應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析3 種酒曲中微生物多樣性

母應(yīng)春，姜 麗，蘇 偉

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

酒曲是在蒸煮的谷物及其輔料上接種或天然定型發(fā)酵而成。我國(guó)用曲釀酒已有幾千年的歷史，歷代勞動(dòng)人民傳承下來的民間酒曲是我國(guó)寶貴的微生物資源，隨著科學(xué)技術(shù)與釀酒業(yè)的發(fā)展，對(duì)酒曲的研究也日益增多[1-2]，酒曲是中國(guó)酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑，含多種微生物及其產(chǎn)生的酶，酒曲品質(zhì)對(duì)酒的產(chǎn)率和品質(zhì)影響極大，故有“曲是酒之骨”之稱[3]。

貴州省位置獨(dú)特，少數(shù)民族眾多，酒文化深厚。很多地區(qū)至今保持著傳統(tǒng)的釀酒工藝以及傳統(tǒng)的酒曲制作技術(shù)。傳統(tǒng)曲一般是自然接種微生物，因此微生物種類繁多。貴州省花溪、盤州、安順酒曲是采用傳統(tǒng)工藝制成，糖化力、液化力都相對(duì)較強(qiáng)，且出酒率高，品質(zhì)香醇。近年來，國(guó)內(nèi)外有許多的酒曲微生物多樣性的研究。Hui Wenyan等[4]使用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)3 個(gè)日本酒曲中存在大量隸屬于Ochrobactrum的細(xì)菌。沈馨等[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3 個(gè)孝感鳳窩酒曲的細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，鳳窩酒曲中存在大量的核心細(xì)菌菌群。相飛[6]采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)Weissella kimchi、Enterococcus faecium、Herbaspirilum sp.為辣蓼甜酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌。劉孟華等[7]利用宏基因組學(xué)的方法對(duì)劍南春中細(xì)菌群落多樣性的研究得出，劍南春酒曲微生物主要分布在Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria三大門中，占總量的95%以上。然而有關(guān)貴州酒曲的微生物多樣性的研究報(bào)道尚少。

高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高、成本低、準(zhǔn)確率高、可進(jìn)行雙向測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)[8-10]，可以方便快捷地分析樣品中復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)，是分析復(fù)雜多樣微生物樣品的首選[11-12]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)及相關(guān)性分析方法對(duì)貴州3 個(gè)地區(qū)生產(chǎn)的酒曲中微生物組成差異及多樣性進(jìn)行比較，以期為不同酒曲中微生物資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花溪酒曲，編號(hào)酒曲A；盤州酒曲，編號(hào)酒曲B；安順酒曲，編號(hào)酒曲C。

DNA試劑提取盒 德國(guó)Qiagen公司；2%瓊脂糖凝膠 西班牙Biowest公司；E.Z.N.A.?Soil試劑盒上海玉博生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國(guó)Axygen Biosciences公司；QuantiFluor?-ST微型熒光劑 美國(guó)Promega公司；相關(guān)生理生化實(shí)驗(yàn)所用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Fresco21型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及前處理

采集來自貴州省3 個(gè)地區(qū)（花溪、盤州、安順）不同酒廠生產(chǎn)的酒曲，采集時(shí)間2017年9月，所有樣品經(jīng)無菌密封好后放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酒曲的理化指標(biāo)檢測(cè)

水分測(cè)定：直接干燥法；酸度測(cè)定：酸堿中和法（以乳酸計(jì)）；糖化酶活力測(cè)定：婓林快速法；液化酶活力測(cè)定：分光光度法。以上方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.3 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.?Soil試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；細(xì)菌用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；真菌用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）引物對(duì)ITS1可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3.4 Illumina MiSeq測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluor?-ST微型熒光劑進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù) Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)。

構(gòu)建文庫(kù)步驟：1）連接“Y”字形接頭；2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：1）設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列；2）barcode需精確匹配，引物允許2 個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基；3）根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。使用UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類；使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010、Origin 9、SPSS Statistics 20.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲中基本理化性質(zhì)分析

表1 酒曲基本理化性質(zhì)分析Table 1 Basic physicochemical properties of rice wine kojis

由表1可知，3 種酒曲的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10.04%～13.273%之間，酒曲A和酒曲C不顯著（P＞0.05），酒曲B和酒曲C之間差異不顯著（P＞0.05）；酸度在0.421%～1.501%之間，酒曲A、B、C之間差異顯著（P＜0.05）；液化酶活力在77.420～91.880 U/g之間，酒曲A、B、C之間差異顯著（P＜0.05）；糖化酶活力在346.282～673.540 U/g之間，其中酒曲A和酒曲B 之間差異不顯著（P＞0.05），酒曲B和酒曲C之間差異不顯著（P＞0.05）。3 個(gè)地區(qū)的酒曲在酸度和液化酶活力上差異顯著。

2.2 酒曲中DNA提取與定量

提取3 個(gè)地方酒曲的DNA，測(cè)定其質(zhì)量與純度，并觀察OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm值（表2）可知，酒曲樣品的DNA的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.3之間，OD260nm/OD230nm值在0.04～0.17之間，其質(zhì)量濃度在8.5～42.8 ng/μL之間，說明提取的DNA濃度較純，以便用于酒曲的細(xì)菌和真菌多樣性分析。

表2 酒曲中DNA質(zhì)量濃度分析Table 2 Microbial DNA concentrations from rice wine koji

2.3 樣品中細(xì)菌的分析

2.3.1 細(xì)菌豐度和多樣性分析

表3 酒曲樣品細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical analysis of bacterial sequencing data of koji samples

除去不合格序列后，3 種酒曲樣品中共獲得129 510 條高質(zhì)量細(xì)菌序列（表3），其中從酒曲A、B、C中分別獲得45 308、40 940、43 262 條有效序列，基于97%相似度其OTU數(shù)量分別為474、89和476。ACE指數(shù)在246.09～476.27之間，Shannon指數(shù)在1.64～4.42之間，Chao 1指數(shù)在139.65～477.67之間，覆蓋率范圍99.87%～99.97%。說明所測(cè)得的OTU基本能反映所研究的酒曲樣品細(xì)菌群落組成。每個(gè)樣品的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)用于評(píng)估物種豐度和多樣性[14]。通過計(jì)算樣品的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，酒曲A和酒曲C的Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)明顯高于酒曲B，這說明酒曲A和酒曲C中的物種豐度明顯高于酒曲B，且酒曲A和酒曲C的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。由圖1可知，隨著測(cè)序深度的增加物種的數(shù)量也隨之增加，但與此同時(shí)每個(gè)樣品的Shannon曲線已進(jìn)入平臺(tái)期[15]。由此可知，雖然隨著測(cè)序量的增加有可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌種系型，但樣品細(xì)菌多樣性已經(jīng)不再隨測(cè)序量的增加而發(fā)生變化，說明測(cè)序數(shù)量足夠充分合理[16]。因此，本研究細(xì)菌的測(cè)序量滿足后續(xù)的生物信息學(xué)分析要求。

圖1 3 種酒曲中細(xì)菌的稀釋性曲線（a）和Shannon指數(shù)（b）圖Fig. 1 Rarefaction curve (a) and Shannon index (b) of bacteria in three rice wine kojis

2.3.2 細(xì)菌中微生物群落組成分析

在門水平上，3 個(gè)樣品中共檢測(cè)出8 個(gè)細(xì)菌門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌（Bacteroides）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、未分類菌群（others）。如圖2a所示，相對(duì)豐度高且3 個(gè)樣品均有分布的厚壁菌門、變形菌門、放線菌門。不同地區(qū)的酒曲樣品之間微生物菌群明顯不同，其中酒曲A和酒曲C中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌門為變形菌門，比例高達(dá)31.86%，39.98%；放線菌門為酒曲A中第2大優(yōu)勢(shì)菌群，占樣品序列的29.31%；酒曲B中厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，占樣品序列的98.08%，而酒曲C中厚壁菌門的相對(duì)豐度僅次于變形菌門，占樣品序列的29.28%，居第2位。不同的酒曲樣品之間微生物菌群不同，3 個(gè)樣品中酒曲A和酒曲C的細(xì)菌微生物群落組成相似，但相對(duì)豐度存在差異。

在屬水平上，3 個(gè)樣本中共檢測(cè)到19 個(gè)細(xì)菌屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、不動(dòng)細(xì)菌屬（Acinetobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、Burkholderia-Paraburkholderia、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、norank-f-Mitochondria、鞘氨醇單胞菌屬（sphingomonas）、Hydrogenispora、norankc-Gemmatimonadetes、Faecalibaculum、unclassified-f-Micromonospraceae、棲熱菌屬（Thermus）、norank-f-OM1-clade、Alistipesothers、未分類菌群（others）。如圖2b所示，相對(duì)豐度較高且3 個(gè)樣品中均分布的主要細(xì)菌屬有芽孢桿菌屬、片球菌屬、紅球菌屬、羅爾斯頓菌屬和不動(dòng)細(xì)菌屬。其中酒曲A和酒曲C中細(xì)菌微生物組成較為復(fù)雜，且相似。但所占比例不同，主要以紅球菌屬、青枯菌屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬等為主。酒曲B中微生物多樣性最低，主要有芽孢桿菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬和紅球菌屬等為主。紅球菌屬為酒曲A的優(yōu)勢(shì)菌屬，占樣本序列比例為18.50%；其次是羅爾斯頓菌屬，占樣本序列比例為8.46%；芽孢桿菌屬為酒曲B的優(yōu)勢(shì)菌屬，占樣本序列比例為13.09%；其次是片球菌屬和腸球菌屬，分別占樣本序列比例為11.15%，11.34%。而酒曲C中的優(yōu)勢(shì)菌屬也是芽孢桿菌屬，占樣本序列比例61.49%，其次是不動(dòng)細(xì)菌屬，占樣本序列比例的23.74%。

圖2 3 種酒曲在門水平（a）和屬水平（b）的細(xì)菌組成Fig. 2 Bacterial community composition of three rice wine kojis at the phylum level (a) and genus level (b)

2.3.3 細(xì)菌微生物群落相似性分析

通過非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析細(xì)菌群落間存在的關(guān)系，根據(jù)樣品中包含的物種信息，以點(diǎn)的形式反映在多維空間上，而對(duì)不同樣品間的差異程度，則是最終通過點(diǎn)與點(diǎn)的距離表現(xiàn)在圖中，其距離遠(yuǎn)近代表樣品中菌體群落的差異程度[17]。由圖3a可知，酒曲A和酒曲C距離較近，聚集在圖的左側(cè)，群落差異較?。欢魄鶥的細(xì)菌微生物聚集在右側(cè)部分，距酒曲A和酒曲C較遠(yuǎn)，差異較大，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的組群。通過對(duì)樣品細(xì)菌Beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類分析，構(gòu)建樣品層級(jí)聚類樹研究不同樣品的相似性和差異性[18]。如圖3b所示，Beta分析結(jié)果與NMDS相似，3 種酒曲共聚為兩大支，酒曲A和酒曲C的細(xì)菌屬聚為一類，差異較小，酒曲B的細(xì)菌屬另聚為一類。

圖3 細(xì)菌非度量多維尺度分析圖（a）和基于Beta多樣性距離的樣品層級(jí)聚類樹（b）Fig. 3 Bacterial non-metric multi-dimensional analysis (a) and hierarchical dendrogram based on Beta diversity distance (b)

2.4 樣品中真菌的分析

2.4.1 真菌的豐度和多樣性分析

酒曲A、B、C經(jīng)過測(cè)序后得出3 種酒曲樣品中共獲得60 945 條高質(zhì)量真菌序列（表4），3 種酒曲中獲得有效序列相同，均為20 315 條，基于97%相似度，其OTU數(shù)量分別為2.4、1和15.8。ACE指數(shù)在0～16.09之間，Shannon指數(shù)在0.06～1.06之間，Chao 1指數(shù)在5.5～25之間，覆蓋率均為99.99%。說明所測(cè)得的OTU基本能反映所研究酒曲樣品真菌群落組成。通過計(jì)算樣品的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，酒曲A的Chao 1指數(shù)25最大，說明酒曲A的真菌微生物豐度高于酒曲B和酒曲C。在多樣性方面，酒曲C的Shannon指數(shù)1.06最大，說明酒曲C的真菌群落結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。由圖4可知，隨著測(cè)序深度的增加，發(fā)現(xiàn)物種的數(shù)量也隨之增加，與此同時(shí)，每個(gè)樣品的Shannon曲線己進(jìn)入平臺(tái)期。由此可知，雖然隨著測(cè)序量的增加有可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的真菌種系型，但樣品真菌的多樣性己經(jīng)不再隨測(cè)序量的增加而發(fā)生變化。因此，本研究真菌的測(cè)序量滿足后續(xù)的生物信息學(xué)分析要求。

表4 酒曲樣品真菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of fungal sequencing data of koji samples

圖4 3 種酒曲中真菌的稀釋性曲線（a）和Shannon指數(shù)（b）圖Fig. 4 Dilution curve (a) and Shannon index (b) of fungi in three kinds of koji

2.4.2 真菌中微生物群落組成分析

圖5 3 種酒曲在門水平（a）和屬水平（b）上的真菌組成Fig. 5 Fungal community composition of three kojis at the phylum level (a) and genus level (b)

如圖5a所示，在門水平上，檢測(cè)出3 個(gè)真菌門為接合菌門（Zygomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。在門水平上相對(duì)豐度高且3個(gè)樣品均有分布的主要真菌門為子囊菌門。不同的酒曲樣品之間微生物菌群明顯不同。酒曲A和酒曲B中接合菌門為優(yōu)勢(shì)真菌門，比例達(dá)64.57%、98.91%。酒曲C中子囊門為優(yōu)勢(shì)真菌門，占樣品序列比例95.26%。

如圖5b所示，在屬水平上，3 個(gè)樣本中共檢測(cè)到4 個(gè)真菌屬，分別為米根霉屬（Rhizopus）、酵母菌屬（Saccharomyce）、曲霉菌屬（Aspergillus）和嗜熱菌屬（Thermomyces）。酒曲A和酒曲B中米根霉屬為優(yōu)勢(shì)真菌屬，占樣本序列比例的66.58%和95.25%。酒曲C中優(yōu)勢(shì)真菌屬為酵母屬，占樣本序列比例的95.25%。3 種酒曲樣品中盡管微生物群落組成相似，但相對(duì)豐度仍存在顯著性差異。

2.4.3 真菌微生物群落相似性分析

圖6 真菌非度量多維尺度分析圖（a）和基于Beta多樣性距離的樣品層級(jí)聚類樹（b）Fig. 6 Fungal non-metric multidimensional scaling analysis (a) and hierarchical clustering dendrogram based on beta diversity distance (b)

如圖6a可知，真菌NMDS聚類與細(xì)菌結(jié)果不同，酒曲A和酒曲B距離較近，聚集在圖的右側(cè)，群落差異較小。而酒曲C的細(xì)菌微生物聚集在左側(cè)部分，距酒曲A和酒曲B較遠(yuǎn)，差異較大，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的組群。如圖6b所示，真菌Beta多樣性距離矩陣層級(jí)聚類結(jié)果與NMDS結(jié)果一樣，3 種酒曲同樣共聚為兩大支，酒曲A和酒曲B聚為一類，酒曲C另聚為一類。

2.5 典型關(guān)聯(lián)分析（canonical correlation analysis，CCA）

CCA揭示不同地區(qū)酒曲樣品微生物群落組成與不同環(huán)境因子之間的相關(guān)性[19]。選擇3 個(gè)地方酒曲理化指標(biāo)作為環(huán)境因子與酒曲中屬水平上細(xì)菌豐度前10的微生物進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析。如圖7所示，酸度與液化酶活力之間夾角為鈍角，表明兩個(gè)理化指標(biāo)之間不具有協(xié)同效應(yīng)；水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與糖化酶活力之間夾角為銳角，表明兩個(gè)指標(biāo)之間具有協(xié)同效應(yīng)。酒曲A和酒曲C與酸度相關(guān)性最高，酒曲B與液化酶活力、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、糖化酶活力相關(guān)性最高，Acinetobacter、Ralstonia、Rhodococcus、norank-f-Mitochondria、Bifidobacterium、Lactobacillus與酸度變化呈正相關(guān)；Bacillus、Enterococcus、Pediococcus與液化酶活力、糖化酶活力變化呈正相關(guān)，與水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化也呈正相關(guān)但影響不顯著。由此說明，酒曲中微生物的種群結(jié)構(gòu)對(duì)酒曲理化指標(biāo)具有顯著影響。

圖7 細(xì)菌群落與環(huán)境因子典范對(duì)應(yīng)分析Fig. 7 Canonical correspondence analysis between bacterial community and environmental factors

3 討 論

通過高通量測(cè)序分析3 種不同酒曲的群落結(jié)構(gòu)及物種多樣性之間的差異，從3 種酒曲中共檢出8 個(gè)細(xì)菌門和3 個(gè)真菌門；19 個(gè)細(xì)菌屬和4 個(gè)真菌屬。細(xì)菌門主要有厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門等。細(xì)菌屬主要有紅球菌屬、羅爾斯頓菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、芽孢桿菌屬、伯克爾德屬、片球菌屬、腸球菌屬等。真菌門有接合菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門。真菌屬有米根霉屬、酵母菌屬、曲霉菌屬、嗜熱菌屬。據(jù)報(bào)道，酒曲中的細(xì)菌屬有芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、芽孢梭菌屬、葡萄球菌屬、微細(xì)菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、歐文氏菌屬、醋桿菌屬、柯匝克氏菌屬、顆粒鏈菌屬和希瓦氏菌屬13 個(gè)菌屬[20-22]，由此可知，酒曲樣品中微生物群落組成豐富，不同地區(qū)酒曲微生物群落組成雖然相似，但是豐度仍存在差異。3 個(gè)地區(qū)中，酒曲A和酒曲C的細(xì)菌種群相似，酒曲A和酒曲B的真菌種群相似，這應(yīng)該與環(huán)境因素有所關(guān)系，并且揭示了酒曲中微生物組成種類的復(fù)雜程度。

張雙燕等[23]研究發(fā)現(xiàn)，大曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有乳酸桿菌屬，片球菌屬，也檢測(cè)出醋酸桿菌屬和芽孢桿菌屬等。其中乳桿菌屬，片球菌屬和芽孢桿菌屬在本實(shí)驗(yàn)3 種酒曲中均被檢測(cè)出，芽孢桿菌屬為酒曲B和酒曲C的第一優(yōu)勢(shì)菌屬。芽孢桿菌屬在白酒釀造過程中發(fā)揮著重要的作用，能產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶，分解淀粉和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。此外，芽孢桿菌能影響白酒的風(fēng)味物質(zhì)如酯、醇的形成[24-25]。李艷等[26]研究發(fā)現(xiàn)，羊羔美酒大曲中優(yōu)勢(shì)菌屬有片球菌屬和乳酸桿菌屬，甜酒中酸味較重可歸功于含量較高的片球菌屬和乳酸桿菌屬，表明了甜酒最終質(zhì)量和風(fēng)味與發(fā)酵微生物分類組成息息相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在酒曲B中片球菌屬的豐度較高，但乳酸桿菌屬豐度略低。Bora等[27]采用基于Illumina平臺(tái)的全基因組鳥槍測(cè)序法對(duì)印度的米酒曲xaj-pitha進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，米酒曲含有大量以乳酸菌為其主要細(xì)菌類群的細(xì)菌屬。3 種酒曲檢測(cè)的結(jié)果均有乳酸桿菌屬，但相對(duì)豐度各有不同，乳酸桿菌屬與乳酸乙醋的形成具有密切關(guān)系[28]，其對(duì)于有機(jī)酸具有一定的耐受能力[29]，能減弱酵母菌的好氧代謝速度，延長(zhǎng)前發(fā)酵期，有利于發(fā)酵有益菌的生長(zhǎng)，對(duì)于白酒香味物質(zhì)增加有利[30-31]。另外3 種酒曲中也檢測(cè)到雙歧桿菌屬，雙歧桿菌是有益菌的代表，對(duì)于維持腸道微生態(tài)平衡有重要作用，具有調(diào)整腸道功能、凈化腸道環(huán)境、促進(jìn)機(jī)體健康的效果，提高抗病能力等[32]。陳玲等[33]采用16S rDNA克隆文庫(kù)法和高通量測(cè)序法分析大曲中細(xì)菌微生物組成，檢測(cè)出在門水平上的細(xì)菌門有厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等。王丹丹等[34]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)孝感鳳窩酒曲的真菌微生物多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出在門水平上真菌主要有子囊菌門。本研究也在3 種酒曲樣品中檢測(cè)到了厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、子囊菌門的存在，其在酒曲A和酒曲C中子囊菌門的豐度最高，而在酒曲C中相對(duì)豐度較低。接合菌門為酒曲C中的優(yōu)勢(shì)菌門。喬曉梅等[35]研究發(fā)現(xiàn)，清香大曲真菌菌群有米根霉和酵母菌。羅惠波等[36]采用ITS基因文庫(kù)法研究清香型大曲真菌群落結(jié)構(gòu)，得出清茬曲的優(yōu)勢(shì)真菌屬為畢赤酵母屬和米根霉屬。而本研究也檢測(cè)到酒曲A和酒曲B中的優(yōu)勢(shì)真菌屬為米根霉屬，酒曲C中的優(yōu)勢(shì)真菌屬為酵母屬。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)3 種酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)與組成及多樣性進(jìn)行研究，采用CCA酒曲的基本理化指標(biāo)與酒曲細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的酒曲微生物群落構(gòu)成及多樣性存在明顯差異，且酒曲的基本理化指標(biāo)與微生物菌群結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性，這可能與環(huán)境、氣候等因素有關(guān)[37]，通過本研究對(duì)貴州不同地區(qū)酒曲微生物種群結(jié)構(gòu)有了初步的了解，也為酒曲微生物多樣性探究進(jìn)一步提供參考。