高通量抗生素殘留初篩試劑盒的研制及應(yīng)用

范 維，高曉月，李賀楠，郭文萍，陳淑敏，孫 勇，李瑩瑩*

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

抗生素作為一種殺菌或抑菌藥物，在養(yǎng)殖、臨床、農(nóng)業(yè)等方面得到廣泛應(yīng)用，但濫用會(huì)導(dǎo)致其殘留于動(dòng)物體內(nèi)，通過食物鏈進(jìn)入人體，影響人類疾病治療與康復(fù)，甚至引起嚴(yán)重的食品安全和出口貿(mào)易問題[1-4]。當(dāng)前，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)主要使用的抗生素包括四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類及大環(huán)內(nèi)酯類等[5-6]，為了增強(qiáng)抗生素療效，縮短療程，減少細(xì)菌耐藥性，現(xiàn)經(jīng)常把不同類抗生素進(jìn)行配伍使用，這無形中加大了抗生素殘留檢測(cè)難度，預(yù)示著高通量的檢測(cè)方法將成為未來檢測(cè)發(fā)展趨勢(shì)。目前，抗生素殘留檢測(cè)方法主要有色譜法[7-8]、微生物法[9]和免疫分析法[10]等，其中色譜法較為常用，可以進(jìn)行定性定量檢測(cè)，結(jié)果靈敏準(zhǔn)確，但設(shè)備投入大，不同類別抗生素前處理和檢測(cè)條件不同，很難做到聯(lián)合檢測(cè)[11-12]；免疫分析法雖靈敏度高，但是檢測(cè)成本昂貴，只能檢測(cè)單一類抗生素[13]，不易于高通量；相較于前兩種方法，微生物法是抗生素殘留檢測(cè)最早采用的方法，其成本低廉、操作簡(jiǎn)單、具有廣譜性，可作為一種高通量抗生素初篩方法在中小型食品企業(yè)得到普及。

目前已有的微生物法多用于牛奶中抗生素殘留檢測(cè)，在禽畜肉中應(yīng)用較少，這主要是由于禽畜肉基質(zhì)較為復(fù)雜，抗生素提取存在難度[14]。而對(duì)于微生物顯色法試劑盒的開發(fā)，由于微生物本身活性受外界因素影響較大，且這種活性需要活化傳代維持，因此如何能在保障其活性的前提下，將其進(jìn)行保存和運(yùn)輸，并且不影響顯色反應(yīng)，是目前制約其研制的技術(shù)難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期的研究成果[15]，在確定了適用于禽畜肉中抗生素提取方法以及檢測(cè)液配方的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步克服了因菌種活化傳代耗時(shí)較長(zhǎng)及液體菌種無法運(yùn)輸?shù)葐栴}，開發(fā)出一種可檢測(cè)動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的高通量微生物顯色初篩試劑盒，并對(duì)試劑盒的各方面性能加以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

禽畜肉購自超市或農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)。嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus sterothermophilus CICC 10392） 食品安全菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、青霉素V、氯唑西林、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素、水合氨芐青霉素；四環(huán)素類：四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素；氨基糖苷類：慶大霉素、鏈霉素、新霉素、安普霉素、丁胺卡那霉素；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、羅紅霉素、泰樂霉素標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基、溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、溴甲酚紫 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；海藻酸鈉、明膠、卡拉膠、聚乙烯醇、二醋酸纖維素、硼酸、氯化鈣、磷酸氫二鈉均為分析純。

抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：將氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類各抗生素標(biāo)準(zhǔn)品分別用去離子水溶解并定容至100 μg/mL，-20 ℃避光可保存1 個(gè)月；將大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類各抗生素標(biāo)品分別用甲醇溶解并定容至100 μg/mL，-18 ℃避光可保存12 個(gè)月以上。

檢測(cè)液：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、葡萄糖10.0 g、NaCl 5.0 g、溴甲酚紫指示劑0.04 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至7.0，121 ℃高壓滅菌10 min[15]。

1.2 儀器與設(shè)備

FC酶標(biāo)儀 芬蘭雷勃儀器有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UltiMate3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 美國(guó)Thermo公司；1200-6410液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源）、1260高效液相色譜（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器） 美國(guó)安捷倫公司；TD4離心機(jī) 鑫港儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

在無菌狀態(tài)下，從NA培養(yǎng)基上挑取已活化好的株菌，接入BHI培養(yǎng)基中，充分振蕩，以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，向離心管中重新加入BHI培養(yǎng)基，如此反復(fù)離心洗滌3 次后，用BHI培養(yǎng)基充分溶解沉淀，根據(jù)波長(zhǎng)為600 nm處的吸光度，制備一定濃度的菌懸液。

1.3.2 菌種微膠囊包埋方法確定

1.3.2.1 菌種包埋方法選擇

分別采用海藻酸鈉法[16]、明膠法[16]、卡拉膠法[16]、二醋酸纖維素法[17]及聚乙烯醇法[17]對(duì)一定濃度的指示菌進(jìn)行包埋，通過對(duì)包埋小球進(jìn)行包埋操作難易程度分析、機(jī)械強(qiáng)度及菌種成活率測(cè)試，選取適合微生物顯色法的包埋方法。

1.3.2.2 菌種包埋條件優(yōu)化

配制10 mL溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，向其中加入一定量的聚乙烯醇，使其質(zhì)量濃度分別為0.08、0.1、1.2 g/mL攪拌混勻，于121 ℃滅菌10 min。待冷卻至40 ℃后，向上述溶液中分別加入10 mL初始吸光度（A600nm）為0.5、0.8、1.0、1.2的指示菌懸液，混合均勻，用6號(hào)針頭緩慢滴入pH值分別為5.2、6.0、6.8、7.5的硼酸-磷酸鹽溶液中，于4 ℃靜置1 h，抽濾出包埋顆粒，用生理鹽水洗凈，密封4 ℃保存、備用。通過對(duì)包埋小球進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度、菌種成活率、抗生素敏感性及反應(yīng)時(shí)間測(cè)試，確定最佳包埋條件。

1.3.2.3 機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試

兩塊載玻片之間放置粒徑相近的包埋小球，在上面的載玻片上加100 g砝碼，觀察小球外形有無變化，用裂痕和壓碎程度表征小球的機(jī)械強(qiáng)度。

1.3.2.4 菌種成活率測(cè)試

將4 ℃保存1 周的包埋菌株放到150 μL檢測(cè)液中，每菌株設(shè)置25 個(gè)平行，于62 ℃恒溫培養(yǎng)，4 h內(nèi)使檢測(cè)液變黃的即為成活，對(duì)比觀察不同包埋條件菌種的成活情況，計(jì)算成活率。

1.3.2.5 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)

向96 微孔板中依次分別加入150 μL檢測(cè)液，50 μL菌懸液（或一顆包埋菌株顆粒）和100 μL 0.1 μg/mL的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，于62 ℃培養(yǎng)，觀察檢測(cè)液變色情況及反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 具體操作[15]

稱取均質(zhì)好的10 g肌肉（瘦肉）樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL pH 7.4的磷酸鈉緩沖溶液，旋渦1 min，密封置100 ℃沸水浴中加熱5 min，10 000 r/min離心3 min，上清液即為樣品提取液。

1.3.3.2 方法驗(yàn)證

以四環(huán)素為例，分別向豬、牛、羊、雞、鴨的肌肉（瘦肉）樣品中注射不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組進(jìn)行3 個(gè)平行，按1.3.3.1節(jié)的操作進(jìn)行樣品前處理，之后將樣品提取液進(jìn)行色譜測(cè)定，確定該前處理方法的提取效率，并將各樣品提取液進(jìn)行微生物顯色法驗(yàn)證，確定檢測(cè)效果。

1.3.4 試劑盒操作及結(jié)果判定

根據(jù)樣品數(shù)量取出已固定有指示菌包埋顆粒的微孔，依次向每孔中加入檢測(cè)液150 μL，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照及樣品提取液各200 μL，對(duì)照組和樣品組各取3 個(gè)平行。于62 ℃恒溫培養(yǎng)至陰性對(duì)照變成黃色，觀察其他孔顏色變化。其中陽性對(duì)照為抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液；陰性對(duì)照為無抗生素殘留的肌肉（瘦肉）提取液；空白對(duì)照為0.85%生理鹽水。結(jié)果判定：樣品孔檢測(cè)液呈黃色為陰性（-），紫色為陽性（+）。

1.3.5 試劑盒檢出限確定

1.3.5.1 單標(biāo)抗生素檢出限

用去離子水將20 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行梯度稀釋，用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，確定各單標(biāo)抗生素的檢出限。

1.3.5.2 配伍抗生素檢出限

對(duì)常配伍使用的四環(huán)素類和氨基糖苷類抗生素、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素進(jìn)行混合，配伍方案及系列梯度中各抗生素終質(zhì)量濃度見表1。用試劑盒對(duì)混合抗生素梯度進(jìn)行檢測(cè)，確定混合抗生素的檢出限。

表1 抗生素配伍方案及系列梯度Table 1 Antibiotic combinations with concentration gradients

1.3.6 試劑盒穩(wěn)定性

試劑盒密封好后于4 ℃保存1、3、5、10、15、18、20 d，用單標(biāo)抗生素稀釋梯度進(jìn)行檢出限和反應(yīng)時(shí)間驗(yàn)證，確定試劑盒最佳使用期限。

1.3.7 試劑盒的評(píng)價(jià)

從不同市場(chǎng)分別購進(jìn)豬肉20 份、牛肉15 份、羊肉15 份、雞肉10 份、鴨肉10 份，共計(jì)70 份，分別用序號(hào)1～70標(biāo)識(shí)，為保證有一定的陽性檢出率，對(duì)一部分購買樣品進(jìn)行人工添加。

用本實(shí)驗(yàn)研制的試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，之后用色譜法進(jìn)行驗(yàn)證。大環(huán)內(nèi)酯類：參照SN/T 1777.2—2007《動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留測(cè)定方法》[18]進(jìn)行檢測(cè)；四環(huán)素類和氨基糖苷類：分別參照GB/T 21317—2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法》[19]和GB/T 21323—2007《動(dòng)物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測(cè)定》[20]方法進(jìn)行檢測(cè)；β-內(nèi)酰胺類：參照SN/T 2050—2008《進(jìn)出口動(dòng)物源食品中14 種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留量檢測(cè)方法》[21]和GB 29682—2013《水產(chǎn)品中青霉素類藥物多殘留的測(cè)定》[22]方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株包埋方法的確定

從表2可知，雖然明膠和卡拉膠的菌株成活率較高，但兩者機(jī)械強(qiáng)度較低，顆粒易破碎使得被包埋細(xì)胞泄出，并且明膠在切塊時(shí)易黏連，不易操作，且通過后期顯色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這兩種載體存在顯色不均的情況，因此這兩種材料不適合作顯色反應(yīng)的載體。采用醋酸纖維素作包埋載體，雖然顆粒機(jī)械強(qiáng)度高，但成活率極低，其原因可能是醋酸纖維素中添加的丙酮對(duì)菌株細(xì)胞傷害較大[23]，故也不適合作包埋載體。采用海藻酸鈉作載體，成球容易，菌株成活率高，但通過后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉化學(xué)穩(wěn)定性差，與肉提取液（磷酸鹽緩沖液）混合極不穩(wěn)定，易吸脹破裂，影響顯色反應(yīng)。因此，選擇聚乙烯醇作為包埋載體，其菌株成活率達(dá)到80%，機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，抗微生物分解性能強(qiáng)，且易操作[17]。

表2 不同包埋方法的難易程度及表觀特征Table 2 Difficulty and apparent characteristics of different embedding methods

2.2 菌株包埋條件優(yōu)化結(jié)果

對(duì)現(xiàn)有的聚乙烯醇-硼酸包埋法進(jìn)行改進(jìn)，改用硼酸-磷酸鹽溶液作為交聯(lián)劑，并對(duì)相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化。從表3可知，當(dāng)聚乙烯醇質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時(shí)，成球效果最佳。

表3 聚乙烯醇質(zhì)量濃度對(duì)包埋效果的影響Table 3 Effect of polyvinyl alcohol concentration on embedding efficiency

表4 交聯(lián)劑pH值對(duì)包埋及檢測(cè)效果的影響Table 4 Effect of pH value of cross-linking agent on the efficiency of embedding and detection

交聯(lián)劑pH值對(duì)包埋及檢測(cè)效果影響情況見表4。將交聯(lián)劑改為硼酸-磷酸鹽是因?yàn)榕鹚嶙陨矶拘砸约疤峁┑乃嵝原h(huán)境會(huì)降低菌種活性，加入磷酸鹽，一方面可以縮短在硼酸中的交聯(lián)時(shí)間減少毒性，另一方面可以改善pH值，為菌種提供適宜生存條件，提高菌種存活率[24]。從表4可知，當(dāng)pH值較低時(shí)，成球形狀不規(guī)則，小球自身低pH值會(huì)使檢測(cè)液中的指示劑變色，影響顯色反應(yīng)，且過酸會(huì)降低指示菌成活率；而當(dāng)交聯(lián)劑pH值較高時(shí)，小球加入到檢測(cè)液后會(huì)升高其pH值，從而延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。因此，選擇pH 6.0的硼酸-磷酸鹽溶液作為交聯(lián)劑。

表5 菌種初始A600 nm對(duì)檢測(cè)效果的影響Table 5 Effect of initial bacterial suspension concentration on detection efficiency

從表5可知，當(dāng)菌種初始A600nm為0.5時(shí)，抗生素對(duì)菌株的抑制效果較好，但由于菌株濃度較低，導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)且存活率較低；當(dāng)菌懸液初始吸光度較高時(shí)，抗生素對(duì)菌的抑制效果不明顯，反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)檢測(cè)液變?yōu)辄S色，達(dá)不到檢測(cè)目的。因此，選擇初始A600nm為0.8的指示菌進(jìn)行包埋。

2.3 樣品提取效果驗(yàn)證

從表6可知，該提取方法對(duì)不同肌肉（瘦肉）樣品中抗生素殘留提取率為79.8%～88.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～5.2%。進(jìn)一步對(duì)各提取液的檢測(cè)效果進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)加熱沉淀蛋白后，鴨、雞、豬肉樣品的提取液呈現(xiàn)無色，離心后較為澄清，而牛、羊肉樣品的上清液呈微紅色，但只要其中抗生素殘留超過微生物法檢出限，不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

表6 不同樣品提取效率及顯色效果Table 6 Efficiency of extraction and color development of different samples

2.4 試劑盒檢出限測(cè)定結(jié)果

按1.3.5節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢出限效果見圖1，以顏色未發(fā)生變化的標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為該抗生素的最小檢測(cè)質(zhì)量濃度。

圖1 檢出限效果圖Fig. 1 No color change occurred at the detection limit

表7 單標(biāo)抗生素檢出限量Table 7 Detection limits for single antibiotics

從表7可知，本試劑盒各類抗生素的檢出限均小于我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[25]，其中對(duì)β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素較為敏感，檢出限分別為20～40、40～60 μg/kg，這與謝莉等[26]研究的用嗜熱脂肪芽孢桿菌檢測(cè)牛奶中抗生素殘留結(jié)果相似。相較于色譜法，該試劑盒檢出限更接近最大殘留限量，因此本試劑盒初篩呈陽性的樣品更有可能是不合格樣品，之后將這些陽性樣品用色譜法進(jìn)行復(fù)測(cè)，可以節(jié)約時(shí)間和成本。并且有時(shí)企業(yè)并不需要太精準(zhǔn)的數(shù)值，只需檢測(cè)購入的原料肉中抗生素殘留是否合格，對(duì)靈敏度無過高要求，以免成本提高造成浪費(fèi)。

表8 配伍抗生素檢出限Table 8 Detection limits for antibiotic combinations

從表8可知，該試劑盒對(duì)常配伍使用的抗生素也能進(jìn)行檢測(cè)，且檢出限均較單標(biāo)低，說明四環(huán)素類和氨基糖苷類抗生素、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素聯(lián)合使用對(duì)指示菌抑制效果增強(qiáng)，具有協(xié)同作用，這與李娟[27]對(duì)氨基糖苷類抗生素配伍禁忌研究結(jié)果一致。

2.5 試劑盒穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

將試劑盒于4 ℃保存，每間隔一定時(shí)間用慶大霉素、四環(huán)素進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間和檢出限驗(yàn)證，結(jié)果見表9。隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)時(shí)間和檢出限均受到影響，這是由于菌體自身處于一個(gè)衰減的過程，隨保存時(shí)間延長(zhǎng)菌體數(shù)量和活性都會(huì)隨之降低造成的，而15 d內(nèi)試劑盒的反應(yīng)時(shí)間和檢出限均可保持穩(wěn)定狀態(tài)，因此，該試劑盒的最佳使用期限為15 d。

表9 試劑盒穩(wěn)定性Table 9 Stability of the kit

2.6 試劑盒評(píng)價(jià)結(jié)果

表10 微生物法與色譜法樣品檢測(cè)結(jié)果Table 10 Results obtained on samples using the kit and chromatography

將70 個(gè)樣品進(jìn)行試劑盒檢驗(yàn)，之后用色譜法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表10。試劑盒檢測(cè)共有24 個(gè)樣品呈陽性，經(jīng)色譜法驗(yàn)證，其中18 個(gè)陽性樣品含有以上添加的抗生素殘留，其余6 個(gè)為假陽性樣品，據(jù)研究[28-29]嗜熱脂肪芽孢桿菌除對(duì)抗生素敏感外，對(duì)磺胺類、糖肽類等藥物也有較高的敏感性，因此6 個(gè)假陽性樣品存在含有其他抗生素的可能。而試劑盒檢測(cè)呈陰性的46 個(gè)樣品，經(jīng)色譜法驗(yàn)證，沒有測(cè)出本實(shí)驗(yàn)規(guī)定的藥物殘留，說明該試劑盒結(jié)果可靠，雖存在一定的假陽性結(jié)果，但只要抗生素殘留量超過其方法檢出限，無假陰性結(jié)果存在。

3 結(jié) 論

本研究以樣品中抗生素殘留影響菌種生長(zhǎng)產(chǎn)酸，從而使檢測(cè)液中指示劑顏色發(fā)生變化為原理，選用具有廣譜敏感性的嗜熱脂肪芽孢桿菌作為指示菌，并將其微膠囊包埋固定于96 微孔板中，克服了因菌種活化傳代耗時(shí)較長(zhǎng)及液體菌種無法運(yùn)輸?shù)葐栴}，研制了檢測(cè)動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的高通量初篩試劑盒。為了提高試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)分析對(duì)比不同包埋方法，并對(duì)菌種包埋濃度、包埋劑添加量及交聯(lián)劑pH值進(jìn)行了優(yōu)化。該試劑盒對(duì)禽畜肉中常見的β-內(nèi)酰氨類、四環(huán)素、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物無論是單獨(dú)使用還是配伍使用都具有較好的檢測(cè)靈敏度，在15 d的保存期內(nèi)，具有較好的檢測(cè)穩(wěn)定性。該試劑盒操作簡(jiǎn)便、快捷，包括前處理在內(nèi)4～5 h即可完成檢測(cè)，結(jié)果肉眼可辨別，無需借助大型儀器。采用可獨(dú)立拆分的微孔板，可根據(jù)樣品數(shù)隨意調(diào)節(jié)，做到用同一前處理方法、同一檢測(cè)體系對(duì)不同樣品、不同抗生素的高通量檢測(cè)。用色譜法對(duì)試劑盒篩檢出的46 個(gè)陰性樣品進(jìn)行驗(yàn)證，均無抗生素藥物殘留，說明該試劑盒結(jié)果可靠，無假陰性存在。因此可以采用該試劑盒進(jìn)行篩檢，再以色譜法對(duì)呈陽性的樣品進(jìn)行復(fù)測(cè)，以便減少成本和提高效率，這將在食品企業(yè)及一般檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室具有良好的推廣前景。