天名精內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗肝癌活性研究

張藝 姚思凡 孫伍慧 歐陽(yáng)琳 趙碧清 周小江

〔摘要〕 目的 對(duì)天名精內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定，并從中篩選出具有抗肝癌作用的活性菌株，為尋找新的抗肝癌先導(dǎo)化合物提供菌株資源。方法 采用植物組織切塊法和平板劃線法對(duì)天名精內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化；MTT法篩選對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用的活性菌株，并計(jì)算活性顯著內(nèi)生真菌的IC50值；運(yùn)用形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定的方法對(duì)活性菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果 從天名精中共分離得到60株內(nèi)生真菌，其中TMJ-03、TMJ-13、TMJ-15、TMJ-23、TMJ-54為活性內(nèi)生真菌，其發(fā)酵物抑制HepG2細(xì)胞增殖的IC50值分別為19.49（TMJ-C-03）、31.13（TMJ-C-13）、88.65（TMJ-C-15）、37.42（TMJ-D-23）、17.22（TMJ-D-54）、32.72（TMJ-C-54） μg·mL-1。5株活性菌株均鑒定到種，分別為Aspergillus terreus、Chaetomium globosum、Alternaria tillandsiae、Fusarium proliferatum、Alternaria arborescens。結(jié)論 首次從天名精中篩選出對(duì)HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用的活性內(nèi)生真菌，為尋找新的抗肝癌藥物提供了菌株資源。

〔關(guān)鍵詞〕 天名精；內(nèi)生真菌；分離鑒定；抗肝癌；HepG2細(xì)胞；活性菌株

〔中圖分類號(hào)〕R284.1；R285.5? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.007

Isolation， identification， and anti-hepatoma activity of endophytic

fungi from Carpesium abrotanoides

ZHANG Yi1， YAO Sifan1， SUN Wuhui1， OUYANG Lin1， ZHAO Biqing1， ZHOU Xiaojiang1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Engineering Technology Research Center for Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To isolate and identify endophytic fungi from Carpesium abrotanoides and screen active strains with anti-hepatoma effects， so as to provide strain resources for the development of new anti-hepatoma lead compounds. Methods The endophytic fungi were isolated and purified from Carpesium abrotanoides by plant tissue culture and scribing method， the active strains with inhibitory effects on the proliferation of HepG2 cells were screened by MTT， and the IC50 value of the notably active endophytic fungi was calculated. Morphological and molecular identification were then applied for the identification of active strains. Results Sixty strains of endophytic fungi were isolated from Carpesium abrotanoides， among which， TMJ-03， TMJ-13， TMJ-15， TMJ-23， and TMJ-54 were active. The IC50 values of their fermentation products inhibiting the proliferation of HepG2 cells were 19.49 （TMJ-C-03）， 31.13 （TMJ-C-13）， 88.65 （TMJ-C-15）， 37.42 （TMJ-D-23）， 17.22 （TMJ-D-54）， and 32.72 （TMJ-C-54） μg·mL-1， respectively. These five active strains have been identified to species level， namely Aspergillus terreus， Chaetomium globosum， Alternaria tillandsiae， Fusarium proliferatum， and Alternaria arborescens. Conclusion The active endophytic fungi with inhibitory effects on the HepG2 cell proliferation were screened from Carpesium abrotanoides for the first time， which can provide strain resources for the development of new anti-hepatoma drugs.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Carpesium abrotanoides; endophytic fungi; isolation and identification; anti-hepatoma; HepG2 cells; active strains

內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指在其生活史的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害癥狀的真菌[1-2]。內(nèi)生真菌在與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了互惠共生關(guān)系，許多內(nèi)生真菌帶有植物體的酶系，使得內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有與宿主相似的藥理作用[3-4]。自STROBEL等[5]從短葉紅豆杉的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae中得到紫杉醇以來(lái)，植物內(nèi)生真菌迅速被國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)，藥用植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的多樣性為尋找新穎天然活性化合物提供了有效途徑[6]。

天名精為菊科植物天名精Carpesium abrotanoides L.的干燥全草。味辛，性寒，歸肝、肺經(jīng)，有清熱解毒、散瘀止痛、止血及殺蟲(chóng)的功效，可用于治療牙痛、胃潰瘍、膿腫、扁桃體炎、支氣管炎、細(xì)菌感染、瘀傷、腫脹、病毒感染、蟲(chóng)積等[7-9]。天名精含有倍半萜、倍半萜二聚體、單萜、甾醇和含氮化合物等多種成分，具有抗腫瘤、抗寄生蟲(chóng)、抗炎、抗氧化和抗病毒等生物活性[9-12]。目前，天名精的研究主要集中于化學(xué)成分、藥理活性、臨床應(yīng)用等領(lǐng)域[13-15]，對(duì)其內(nèi)生真菌多樣性的研究尚未有報(bào)道。近年來(lái)從天名精中分離得到的化合物特勒內(nèi)酯、2α，5α-dihydroxy-11αH-eudesma-4（15）-en-12，8β-olide、2-去氧-4-表-天人菊靈、oxoeudesm-11（13）-eno-12，8α-lactone、2，3-Dihydroaromomaticin、11（13）-去氫腋生依瓦菊素、5α-Epoxyal？鄄antolactone、Ivalin等均對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用[16-18]，根據(jù)互惠共生關(guān)系，天名精內(nèi)生真菌中可能產(chǎn)生與天名精相同或相似的抗肝癌活性成分，為了更好地開(kāi)發(fā)利用天名精內(nèi)生真菌資源，本課題組對(duì)天名精內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，獲得抗肝癌活性菌株，旨在為將來(lái)新型抗肝癌活性成分發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 藥材

天名精于2021年11月采自湖南中醫(yī)藥大學(xué)含浦校區(qū)周邊，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為菊科植物天名精C. abrotanoides L.的新鮮全草。

1.2? 主要儀器與試劑

HERAcell 150i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、ST8/ST8R高速冷凍離心機(jī)、Multiskan FC酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；SW-CJ-1C超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ATX124 電子天平（東京島津儀器有限公司）。

青霉素-鏈霉素溶液（批號(hào)：WH1022C211）、HepG2專用培養(yǎng)基（批號(hào)：WHAA23N022）、0.25% EDTA-胰蛋白酶溶液（批號(hào)：WH2622U261）均購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司；MTT噻唑藍(lán)（批號(hào)：163880，上海陶術(shù)生物科技有限公司）；二甲基亞砜（批號(hào)：401Q0313，北京索萊寶科技有限公司）；順鉑（批號(hào)：153593，MedChemExpress公司）。

1.3? 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，純凈水1 L。PDA-抗生素培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加青霉素使?jié)舛葹?00.0 mg·mL-1。大米培養(yǎng)基：大米200 g，純凈水100 mL。糙米培養(yǎng)基：糙米80 g，純凈水120 mL。

2 方法

2.1? 內(nèi)生真菌的分離和純化

取天名精新鮮植株，蒸餾水沖洗干凈后，剪切成2 cm左右的片塊，在超凈工作臺(tái)用75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3～4次，2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，無(wú)菌水清洗5次后吸干表面水分，修剪去末端暴露組織，新切口接種于PDA-抗生素培養(yǎng)基平板，每板接種4～5塊片，封口膜密封，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，待接種植物組織周圍長(zhǎng)出菌絲時(shí)，用接種環(huán)挑取新長(zhǎng)菌絲至PDA平板，如此反復(fù)純化直至得到單一菌株。以最后1次清洗植物的無(wú)菌水作為無(wú)菌參照，確保分離得到的菌株為天名精內(nèi)生真菌。將純化好的菌株接種至斜面培養(yǎng)基中，4 ℃保存。

2.2? 內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將4 ℃保存的菌株接種至PDA平板培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱中活化7 d后，分別切塊接種至不同培養(yǎng)基中發(fā)酵，具體如下：大米培養(yǎng)基接種帶菌平板后，常溫下靜置25 d，進(jìn)行發(fā)酵；糙米培養(yǎng)基接種帶菌平板后，常溫下靜置40 d，進(jìn)行發(fā)酵。

2.3? 內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物的制備

菌株發(fā)酵結(jié)束后，加入等體積乙酸乙酯，將大米（糙米）帶菌培養(yǎng)基搗碎，浸泡過(guò)夜，超聲提取3次，每次10 min，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙酸乙酯，得提取物，備用。

2.4? 內(nèi)生真菌抑制HepG2細(xì)胞增殖活性測(cè)定

2.4.1? MTT法篩選抑制HepG2細(xì)胞增殖的活性菌株? 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，按5×104的密度，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液。給藥組（即120個(gè)內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物組TMJ-大米-1～TMJ-大米-60和TMJ-糙米-1～TMJ-糙米-60后續(xù)為了簡(jiǎn)便大米用D表示，糙米用C表示）加入250 μg·mL-1的天名精內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物工作液，陽(yáng)性藥組加入250 μg·mL-1的順鉑工作液，正常對(duì)照組加入含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每孔100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加100 μL MTT溶液（0.5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，避光條件下小心吸棄上清液，避免吸去紫色結(jié)晶。每孔加150 μL

DMSO，震搖10 min，于490 nm波長(zhǎng)下，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。重復(fù)3次，計(jì)算各組抑制率，結(jié)果以均值表示。抑制率=[（正常對(duì)照組-給藥組）/正常對(duì)照組]×100%

2.4.2? 活性菌株抑制HepG2細(xì)胞增殖的IC50值測(cè)定? 按照MTT法檢測(cè)，具體操作同上。給藥組加入不同濃度（0、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）含藥培養(yǎng)基，正常對(duì)照組加入含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取均值并繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算IC50值。

2.5? 活性內(nèi)生真菌的鑒定

2.5.1? 形態(tài)特征? 將純化好的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，將滅菌的蓋玻片以45°角斜插入培養(yǎng)基中制作菌絲玻片，倒置顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態(tài)，參考《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株類型進(jìn)行初步鑒定。

2.5.2? 分子生物學(xué)鑒定? 采用真菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA，用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'），ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTG？鄄ATATGC-3'）擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL：PCR Mix 21 μL，Primer F（5p） 1 μL，Primer R（5p） 1 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性5 min；96 ℃變性20 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序片段用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，通過(guò)MEGA 7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）、基于Kimura 2-parameter距離構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并以自展法Bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)，自展次數(shù)設(shè)為1 000次。

3 結(jié)果

3.1? 內(nèi)生真菌的分離與活性菌株的篩選

從新鮮天名精中共分離得到60株內(nèi)生真菌，分別為T(mén)MJ-1～TMJ-60，其中大米培養(yǎng)基中菌株TMJ-（13、15、23、51、54），糙米培養(yǎng)基中菌株TMJ-（2、3、6、7、13、15、23、37、40、43、51、54），對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯抑制作用（圖1），這表明以上12株內(nèi)生真菌為活性內(nèi)生真菌。

3.2? 活性菌株抑制HepG2增殖的IC50值

計(jì)算出各組的抑制率，通過(guò)Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析測(cè)出各藥物的IC50值，本文僅記錄活性顯著的內(nèi)生真菌即IC50值小于100 μg·mL-1?；钚跃旮鹘M抑制率，隨藥物濃度遞增，抑制率變大，抑制效果越強(qiáng)，菌株TMJ-54的大米發(fā)酵物在質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時(shí)抑制率最大，為94.49%。在活性菌株發(fā)酵提取物抑制HepG2細(xì)胞增殖的IC50值中，TMJ-D-54的IC50值最小，為17.22 μg·mL-1，說(shuō)明TMJ-54的大米發(fā)酵物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制能力在這5株活性菌株當(dāng)中最強(qiáng)。詳見(jiàn)表1。

3.3? 活性內(nèi)生真菌的鑒定

3.3.1? 形態(tài)學(xué)鑒定

3.3.1.1? 菌株TMJ-03特征? 在PDA培養(yǎng)基上菌落邊緣不整齊，呈圓形或近圓形，中心稍隆起，質(zhì)地為絨毛狀，淡黃色至黃褐色（圖2a），背面為淡黃色（圖2b）。菌絲無(wú)色，有隔（圖2c），分生孢子頭呈疏松放射狀，黑褐色色素沉積，分生孢子梗光滑、透明，分生孢子為球形（圖2d），根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征觀察，初步鑒定為曲霉屬真菌。

3.3.1.2? 菌株TMJ-13特征? 在PDA培養(yǎng)基上菌落為羊毛狀或棉花狀，初起白色狀菌落，后來(lái)變?yōu)殚蠙炀G色或棕灰色（圖2e），背面灰色至黑色（圖2f）。兩周時(shí)隱約可見(jiàn)白色菌落中心散布灰色或黑色子囊殼小點(diǎn)，反面呈棕色至棕紅色。菌絲有隔，無(wú)色（圖2g），子囊殼球狀暗棕色至黑色，單個(gè)或聚集成團(tuán)，外被各種形狀的附屬絲，附屬絲棕色（圖2h），根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征觀察，初步鑒定為毛殼屬真菌。

3.3.1.3? 菌株TMJ-15特征? 在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲初為白色，后為灰粉色至灰色，外觀絨毛狀（圖2i），背面橘紅色后變黑色（圖2j），菌絲無(wú)色、透明有隔膜，分生孢子梗直立或膝狀，分支或不分支（圖2k），分生孢子有的無(wú)喙，有的具柱狀假喙，形狀變化極大，卵形、橢圓形、倒棍棒形，表面有縊縮，淡褐色或深褐色，有橫隔膜1～6個(gè)（圖2l），根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征觀察，初步鑒定為鏈格孢屬真菌。

3.3.1.4 菌株TMJ-23特征? 在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形，菌絲白色疏松、絮狀（圖2m），背面黃色，略帶粉色（圖2n）。菌絲具隔膜，無(wú)色，小型分生孢子狹長(zhǎng)圓形，較多（圖2o），大型分生孢子，紡錘形或鐮刀形，較粗壯，稍彎曲，較少（圖2p），根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征觀察，初步鑒定為鐮刀屬真菌。

3.3.1.5? 菌株TMJ-54特征? 在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲初為白色，后為綠褐色至黑褐色，外觀絨毛狀（圖2q），背面黑色（圖2r），菌絲有隔膜，無(wú)色、透明，分生孢子梗直立或膝狀，分支或不分支（圖2s），分生孢子同TMJ-15（圖2t），根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征觀察，初步鑒定為鏈格孢屬真菌。

3.3.2? ITS序列分析鑒定? ITS擴(kuò)增序列為ITS1和ITS2，大小為600 bp左右（圖3）。基于真菌的ITS序列比對(duì)結(jié)果以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)活性內(nèi)生真菌進(jìn)行分子鑒定。

菌株TMJ-03與Aspergillus terreus（MT530046.1）聚類在同一進(jìn)化支上，ITS序列的同源性為100%，鑒定為A. terreus（圖4）；菌株TMJ-13與Chaetomium globosum（MT420609.1）聚類在同一進(jìn)化支上，ITS序列完全匹配，同源性為100%，鑒定為C. globosum；菌株TMJ-15與Alternaria tillandsiae（KU144925.1）聚類在同一進(jìn)化支上，ITS序列的同源性為99%，鑒定為A. tillandsiae；菌株TMJ-23與Fusarium proliferatum（MK611678.1）聚類在同一進(jìn)化支上，ITS序列的同源性為100%，鑒定為F. proliferatum；菌株TMJ-54與菌株Alternaria. arborescens（MT420628.1）構(gòu)成一個(gè)支持力100%的分支，ITS序列的同源性為100%，鑒定為A. arborescens。經(jīng)NCBI序列比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，初步將菌株TMJ-03鑒定為A. terreus；TMJ-13鑒定為C. globosum；TMJ-15鑒定為A.tillandsiae；TMJ-23鑒定為F. proliferatum；TMJ-54鑒定為A. arborescens。

4 討論

本研究首次對(duì)天名精內(nèi)生真菌進(jìn)行系統(tǒng)分離培養(yǎng)，共得到60株內(nèi)生真菌。對(duì)分離得到的60株內(nèi)生真菌分別進(jìn)行大米、糙米培養(yǎng)基發(fā)酵，采用MTT法對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物抑制HepG2細(xì)胞增殖作用進(jìn)行了篩選，最終得到5株抗肝癌活性較好的內(nèi)生真菌。經(jīng)鑒定5株活性內(nèi)生真菌分別屬于曲霉屬Aspergillus、毛殼菌屬Chaetomium、鏈格孢屬Alternaria和鐮刀菌屬Fusarium，以上4屬內(nèi)生真菌，均有抗肝癌活性報(bào)道。比如，青蒿內(nèi)生真菌毛殼菌屬Chaetomium菌株分離得到的化合物毛殼球菌素W，具有較好的抗肝癌活性[19]。毛葡萄Vitis quinquangularis內(nèi)生真菌鏈格孢屬Alternaria菌株分離得到的化合物alterperylenol能夠抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡和鐵死亡[20]。黃芪內(nèi)生真菌曲霉屬Aspergillus菌株分離得到的喜樹(shù)堿能夠抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，其IC50值為0.9 mmol·L-1[21]。Dysosma diffomis內(nèi)生真菌曲霉屬Aspergillus菌株發(fā)酵提取物具有較強(qiáng)的抗癌活性其IC50<5 μg·mL-1，利用高效液相分析發(fā)現(xiàn)該提取物中含有鬼臼毒素，提示該內(nèi)生真菌可作為鬼臼毒素的潛在來(lái)源[22]。由此可見(jiàn)，本研究分離培養(yǎng)的天名精活性內(nèi)生真菌具有抗肝癌活性成分的潛力，但其抗肝癌的具體成分還有待深入研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)天名精內(nèi)生真菌A. arborescens（TMJ-54）的大米發(fā)酵物和糙米發(fā)酵物均對(duì)HepG2細(xì)胞具有較好的抑制作用，與TMJ-54菌株同屬的A. alternate L-10菌株產(chǎn)生的兩種具有新骨架的聚酮化合物，alternatones A-B （1-2），其中alternatone A （1）對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性[23]。紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Alternaria sp.分離得到的3個(gè)新化合物resveratrodehydes A-C （1-3），均對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用（IC50<50 μmol·L-1）[24]。Vitis quinquangularis內(nèi)生真菌鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌中分離出一對(duì)具有新骨架的對(duì)映體聚酮化合物（±）alternamgin，其中（-）alternamgin對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，且在一定程度上能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[25]。因此，推斷TMJ-54菌株發(fā)酵物有可能存在新的抗肝癌活性成分，值得進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究篩選出的活性內(nèi)生真菌可能為潛在的新型抗肝癌活性成分的來(lái)源，今后將對(duì)活性菌株的次生代謝產(chǎn)物和抗肝癌作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以期為開(kāi)發(fā)新型抗肝癌藥物打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] YAN L， ZHU J， ZHAO X X， et al. Beneficial effects of endophytic fungi colonization on plants[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2019， 103（8）： 3327-3340.

[2] CUI J L， WANG Y N， JIAO J， et al. Fungal endophyte-induced salidroside and tyrosol biosynthesis combined with signal cross-talk and the mechanism of enzyme gene expression in Rhodiola crenulata[J]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 12540.

[3] DEVI R， VERMA R， DHALARIA R， et al. A systematic review on endophytic fungi and its role in the commercial applications[J]. Planta， 2023， 257（4）： 70.

[4] 李露瑩， 王彥多， 劉振亮， 等. 一株特殊生境荒漠藥用植物沙蓬內(nèi)生真菌Rhinocladiella similis中苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯化合物[J]. 菌物學(xué)報(bào)， 2020， 39（3）： 589-598.

[5] STROBEL G， STIERLE A， STIERLE D， et al. Taxomyces andreanae， a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew （Taxus brevifolia）[J]. Mycotaxon， 1993， 47： 71-80.

[6] 王旭東， 李秋月， 王佳麗， 等. 杜鵑屬植物內(nèi)生真菌的分離及對(duì)赤擬谷盜和馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的防治作用[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2023， 39（5）： 1113-1123.

[7] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志： 第二十七卷[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1979.

[8] 湖南省食品藥品監(jiān)督管理局. 湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)： 2009年版[M]. 長(zhǎng)沙： 湖南科學(xué)技術(shù)出版社， 2009： 276-277．

[9] IBRAHIM S R M， FADIL S A， FADIL H A， et al. Ethnobotanical uses， phytochemical composition， biosynthesis， and pharmacological activities of Carpesium abrotanoides L. （Asteraceae）[J]. Plants， 2022， 11（12）： 1598.

[10] YANG Y X， SHAN L， LIU Q X， et al. Carpedilactones A-D， four new isomeric sesquiterpene lactone dimers with potent cytotoxicity from Carpesium faberi[J]. Organic Letters， 2014， 16（16）： 4216-4219.

[11] 陳迪路， 李? 玄， 周小江. 天名精屬植物的倍半萜類成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2020， 45（1）： 37-51.

[12] HE Y Q， CAI L， QIAN Q G， et al. Anti-influenza A （H1N1） viral and cytotoxic sesquiterpenes from Carpesium abrotanoides[J]. Phytochemistry Letters， 2020， 35： 41-45.

[13] 楊寶嘉， 曾政權(quán)， 宋? 玉， 等. 天名精萜類成分及其抗腫瘤活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2021， 33（6）： 951-955.

[14] 姚思凡， 陳迪路， 張? 藝， 等. 天名精總倍半萜內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 42（8）： 1255-1260.

[15] 楊秀穎， 張? 雯， 袁天翊， 等. 中藥鶴虱的歷史認(rèn)識(shí)與評(píng)價(jià)[J]. 中藥藥理與臨床， 2018， 34（5）： 153-155.

[16] SHEN B B， YANG Y P， WAN D， et al. Sesquiterpene lactones isolated from Carpesium abrotanoides L. by LC-MS combined with HSCCC inhibit liver cancer through suppression of the JAK2/STAT3 signaling pathway[J]. Medicinal Chemistry Research， 2022， 31（3）： 436-445.

[17] YANG B J， WANG J， ZENG Z Q， et al. Sesquiterpene lactones from Carpesium abrotanoides L. and their activity in inducing protective autophagy[J]. Natural Product Research， 2022， 36（12）： 3207-3210.

[18] LI L， ZHENG B B， MA L S， et al. Telekin suppresses human hepatocellular carcinoma cells in vitro by inducing G2/M phase arrest via the p38 MAPK signaling pathway[J]. Acta Pharmacologica Sinica， 2014， 35（10）： 1311-1322.

[19] ZHANG J， GE H M， JIAO R H， et al. Cytotoxic chaetoglobosins from the endophyte Chaetomium globosum[J]. Planta Medica， 2010， 76（16）： 1910-1914.

[20] XI J M， TIAN L L， XI J H， et al. Alterperylenol as a novel thioredoxin reductase inhibitor induces liver cancer cell apoptosis and ferroptosis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2022， 70（50）： 15763-15775.

[21] EL-SAYED A S A， ZAYED R A， EL-BAZ A F， et al. Bioprocesses optimization and anticancer activity of camptothecin from Aspergillus flavus， an endophyte of in vitro cultured Astragalus fruticosus[J]. Molecular Biology Reports， 2022， 49（6）： 4349-4364.

[22] THI TRAN H， THU NGUYEN G， THI NGUYEN H H， et al. Isolation and cytotoxic potency of endophytic fungi associated with Dysosma difformis， a study for the novel resources of podophyllotoxin[J]. Mycobiology， 2022， 50（5）： 389-398.

[23] ZHANG X， LIU X X， XING Y N， et al. Alternatones A and B， two polyketides possessing novel skeletons from entophyte Alternaria alternate L-10[J]. Journal of Asian Natural Products Research， 2022， 24（4）： 353-360.

[24] WANG J H， COX D G， DING W J， et al. Three new resveratrol derivatives from the mangrove endophytic fungus Alternaria sp[J]. Marine Drugs， 2014， 12（5）： 2840-2850.

[25] WU J C， HOU Y N， XU Q H， et al. （±）-Alternamgin， a pair of enantiomeric polyketides， from the endophytic fungi Alternaria sp. MG1[J]. Organic Letters， 2019， 21（5）： 1551-1554.