羅非魚皮硫酸皮膚素與膠原蛋白同時提取工藝優(yōu)化及初步鑒定

王鑫,賈學(xué)靜,2,汪卓,2,陳建平,2,劉曉菲,2,宋兵兵,2,李瑞,2,鐘賽意,2*

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室, 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心,廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心,廣東 湛江,524008) 2(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學(xué),遼寧 大連,116034)

羅非魚又名非洲鯽魚,原產(chǎn)于非洲。因生長速度快,肉質(zhì)鮮美,被引入我國大量養(yǎng)殖。我國羅非魚加工產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá),但在加工過程中,大量的組織被當(dāng)作下腳料丟棄[1]。這些下腳料中,魚皮因富含膠原蛋白和糖胺聚糖等高附加值產(chǎn)品[2],是提取高附加值生物材料的理想原料[3]。

糖胺聚糖又名黏多糖,是一類由多個二糖結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的長鏈線性復(fù)雜多糖,包括硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate,DS)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)等[4]。其中魚皮中富含的DS是一種硫酸化糖胺聚糖,主要由N-乙酰半乳糖胺和L-艾杜糖醛酸以β-1,4或β-1,3鍵連接的二糖組成。DS具有傷口修復(fù)、抗炎、抗病毒、抗血栓等活性[5],具有廣闊應(yīng)用前景。商品化DS主要從豬皮、豬腸黏膜、牛皮中獲取,近年,由于陸生動物來源的DS存在瘋牛病、口蹄疫等風(fēng)險,以魚皮為原料[6]提取的水生動物來源DS受到廣泛關(guān)注。

目前,魚皮DS及膠原蛋白的提取通常是分開進(jìn)行的,提取魚皮DS一般采用堿提取和酶提取等方法。這些方法的提取溫度通常在50 ℃以上,長時間的堿、高溫處理易對膠原蛋白的結(jié)構(gòu)造成破壞[7],不利于膠原蛋白提取,造成資源的浪費(fèi)。因此,本研究采用在較低溫度下酶提酸促溶的方法對羅非魚皮DS與膠原蛋白進(jìn)行同時提取,反應(yīng)條件溫和,避免了高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿對DS與膠原蛋白結(jié)構(gòu)的破壞。同時,通過單因素試驗(yàn)及雙指標(biāo)響應(yīng)面法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,使DS得率與膠原蛋白提取率都能達(dá)到較高水平,實(shí)現(xiàn)羅非魚皮DS及膠原蛋白的同時提取。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮,廣東省湛江市恒誠生物科技有限公司,清洗后-20 ℃保存;木瓜蛋白酶(800 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(3 000 U/mg),上海源葉生物科技有限公司;阿利新藍(lán)8GX,美國Sigma公司;硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品、透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品、L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,中國藥品生物制品檢定所;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Amberlite FPA98Cl樹脂,陶氏化學(xué)公司;NaCl、醋酸等均為分析純,西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8CJ恒溫磁力攪拌水浴鍋,常州市金壇友聯(lián)儀器研究所;Thermo Lynx 6000高速落地離心機(jī),賽默飛世爾科技有限公司;TU-1901紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀,德國Bruker公司;GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng),美國伯樂公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魚皮的預(yù)處理

將羅非魚皮洗凈,去除多余的鱗片及魚肉等雜質(zhì),魚皮的脫脂參考蔣麗等[8]的方法略作改動,在料液比1∶4(g∶mL)、pH 9、加酶量0.5%、39 ℃條件下用脂肪酶脫脂1 h。再將處理后的魚皮用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h除去雜蛋白及色素, 蒸餾水清洗至中性。剪成約1 cm×1 cm的小塊并經(jīng)破壁機(jī)粉碎備用。

1.3.2 魚皮DS與膠原蛋白的同時提取

經(jīng)過處理的魚皮加入適量的水進(jìn)行酶解,酶解結(jié)束后加入醋酸調(diào)至pH值為3,繼續(xù)提取30 min,促進(jìn)膠原蛋白溶出,最后沸水浴滅酶。8 000 r/min離心20 min取上清液,加入NaCl溶液使?jié)舛葹?.9 mol/L,4 ℃鹽析過夜,離心分離得到膠原蛋白沉淀及含DS的上清液。膠原蛋白沉淀用適量0.5 mol/L醋酸溶解,于0.1 mol/L醋酸中透析1 d,再于蒸餾水中透析1 d,每隔6 h換水一次,冷凍干燥得到羅非魚皮膠原蛋白。含DS的上清液濃縮后經(jīng)3 kDa透析袋脫鹽1 d,pH值調(diào)至8,過濾取澄清液,50 ℃下在Amberlite FPA98Cl樹脂柱中吸附上樣,然后用蒸餾水洗至洗脫液接近無色,分別用0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液,以1 mL/min的流速依次洗脫,收集0.5 mol/L NaCl溶液洗脫組分,用阿利新藍(lán)法檢測管中DS含量,收集含有DS的洗脫液。透析袋透析2 d,冷凍干燥得到羅非魚皮DS。

1.3.3 蛋白酶的篩選

取10 g魚皮,加入300 mL蒸餾水,分別加入5 000 U/g的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶,在各自適宜pH下30 ℃酶解24 h。以DS得率及膠原蛋白提取率為指標(biāo),篩選出酶解提取最適宜的酶。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以DS得率及膠原蛋白提取率為指標(biāo),加酶量、料液比、提取時間、提取溫度為單因素,探究單因素對同時提取效果的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取加酶量、提取時間、提取溫度作為影響因素,DS得率及膠原蛋白提取率為響應(yīng)值,采用 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)曲面分析優(yōu)化同時提取效果。試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3.6 DS得率的測定

參考張虹等[9]的方法略作改動,取0.1 mL樣液,1.5 mL阿利新藍(lán)染液染色10 min,于480 nm處測定吸光度,對照DS標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣液DS含量,如公式(1)所示:

Y1=ρ×V×100/m

(1)

式中:Y1,DS得率,mg/100 g;ρ,DS含量,mg/mL;V,DS樣液體積,mL;100,100 g魚皮;m,魚皮質(zhì)量,g。

1.3.7 醋酸纖維素薄膜電泳

參考左格格等[10]的方法略作改動,取HA、CS、DS標(biāo)準(zhǔn)品及羅非魚皮DS樣品各5 mg,用蒸餾水配制成5 mg/mL。用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣后,在7 mA電流下電泳30 min,阿利新藍(lán)染色液染色20 min,最后用2%醋酸水溶液脫色30 min。

1.3.8 膠原蛋白提取率的測定

參照楊碧仙等[11]的方法測定樣品中的羥脯氨酸含量。通過測定膠原蛋白中羥脯氨酸的含量,乘以羥脯氨酸換算系數(shù),就可計算得到膠原蛋白的含量,如公式(2)、公式(3)所示:

m=ρ×C×V×11.1×10-6

(2)

Y2=m1/m2×100

(3)

式中:m,膠原蛋白含量,g;ρ,羥脯氨酸含量,μg/mL;C,稀釋倍數(shù);V,樣品體積,mL;11.1,羥脯氨酸與膠原蛋白的換算系數(shù);Y2,膠原蛋白提取率,%;m1,樣品中膠原蛋白質(zhì)量,g;m2,羅非魚皮中膠原蛋白總量,g。

1.3.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考CAO等[12]的方法,略作改動。使用分離膠濃度為8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),濃縮膠濃度為5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。將羅非魚皮膠原蛋白溶于0.5 mol/L醋酸配制成5 mg/mL的膠原蛋白液,與5×樣品緩沖液混合,100 ℃加熱8 min,4 000 r/min離心5 min,取15 μL上清液上樣。以80 V電壓濃縮20 min,至樣品在濃縮膠中濃縮成一條線后,電壓調(diào)為100 V繼續(xù)電泳90 min。電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色凝膠,并用脫色液脫色至分離膠背景無色,進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜掃描

將凍干樣品與干燥的KBr置于瑪瑙研缽中磨成細(xì)膩的粉末,裝樣,手動壓片,對樣品在4 000～500 cm-1內(nèi)進(jìn)行掃描圖譜,分辨率為2 cm-1。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果使用JMP Pro 16軟件進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),采用Origin 2021和 Design-Expert 8.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選結(jié)果

選取5種蛋白酶,并比較其對同時提取效果的影響,其中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的酶解pH值為7,堿性蛋白酶、胰蛋白酶的酶解pH值為8,胃蛋白酶的酶解pH值為3。如圖1所示,中性蛋白酶對DS的提取效果最好,顯著高于其他4種酶,對膠原蛋白的提取也有較好效果;胃蛋白酶被廣泛應(yīng)用于膠原蛋白的提取[13],對膠原蛋白的提取效果最好,所得到的羅非魚皮膠原蛋白提取率最高,但其對DS的提取效果較差,綜合考慮選擇中性蛋白酶用于DS與膠原蛋白的同時提取。

1-胃蛋白酶;2-木瓜蛋白酶;3-中性蛋白酶;4-堿性蛋白酶; 5-胰蛋白酶圖1 酶種類對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme species on DS yield and collagen extraction rate 注:圖中小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對同時提取效果的影響

在提取時間24 h、提取溫度30 ℃、料液比1∶30 (g∶mL)的酶解條件下,比較不同加酶量(3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g)對DS得率及膠原蛋白提取率的影響。如圖2所示,隨著加酶量的增加,蛋白酶與魚皮的接觸機(jī)會增多,DS得率及膠原蛋白的提取率呈現(xiàn)顯著上升趨勢,在加酶量達(dá)到6 000 U/g后,酶與底物的接觸趨于飽和,DS得率的上升趨于平緩,而膠原蛋白的提取率由于過量的酶導(dǎo)致膠原蛋白水解,呈現(xiàn)下降的趨勢。在加酶量為6 000和7 000 U/g時,DS得率及膠原蛋白的提取率變化不顯著,考慮到蛋白酶的過量使用會影響膠原蛋白的純度,本試驗(yàn)的加酶量選擇為6 000 U/g。

圖2 加酶量對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on DS yield and collagen extraction rate

2.2.2 提取時間對同時提取效果的影響

在加酶量6 000 U/g、提取溫度30 ℃、料液比1∶30(g∶mL)的酶解條件下,比較不同提取時間(8、16、24、32、40 h)對DS得率及膠原蛋白提取率的影響。如圖3所示,提取時間為8～24 h時,由于提取時間較短,酶對蛋白的水解不充分,DS未被完全釋放,隨著提取時間的延長,膠原蛋白非螺旋區(qū)被水解,膠原蛋白持續(xù)溶出,與DS連接的蛋白充分水解,DS持續(xù)釋放,DS得率及膠原蛋白提取率呈顯著上升趨勢,在提取時間為24 h時,DS得率及膠原蛋白提取率均達(dá)到最大值,延長提取時間,導(dǎo)致了DS的水解及膠原蛋白的過度酶解,DS得率及膠原蛋白提取率逐漸下降。本試驗(yàn)的提取時間選擇為24 h。

圖3 提取時間對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on DS yield and collagen extraction rate

2.2.3 提取溫度對同時提取效果的影響

在加酶量6 000 U/g、提取時間24 h、料液比1∶30(g∶mL)的酶解條件下,比較不同提取溫度(10、20、30、40、50 ℃)對DS得率及膠原蛋白提取率的影響。如圖4所示,提取溫度為10～30 ℃時,溫度的升高加速了蛋白酶的酶解反應(yīng)速率,DS得率顯著上升,30 ℃后,得率上升趨勢減緩;提取溫度為10～20 ℃時,膠原蛋白提取率有顯著增加,在提取溫度為20 ℃時達(dá)到提取率最大值,在提取溫度為20～30 ℃時,膠原蛋白提取率略有下降,但變化不明顯,繼續(xù)提高溫度,由于過高的溫度導(dǎo)致膠原蛋白變性,無法再通過鹽析進(jìn)行分離,膠原蛋白提取率有明顯下降。綜合考慮,本試驗(yàn)的提取溫度在30 ℃為佳。

圖4 提取溫度對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on DS yield and collagen extraction rate

2.2.4 料液比對同時提取效果的影響

在加酶量6 000 U/g、提取時間24 h、提取溫度30 ℃的酶解條件下,比較不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)]對DS得率及膠原蛋白提取率的影響(圖5)。

圖5 料液比對DS得率及膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of the liquid ratio on DS yield and collagen extraction rate

如圖5所示,料液比為1∶10～1∶40(g∶mL)時,DS得率及膠原蛋白提取率隨料液比的增大顯著上升,在1∶40(g∶mL)時DS得率及膠原蛋白提取率出現(xiàn)最大值,隨后開始下降。在較低的料液比下,酶解液黏度較大,不利于通過攪拌使蛋白酶與底物充分接觸,但過大的料液比會增加后續(xù)分離純化的成本。考慮經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作性,本試驗(yàn)將料液比固定為1∶40(g∶mL)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken模型進(jìn)行二次多元回歸方程設(shè)計,進(jìn)一步優(yōu)化同時提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.3.2 DS得率的響應(yīng)面結(jié)果分析

由表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到多元擬合回歸方程加酶量(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為:Y1=124.95-1.80A+4.99B-18.18C+6.42AB+8.59AC+0.37BC-5.25A2-4.37B2-31.47C2

由表3可知,此回歸模型P<0.000 1,模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.469 5>0.05不顯著,表示模型對實(shí)驗(yàn)的擬合度較高?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.989 3,校正決定系數(shù)R2=0.975 5,變異系數(shù)為3.30%<10%,說明羅非魚皮DS的提取實(shí)際值和預(yù)測值有較好的擬合相關(guān)性,試驗(yàn)的重復(fù)性較好。3個因素對羅非魚皮DS得率的影響為C>B>A,其中B、C為極顯著因素,A為不顯著因素。交互項(xiàng)AB、AC極顯著,BC不顯著,二次項(xiàng)C2極顯著,A2、B2顯著,表明這3個單因素對DS得率的影響不是簡單的線性關(guān)系,二次項(xiàng)和交互作用均對DS得率有較大影響。

表3 DS得率回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equations with DS yields

2.3.3 膠原蛋白提取率的響應(yīng)面結(jié)果分析

由表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到多元擬合回歸方程加酶量(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為:Y2=50.79-0.92A-1.60B-18.61C+0.29AB+1.38AC-0.64BC-6.38A2-3.59B2-13.69C2

由表4可知,此回歸模型P<0.000 1,模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.093 4>0.05不顯著,表示模型對實(shí)驗(yàn)的擬合度較高?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.994 3,校正決定系數(shù)R2=0.987 0,變異系數(shù)為4.50%<10%,說明羅非魚皮膠原蛋白的提取實(shí)際值和預(yù)測值有較好的擬合相關(guān)性,試驗(yàn)的重復(fù)性較好。

表4 膠原蛋白提取率回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for regression equation with collagen extraction rate

3個因素對羅非魚皮膠原蛋白提取率的影響為C>B>A,其中C為極顯著因素,B為顯著因素,A為不顯著因素。交互項(xiàng)AB、AC、BC不顯著,二次項(xiàng)C2極顯著,A2、B2顯著,表明這3個單因素之間的交互作用不明顯,對膠原蛋白提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過響應(yīng)曲面分析得到羅非魚皮DS及膠原蛋白的最佳提取條件為:中性蛋白酶加酶量5 925.36 U/g,提取時間25.79 h,提取溫度28.47 ℃,料液比1∶40(g∶mL),在此條件下,羅非魚皮DS得率為128.99 mg/100 g,膠原蛋白提取率為53.88%?？紤]到實(shí)際操作的可行性,將提取工藝修改為:中性蛋白酶加酶量5 930 U/g,提取時間25.8 h,提取溫度28.5 ℃,料液比1∶40(g∶mL),在此條件下羅非魚皮DS得率為132.12 mg/100 g(濕重計),膠原蛋白提取率為53.14%,與預(yù)測值接近,進(jìn)一步證明了該模型的可行性。

2.4 醋酸纖維素薄膜電泳分析

由于不同的糖胺聚糖之間的電荷密度存在差異,在醋酸纖維素薄膜上的遷移率不同,因此可以通過電泳圖上條帶的分布情況判斷樣品中含有的糖胺聚糖種類。條帶的灰度則可以反映糖胺聚糖的含量,根據(jù)條帶的深淺可以初步判斷樣品所含糖胺聚糖的組成。由圖6可知,羅非魚皮DS樣品的遷移率與DS、HA一致,DS顯色條帶下方有較淡條帶,這與SALLES等[14]報道的HS顯色條帶出現(xiàn)位置一致。DS顯色條帶顏色較深,HA、HS顯色條帶較淺,說明羅非魚皮DS樣品的主要成分為DS,還含有少量HA、HS。

圖6 羅非魚皮DS的電泳圖譜Fig.6 The cellulose acetate membrane electrophoresis of DS from tilapia skin

2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

由圖7可知,中性蛋白酶與胃蛋白酶酶解的羅非魚皮膠原蛋白均含2條α鏈(α1與α2)和1條β鏈,可以初步判斷出兩者均為典型的Ⅰ型膠原蛋白[15]。2種膠原蛋白均在相對分子質(zhì)量為130和110 kDa附近分別出現(xiàn)α1鏈和α2鏈,2條鏈的灰度比接近2∶1,這與Ⅰ型膠原蛋白典型的[α1]2α2結(jié)構(gòu)一致[16]。與胃蛋白酶相比,中性蛋白酶酶解的羅非魚皮膠原蛋白α鏈以下出現(xiàn)的低分子電泳條帶較少,表明中性蛋白酶在酶解過程中對膠原蛋白降解作用較小,對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的保留更完整。

1-Marker;2-中性蛋白酶酶解膠原蛋白; 3-胃蛋白酶酶解膠原蛋白圖7 羅非魚皮膠原蛋白的電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE pattern of collagens from tilapia skin

2.6 紅外光譜掃描分析

2.6.1 DS紅外光譜掃描分析

圖8 羅非魚皮DS紅外譜圖Fig.8 FTIR spectra of DS from tilapia skin

2.6.2 膠原蛋白紅外光譜掃描分析

圖9 羅非魚皮膠原蛋白紅外譜圖Fig.9 FTIR spectra of collagen from tilapia skin

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化羅非魚皮DS及膠原蛋白同時提取的工藝,最優(yōu)的提取工藝為中性蛋白酶加酶量5 930 U/g,提取時間25.8 h,提取溫度28.5 ℃,料液比1∶40(g∶mL),羅非魚皮DS得率可達(dá)132.12 mg/100 g(濕重計),膠原蛋白提取率可達(dá)53.14%,與預(yù)測值接近,說明響應(yīng)面法建立的模型穩(wěn)定可靠。醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果顯示羅非魚皮DS樣品除含有DS外,還含有少量HA、HS雜質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示羅非魚皮膠原蛋白為典型的Ⅰ型膠原蛋白。紅外光譜掃描結(jié)果顯示羅非魚皮DS及膠原蛋白的結(jié)構(gòu)完整,其中羅非魚皮DS樣品中還含有其他種類的糖胺聚糖,有待進(jìn)一步純化。結(jié)果表明優(yōu)化后的同時提取工藝具有較高的可行性,同時提取制備的DS及膠原蛋白具備典型特征,為羅非魚皮DS及膠原蛋白在食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了一定理論依據(jù)。