給酒體結(jié)構(gòu)感，其中的辛酸具有奶酪味、澀味，對酒的整體結(jié)構(gòu)具有很重要的作用，而乙酸則是影響酒體質(zhì)量的一個(gè)比較重要的因素，賦予酒體醋味[30]。除醇類、酯類、有機(jī)酸外，還有烴類、呋喃類，這些物質(zhì)的存在豐富了酒體風(fēng)味[31]。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果分析，得到了馬鈴薯酒在30 ℃發(fā)酵溫度下最佳的發(fā)酵工藝配方，即料液比為1∶5（g∶mL），淀粉酶添加量為0.7%，酒曲添加量為0.7%，發(fā)酵時(shí)間為48 h。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下得到的馬鈴薯酒光澤透亮、無雜質(zhì)、無異味、氣味濃郁、無酸味。

利用GC-MS法對馬鈴薯酒香氣成分進(jìn)行分析，得到香味物質(zhì)6 類29 種，主要包括3 種有機(jī)酸、11 種酯類、1 種酚類、8 種醇類、5 種烴類、1 種呋喃類。其中乙酸乙酯、乙醇、辛酸辛酯、異辛酸、苯乙醇、丁二酸二乙酯、異戊醇相對含量較高，是馬鈴薯發(fā)酵酒揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分。