氨基甲酸乙酯水解酶可溶性表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

劉鳳松,李亞杰,李亞賢,龍夢(mèng)飛,陸智,*

1(無限極(中國)有限公司,廣東 廣州,510405)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是一種在發(fā)酵食品的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過程中生成的有毒物質(zhì),對(duì)人類具有潛在的致癌性[1]。據(jù)報(bào)道,發(fā)酵酒精飲料中的乙醇可增強(qiáng)EC的致癌性[2],因此,為保障食品的安全性,需要對(duì)黃酒、葡萄酒、清酒、白蘭地等發(fā)酵酒精飲料中EC的含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。黃酒中EC的含量上限為100 μg/L,而目前國內(nèi)黃酒釀造中EC的含量最高可達(dá)750 μg/L[3],這不但影響長(zhǎng)期飲酒者的健康,也會(huì)造成因未達(dá)到食品安全標(biāo)準(zhǔn)而影響出口的問題。減少食品中EC的主要方法有工藝優(yōu)化法[4]、發(fā)酵菌株的代謝工程改造法[5]和酶促降解法[6-7]。前兩種策略主要針對(duì)EC的底物和生成途徑進(jìn)行消減和改造,但這兩種策略會(huì)產(chǎn)生無法完全消減EC、EC降解效率低、食品風(fēng)味受損等問題。酶促降解法主要涉酸性脲酶[8]和EC水解酶[9],這2種酶能夠分別將尿素和EC轉(zhuǎn)化為乙醇、CO2和NH3[10-11]。脲酶是許多國家允許在發(fā)酵酒精飲料中添加的酶,它能通過有效地降解尿素(EC的前體)來控制EC的含量,但不能降解已形成的EC。EC水解酶可以直接水解EC,但EC水解酶難以在工業(yè)中得到應(yīng)用,主要由于其乙醇耐受性較差且可溶性表達(dá)量較低,易形成不溶于水的、難以應(yīng)用的包涵體。

目前,酶的改性策略包括理性設(shè)計(jì)[12]、定向進(jìn)化[13]和半理性設(shè)計(jì)[14]。LIU等[15]通過對(duì)雙功能脲酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,篩選出預(yù)計(jì)對(duì)酶活性影響較大的目標(biāo)氨基酸位點(diǎn),然后通過飽和突變篩選出了活性和乙醇耐受性提高的雙功能脲酶?？垫面肹16]通過多序列比對(duì)挖掘突變位點(diǎn)提高了來自Agrobacteriumtumefaciens的酰胺酶AmdA的活性和乙醇耐受性。酶的理性設(shè)計(jì)中,PROSS計(jì)算是一種在服務(wù)器中能夠?qū)崿F(xiàn)自由計(jì)算的程序,該程序通過將構(gòu)象自由能和序列保守性相結(jié)合,篩選出蛋白結(jié)構(gòu)中易產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊和不穩(wěn)定的區(qū)域進(jìn)行修飾和改造,從而達(dá)到可溶性表達(dá)和穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)的提高[17]。PELEG等[18]將PROSS作為獨(dú)立的應(yīng)用工具進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試,10個(gè)目標(biāo)蛋白中有9個(gè)熱穩(wěn)定性得到提高。此外,有2個(gè)野生型(wild type,WT)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中不能作為可溶性蛋白質(zhì)表達(dá),但經(jīng)PROSS設(shè)計(jì)改造后,實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá),并提高了熱穩(wěn)定性,證明PROSS可提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和可溶性表達(dá)水平。因此,利用PROSS對(duì)EC水解酶的整體結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行計(jì)算,可能獲得可溶性及穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)得到提升的高性能突變體。

此外,對(duì)蛋白可溶性表達(dá)的改造主要策略還有:針對(duì)蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化[19],以及針對(duì)蛋白本身添加標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)[20]等。表達(dá)條件的優(yōu)化主要是指改變蛋白表達(dá)過程中的某些條件,從而達(dá)到促進(jìn)蛋白正確折疊的目的,例如改變蛋白的表達(dá)溫度、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑濃度或在表達(dá)環(huán)境中添加化學(xué)分子伴侶等。李京京[21]曾通過調(diào)整EC水解酶的表達(dá)培養(yǎng)基、IPTG濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間以及添加蔗糖和山梨醇改變疏水滲透壓等方法來優(yōu)化EC水解酶的可溶性表達(dá)。融合標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)蛋白可溶性表達(dá)的原因主要有:融合標(biāo)簽對(duì)分子伴侶有一定吸引作用,從而使蛋白能夠在其指導(dǎo)下進(jìn)行折疊減少錯(cuò)誤概率;融合標(biāo)簽?zāi)軌蚋綦x錯(cuò)誤折疊區(qū)域,從而使正確折疊結(jié)構(gòu)暴露,增加其可溶性[22];融合標(biāo)簽所帶的靜電荷也可防止蛋白聚集從而形成包涵體[23]。

本研究以提高EC水解酶的工業(yè)屬性為目標(biāo),擬結(jié)合基于計(jì)算輔助的酶工程手段與促溶標(biāo)簽優(yōu)化表達(dá)等策略,改造獲得活力高、可溶性表達(dá)好、乙醇穩(wěn)定性強(qiáng)的高性能EC水解酶,為促進(jìn)EC水解酶的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

克隆宿主大腸桿菌EscherichiacoliJM109、表達(dá)宿主大腸桿菌E.coliBL21(DE3)、空質(zhì)粒pET-20b,實(shí)驗(yàn)室保藏;EC水解酶基因來源于LysinibacillusfusiformisSCO2 (GenBank ID: KU353448);酵母提取物、蛋白胨、NaCl、甘油、Na2HPO4、K2HPO4、亞硝基鐵氰化鈉、苯酚、NaClO、NaOH、三氯乙酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; IPTG、氨芐西林,上海生工生物工程有限公司;EC,美國Sigma公司;質(zhì)粒提取試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒、Fast Mutagenesis kit V2試劑盒,TaKaRa公司。引物由金唯智公司合成,本文所用引物和序列見表1。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 計(jì)算設(shè)計(jì)方法

將AlphaFold2所建模的EC水解酶結(jié)構(gòu)上傳至PROSS程序中,排除催化活性位點(diǎn)后進(jìn)行計(jì)算[24]。PROSS程序識(shí)別序列后生成同源序列,通過比對(duì)后可以得出高分突變結(jié)果,對(duì)突變結(jié)果計(jì)算自由能變化,并根據(jù)能量的高低進(jìn)行突變體的組合(https://pross.weizmann.ac.il)。此外,研究利用了2種通過支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)模型設(shè)計(jì)的標(biāo)簽,一種為已報(bào)道的通過機(jī)器學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)的通用促溶標(biāo)簽,另一種為利用MATLAB R2021b軟件對(duì)EC水解酶蛋白序列分析后得出的特定提高EC水解酶可溶性表達(dá)的促溶標(biāo)簽[25]。

1.2.2 突變體構(gòu)建及表達(dá)

以EC水解酶WT質(zhì)粒為模板,采用Fast Mutagenesis kit V2試劑盒進(jìn)行突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)造。采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株和TB培養(yǎng)基表達(dá)EC水解酶。重組菌株接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的20 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)。將接種量3%的種子液轉(zhuǎn)入含100 μg/mL氨芐青霉素的200 mL TB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.4時(shí)加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG,然后在25 ℃下培養(yǎng)18 h。

1.2.3 酶純化方法

菌株表達(dá)后離心收集,重懸于磷酸鹽緩沖液中。4 ℃超聲波處理30 min后,離心收集上清液。通過親和層析的方法純化與Ni+相連的帶His標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白酶。純化時(shí),先用含100 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白,再用300 mmol/L的咪唑磷酸鹽緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白,收集的洗脫蛋白經(jīng)超濾管濃縮脫鹽,適當(dāng)稀釋后用于酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定。

1.2.4 酶活性測(cè)定方法

通過反應(yīng)中NH3的生成來測(cè)定EC水解酶的活性[26]。在最佳反應(yīng)條件下單位時(shí)間降解EC產(chǎn)生1 μmol氨所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。酶活力測(cè)定方法:反應(yīng)底物1 mL 30 g/L的EC溶液,加入1 mL酶溶液37 ℃條件下反應(yīng)15 min,反應(yīng)結(jié)束后添加1 mL 10%三氯乙酸使酶失活。隨后加入1 mL顯色劑I (15 g苯酚和0.625 g硝普鈉溶解至250 mL)和1 mL顯色劑Ⅱ (13.125 g NaOH和7.5 mL NaClO溶解至250 mL) 混勻,37 ℃保溫20 min后將反應(yīng)體系稀釋至10 mL并在625 nm處測(cè)定樣品的吸光度,測(cè)定NH3含量。酶活性按公式(1)計(jì)算:

式中:ΔOD625,樣品與空白對(duì)照的吸光度值之差;n,酶溶液的稀釋倍數(shù);k,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù),15,反應(yīng)時(shí)間,min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法為:顯色劑Ⅰ和Ⅱ按照如上反應(yīng)方法和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L的NH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后測(cè)得吸光值并繪制吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定方法

為了測(cè)定蛋白的最佳反應(yīng)溫度,在不同溫度條件下(30～60 ℃)測(cè)定酶活性,計(jì)算各條件下的相對(duì)酶活力。為驗(yàn)證酶的穩(wěn)定性,將酶在不同溫度(30～60 ℃)下保溫30 min后再進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(5%～20%)下的酶活性,計(jì)算各條件下的相對(duì)酶活力為蛋白的乙醇耐受性。在不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇(5%～20%)下保溫1 h后測(cè)定蛋白酶活力,以表征其在乙醇中的穩(wěn)定性。通過改良的Bradford蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度以計(jì)算蛋白的比酶活力。在0～300 mmol/L的EC濃度范圍內(nèi)測(cè)定了WT EC水解酶及突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù),通過Origin軟件繪制了酶活性與底物濃度的關(guān)系,擬合Michaelis-Menten方程,得到Vmax和Km。按公式(2)計(jì)算kcat:

式中:E為摩爾濃度。

1.2.6 模擬酒樣實(shí)驗(yàn)方法

模擬酒樣中乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%,pH值為4.5,底物EC質(zhì)量濃度為500 μg/L。在模擬酒樣中加入終質(zhì)量濃度約為1.5 mg/mL的WT和突變型EC水解酶,在30 ℃下反應(yīng)12 h。反應(yīng)溶液分別在1、3、7、12 h后取樣,用GC-MS精確檢測(cè)殘留的EC以判斷其對(duì)EC的水解能力。在模擬酒樣中測(cè)定EC水解酶的最適pH,將模擬酒樣設(shè)置成不同pH值(4、5、6、7、8、9)后測(cè)定其在37 ℃中的酶活力。以模擬酒樣為底物測(cè)定金屬離子對(duì)EC水解酶活力的影響,將1 mmol/L的不同金屬離子(Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ba2+)及終濃度為0.1 mmol/L的化學(xué)試劑與酶液混合,然后于37 ℃條件下測(cè)定其在模擬酒樣中的酶活力。最后將模擬酒樣中的EC分別替換為同濃度的氨基甲酸甲酯(methyl carbamate, MC)、氨基甲酸丁酯(butyl carbamate, BC)、丙烯酰胺(acrylamide, AM)、甲基丙烯酰胺(methacrylamide, MAM),探究其對(duì)氨基甲酸酯類底物和酰胺類底物的水解能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于PROSS計(jì)算的EC水解酶突變體構(gòu)建及性質(zhì)表征

利用AlphaFold2對(duì)EC水解酶序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模,建模后上傳至PROSS程序進(jìn)行計(jì)算。PROSS的計(jì)算結(jié)果中共有9個(gè)突變體,其中突變位點(diǎn)最少的突變體包含了18個(gè)位點(diǎn)的突變,其余組合突變均突變了30個(gè)位點(diǎn)以上。通常情況下突變位點(diǎn)個(gè)數(shù)過多會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化過大從而使酶活力降低[27],所以本研究選擇了最少的18點(diǎn)突變體進(jìn)行了單突變位點(diǎn)的拆分和構(gòu)建。如圖1-a所示,大部分突變體的酶活性高于WT。其中酶活力提高最多的突變體為S21E,其比酶活力為2.47 U/mg,是WT比酶活力(1.89 U/mg)的1.31倍。如圖1-b所示,耐受性增加最多的3個(gè)位點(diǎn)為S21E、H197Y及S292L。S21E在5%乙醇的相對(duì)酶活力為88.32%,高于WT的64.26%,雖在20%乙醇的相對(duì)酶活力下降至11.26%但仍高于WT的8.12%。另2個(gè)位點(diǎn),在低乙醇濃度條件下所表現(xiàn)出的酶活力也較好,隨著乙醇濃度升高酶活力下降較緩慢,在20%乙醇下H197Y的相對(duì)酶活力為20.75%,P348I的相對(duì)酶活力為12.87%。

a-基于PROSS計(jì)算的單突變體相對(duì)酶活力;b-單突變體的乙醇耐受性;c-組合突變體的相對(duì)酶活力;d-組合突變體的乙醇耐受性圖1 基于計(jì)算設(shè)計(jì)的突變體的相對(duì)酶活力和乙醇耐受性Fig.1 Relative enzyme activity and ethanol tolerance of various mutants constructed by computer-aided design

為進(jìn)一步提高突變體的活性和乙醇耐受性,本研究選擇了酶活力及乙醇耐受性都提高較多的3個(gè)突變體:S21E、H197Y及P348I進(jìn)行組合突變。表達(dá)了S21E/H197Y、S21E/P348I、H197Y/P348I、S21E/H197Y/P348I并測(cè)定了其相對(duì)酶活力結(jié)果如圖1-c所示,其中酶活力提高最多的突變體S21E/P348I/P348I的酶活力為2.06 U/mg,僅為WT的1.09倍,提高效果較差。因此,本研究結(jié)合前期篩選得到的能夠提高EC水解酶活力的突變位點(diǎn)Q328C[28],構(gòu)建的新突變體S21E/H197Y/Q328C/P348I命名為EC4,EC4比酶活力為2.93 U/mg,相較于WT提高了約1.55倍。如圖1-d所示,20%乙醇中的相對(duì)酶活力為21.03%,相較于WT(8.2%)提高了約2.56倍。此外還測(cè)定了EC4的動(dòng)力學(xué)常數(shù)如表2所示,其Km值為29.31 mmol/L,小于WT的37.67 mmol/L,表明其對(duì)底物的親和力有所提高。

表2 野生型和突變體EC水解酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Enzymatic kinetic parameters of EC hydrolase WT and variants

2.2 融合標(biāo)簽優(yōu)化EC水解酶的表達(dá)

進(jìn)一步地,為提高EC水解酶的可溶性表達(dá),本研究選擇了兩大類融合標(biāo)簽優(yōu)化EC水解酶的表達(dá),其中一類為通過機(jī)器學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)獲得的短促溶標(biāo)簽,分別為已報(bào)道的通用標(biāo)簽SVM1、SVM2及本研究針對(duì)EC水解酶計(jì)算所得的促溶標(biāo)簽SVM3。另一類為幾個(gè)天冬氨酸所組成的短肽,有研究認(rèn)為在蛋白的氮端添加帶負(fù)電的氨基酸可以幫助蛋白更好的折疊和表達(dá),而天冬氨酸的輔助效果會(huì)優(yōu)于谷氨酸,機(jī)器學(xué)習(xí)所選擇的短促溶標(biāo)簽主要由谷氨酸組成,因此研究選擇5個(gè)和7個(gè)天冬氨酸所組成的短肽作為促溶標(biāo)簽與EC水解酶相連,探究其對(duì)EC水解酶可溶性表達(dá)的提高效果[29]。上述5種短促溶標(biāo)簽序列見表3。

表3 促溶標(biāo)簽序列Table 3 Sequence of solubility-enhancing tag

如圖2-a所示,標(biāo)簽SVM1和5D對(duì)EC水解酶活力的提高最多,其中SVM1-EC4的酶活力為26.06 U/mL,約為WT的1.82倍。而5D-EC4的酶活力為23.06 U/mL,約為WT的1.61倍,添加其余5種標(biāo)簽后酶活力高于WT卻低于EC4。

a-相對(duì)酶活力;b-表達(dá)驗(yàn)證(S為上清液,P為沉淀)圖2 含不同融合標(biāo)簽的EC4的活力與表達(dá)性能表征Fig.2 Characterization of the activity and expression performance of EC4 with different fusion tags

如圖2-b所示,添加促溶標(biāo)簽的EC水解酶表達(dá)條帶均粗于WT和EC4的表達(dá)條帶,且沉淀中的包涵體含量也有所減少。其中,SVM1-EC上清液中EC水解酶對(duì)應(yīng)的條帶最粗,表明其可溶性表達(dá)提高最明顯。

2.3 含不同融合標(biāo)簽EC4的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

如圖3-a所示,其中SVM1-EC4和SVM2-EC4的最適溫度為45 ℃,在所有酶中最高,隨著溫度的升高,酶活力呈現(xiàn)出緩慢的下降趨勢(shì),在50 ℃下SVM1-EC4仍保留35.66%的相對(duì)酶活力,高于WT的16.08%。如圖3-b所示,溫度穩(wěn)定性波動(dòng)趨勢(shì)與最適溫度相似,均在40 ℃附近出現(xiàn)下降趨勢(shì),其中下降趨勢(shì)較為緩慢的酶是SVM1-EC4,可能是由于標(biāo)簽蛋白的添加增強(qiáng)了EC水解酶整體的穩(wěn)定性。

a-最適溫度;b-溫度穩(wěn)定性圖3 含不同融合標(biāo)簽的EC4的最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.3 Optimal temperature and temperature stability of EC4 with different fusion tags

2.4 含不同融合標(biāo)簽EC4的乙醇耐受性及乙醇耐受穩(wěn)定性

在乙醇耐受性和乙醇穩(wěn)定性的測(cè)定中,SVM1-EC4表現(xiàn)較好,如圖4-a所示,其在15%乙醇中的相對(duì)酶活力為65.32%,是WT的3.99倍,高于連接其他融合標(biāo)簽的EC4;20%乙醇的相對(duì)酶活力為31.15%,是WT的3.80倍。如圖4-b所示,隨著乙醇濃度的升高這幾種酶的酶活力下降速度變快,SVM1-EC4在5%乙醇的相對(duì)酶活力最高是58.15%,但在20%乙醇的相對(duì)酶活力僅有10.87%。5D-EC4則更加穩(wěn)定,其在15%乙醇保溫的相對(duì)酶活力仍有27.41%,為WT的2.98倍。

2.5 SVM1-EC4在模擬酒樣中的應(yīng)用

綜合考量改造后EC水解酶活力、溫度穩(wěn)定性及乙醇穩(wěn)定性的提高效果后,本研究選擇SVM1-EC4進(jìn)行進(jìn)一步的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定。通過模擬真實(shí)酒樣條件下反應(yīng)12 h后SVM1-EC4和WT消減EC的量來判斷其對(duì)EC的水解能力,結(jié)果如圖5-a所示,SVM1-EC4消減EC的能力為WT的2.07倍。此外,研究通過調(diào)整模擬酒樣的pH來測(cè)定SVM1-EC4最適pH,結(jié)果如圖5-b所示,pH=7.0時(shí)的酶活力最高,在pH值為6或8時(shí),SVM1-EC4仍能保持50%以上的相對(duì)酶活,但其酶活力在pH 4～5及pH=9條件下很低,僅有5%。如圖5-c所示,其中Mg2+對(duì)其酶活力有微弱促進(jìn)作用,Ba2+對(duì)該酶有輕微抑制作用,Cu2+對(duì)其抑制作用最強(qiáng)。如圖5-d所示,SVM1-EC4對(duì)MC和一些酰胺類物質(zhì)較好的水解作用,但幾乎不能水解BC。

a-乙醇耐受性;b-乙醇耐受穩(wěn)定性圖4 含不同融合標(biāo)簽的EC4的乙醇耐受性和 乙醇耐受穩(wěn)定性Fig.4 Ethanol tolerance and ethanol tolerance stability of EC4 with different fusion tags

a-SVM1-EC4在模擬酒樣中的應(yīng)用;b-SVM1-EC4在模擬酒樣中的最適pH;c-金屬離子對(duì)SVM1-EC4的影響; d-SVM1-EC4對(duì)不同酰胺類物質(zhì)的水解能力圖5 SVM1-EC4在模擬酒樣中的酶學(xué)性質(zhì)Fig.5 Enzymatic properties of SVM1-EC4 in simulated wine samples

3 結(jié)論

本研究結(jié)合計(jì)算和融合標(biāo)簽來優(yōu)化EC水解酶的穩(wěn)定性及可溶性。基于PROSS計(jì)算獲得四突變體S21E/H197Y/Q328C/P348I,其酶活力相較于WT提高了1.55倍,在20%乙醇中的相對(duì)酶活力為21.03%,相較于WT(8.2%)提高了約2.56倍。其次,選擇了基于SVM模型設(shè)計(jì)的SVM1、SVM2、SVM3標(biāo)簽以及由不同數(shù)量天冬氨酸組成的短肽標(biāo)簽探究其對(duì)EC水解酶可溶性表達(dá)的影響。SVM1-EC4的可溶性表達(dá)提高最顯著,且在15%乙醇中的相對(duì)酶活性是WT的3.99倍。最后,進(jìn)一步探究了SVM1-EC4水解酶酶學(xué)性質(zhì)及在模擬酒樣中的應(yīng)用,在模擬酒樣中反應(yīng)12 h后SVM1-EC4消減EC的量為WT的2.07倍。SVM1-EC4在pH=7.0條件下的酶活力最高,Mg2+對(duì)其有微弱促進(jìn)作用,對(duì)除BC以外的MC、AM和MAM有較好的水解作用?？傊?本研究利用基于計(jì)算輔助改造與融合標(biāo)簽相結(jié)合的優(yōu)化改造策略有望促進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中酶法降解EC的工業(yè)化應(yīng)用。