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    披針葉黃華中2株蠕形分生孢子內(nèi)生真菌的鑒定

    2015-10-13 21:47孫大林等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年18期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)生真菌鑒定

    孫大林等

    摘要:對披針葉黃華(Thermopsis lanceolata)中分離的編號為SP01、RM02的2株蠕形分生孢子內(nèi)生真菌進(jìn)行種屬分類鑒定。觀察真菌的形態(tài),提取真菌DNA,擴(kuò)增并測定其ITS、GAPDH序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合形態(tài)特征和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果,并對其進(jìn)行種屬分類。結(jié)果表明,SP01菌株的形態(tài)特征與凸臍孢屬(Exserohilum)中的E. rostratum最為相似,與E. rostratum的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切;RM02菌株的形態(tài)特征與彎孢屬(Curvularia)中C. spicifera、C. australiensis最為相似,與C. spicifera的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。確定披針葉黃華中分離的SP01、RM02分別為E. rostratum和C. spicifera。

    關(guān)鍵詞:披針葉黃華(Thermopsis lanceolata);內(nèi)生真菌;蠕形分生孢子真菌;鑒定

    中圖分類號:S432 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2015)18-4473-06

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.021

    近年研究表明,諸多藥用植物內(nèi)生真菌能夠合成具有生物活性作用的次生代謝產(chǎn)物[1-4],通過人工選育和體外培養(yǎng),該類真菌可以大量合成各種生物活性物質(zhì)[5],是新型藥物開發(fā)的重要資源。此外,內(nèi)生真菌與宿主植物間存在著復(fù)雜的共生關(guān)系,具有提高植物抗病抗逆性、促進(jìn)植物生長發(fā)育、維持微生態(tài)環(huán)境平衡等重要作用[6]。

    披針葉黃華(Thermopsis lanceolata)為豆科黃華屬多年生草本植物,廣泛分布于我國東北、華北及西北等省區(qū)的半干旱和干旱地區(qū),該植物根系發(fā)達(dá)、耐寒抗旱、抗風(fēng)沙、繁殖力強(qiáng),具有重要的生態(tài)利用價值。此外,披針葉黃華也是一種藥用植物資源,該植物富含黃華堿、臭豆堿、野決明堿、金雀花堿等多種喹喏里西啶類生物堿,具有抗癌、抗心率失調(diào)、抑菌消炎等多種生物活性作用,民間用于多種疾病的治療[7]。目前尚未見到關(guān)于披針葉黃華內(nèi)生真菌的相關(guān)報(bào)道。在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室對采自寧夏的披針葉黃華內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行了研究,從中分離到2株具有蠕形分生孢子真菌形態(tài)特征的內(nèi)生真菌。真菌學(xué)界將分生孢子形似蠕蟲的半知菌稱為蠕形分生孢子真菌(Helminthosoiroid fungi),屬半知菌絲飽綱(Hyphomyeetes)暗色菌科,主要包括平臍蠕孢屬(離蠕孢屬)、彎孢屬、內(nèi)臍孢屬、凸臍蠕孢屬、長蠕孢屬和卵蠕孢屬6個屬。該類真菌寄主范圍寬、分布廣泛,是一類具有重要經(jīng)濟(jì)意義的真菌類群[8]。本研究擬對分離自披針葉黃華植物組織中的2株蠕形分生孢子真菌進(jìn)行形態(tài)和遺傳發(fā)育分析,根據(jù)真菌的形態(tài)特征及內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(Internal transcribed space,ITS)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)序列等信息,對其進(jìn)行了種屬分類,為進(jìn)一步研究披針葉黃華內(nèi)生真菌的多樣性、次生代謝產(chǎn)物及與宿主植物的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 2013年8月于寧夏銀川市采集無病害披針葉黃華的根和種子,分離出SP01和RM02菌株,保存于北方民族大學(xué)國家民委發(fā)酵和釀造工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

    1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,去離子水1 000 mL,pH 6.5。水瓊脂+麥稈培養(yǎng)基(TWA+W):瓊脂13 g,去離子水1 000 mL,pH 6.5,制成平板后,放入滅菌麥稈。

    1.1.3 儀器與試劑 C1000型PCR儀(美國Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);5418型高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(美國OMEGA公司);DNA聚合酶、DNA Marker(大連寶生物工程有限公司);引物(上海生工生物工程股份有限公司合成);其他有機(jī)試劑為國產(chǎn)分析純。

    1.2 真菌的形態(tài)觀察

    將SP01、RM02菌株接種于PDA、TWA+W培養(yǎng)基上培養(yǎng),挑取菌絲至載玻片上,經(jīng)乳酸酚棉蘭染液染色后在顯微鏡下觀察。用目鏡測微尺測量分生孢子的大小和菌絲的直徑,根據(jù)真菌的菌絲、分生孢子、分生孢子梗的形態(tài)特點(diǎn)及產(chǎn)孢方式等對其進(jìn)行初步的種屬分類。

    1.3 真菌ITS、GAPDH序列的擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

    分別取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的真菌菌絲約200 mg,置于冰中放置的1.5 mL離心管中,用帶有玻璃研磨鉆頭的電鉆間歇研磨菌絲約20 s,然后用DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA。應(yīng)用White等[9]報(bào)道的引物ITS1和ITS4擴(kuò)增ITS序列,應(yīng)用Berbee等[10]報(bào)道的引物gpd1和gpd2擴(kuò)增GAPDH序列。PCR反應(yīng)體系均為50 μL,其中DNA聚合酶2.5 U,PCR緩沖液5 μL,dNTP 4 μL,20 μM引物各2 μL,模板DNA 0.5 μL。具體反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);最后72 ℃ 10 min使其反應(yīng)充分。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,確定成功擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化回收,將純化的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司,分別以ITS1、ITS4引物和gpd1、gpd2引物進(jìn)行雙向測序,將正反測序結(jié)果拼接,獲得ITS和GAPDH序列信息。

    登錄http//:www.ncbi.nlm.nih.gov,將已獲得的各菌株ITS序列和GAPDH序列提交到GenBank,申請GenBank序列號。應(yīng)用BLAST在線比對程序分別將測定的ITS序列和GAPDH序列與數(shù)據(jù)庫中已提交的真菌序列進(jìn)行同源性比較,獲得各菌株的種屬初步分類信息;選擇數(shù)據(jù)庫中相關(guān)屬或臨近屬權(quán)威菌株的ITS序列和GAPDH序列(表1),應(yīng)用MEGA 4.0軟件中的Clustal W程序?qū)Ω餍蛄羞M(jìn)行聯(lián)配(Aligment),然后根據(jù)聯(lián)配結(jié)果采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展數(shù)據(jù)集為1 000。

    1.4 真菌的種屬分類

    根據(jù)各菌株菌絲、分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特點(diǎn),產(chǎn)孢方式、生長特性,并結(jié)合ITS、GAPDH序列同源性比較和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果,對該類真菌進(jìn)行種屬分類。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SP01和RM02菌株的形態(tài)特征

    SP01菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈灰黑色,在TWA+W培養(yǎng)基上呈灰褐色。菌絲無色,分生孢子梗呈深褐色,上部屈膝狀彎曲,未見分支。分生孢子呈淺褐色或深褐色,單生于分生孢子梗頂端或側(cè)部,呈圓柱狀,略彎曲,兩端鈍圓,孢子大小約為(60~90) μm×(13~16) μm,一端具臍點(diǎn),突出于孢子表面。孢子具有6~9個假膈膜,兩端膈膜較厚,顏色較深(圖1a)。

    RM02菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落呈灰綠色,在TWA+W培養(yǎng)基上呈灰褐色。菌絲無色,在以上2種培養(yǎng)基上,該菌株均只能產(chǎn)生少量的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗呈淡褐色,上部屈膝狀彎曲,偶見分支。分生孢子呈淺褐色,單生或簇生,呈橢圓形,孢子平直,兩端鈍圓,孢子大小約為(10~24) μm×(7~10) μm,一端具臍點(diǎn),與孢子壁表面平齊。孢子具有3個假膈膜(圖1b)。

    2.2 SP01、RM02菌株ITS、GAPDH的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

    SP01、RM02菌株的ITS、GAPDH片段的核苷酸序列測定結(jié)果顯示,SP01、RM02的ITS片段長度分別為601 bp、570 bp,GAPDH片段長度分別為524 bp、530 bp,其ITS序列的GenBank登錄號分別為KP245767、KP245754,GAPDH序列的GenBank登錄號分別為KP311327、KP311328。

    BLAST比對結(jié)果顯示,SP01菌株的ITS、GAPDH序列與凸臍孢屬(Exserohilum)的E. rostratum及其有性型Setosphaeria rostrata的序列一致性最高,均達(dá)99%。RM02菌株的ITS序列與彎孢屬(Curvularia)的C. spicifera、C. australiensis、C. hawaiiensis等菌株的序列一致性最高,為98%~100%。

    基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)表明,SP01菌株與Exserohilum屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中同處于一個分支,自檢支持率高達(dá)99%,其中與E.rostratum ITF0706-2及E.rostratum的有性型S.rostrata IP 1129.80、S.rostrata Ex007、S.rostrata ATCC 32197等菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。RM02菌株與Curvularia屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中同處于一個分支,其中與C.spicifera的DAOM 575355、YW1、BC21ss2、CBS 274.52等菌株及C.spicifera的同物異名菌株C.tetramera CBS 371.72處于同一個分支,說明RM02菌株與C.spicifera的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。

    基于GAPDH序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)表明,SP01菌株與Exserohilum屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中同處于一個分支,自檢支持率也較高,其中與E.rostratum ITF0706-2及E.rostratum的有性型S.rostrata ATCC 32197、S.rostrata ACCC 37579等菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。RM02菌株與Curvularia屬的各菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中同處于一個分支,其中與C.spicifera的DAOM 575355、BC21ss2、CBS 274.52等菌株處于同一個分支,說明RM02菌株與C.spicifera的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。

    3 小結(jié)與討論

    在本研究中,SP01菌株的分生孢子呈長圓柱形,具有多個假膈膜,孢子兩端膈膜較厚且顏色較深,孢子一端具臍點(diǎn),臍點(diǎn)明顯突出于孢子外壁表面,孢子頂生或側(cè)生,這些形態(tài)特點(diǎn)與Exserohilum中的E.rostratum較為相似[8]。此外,基于ITS、GAPDH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明,SP01與Exserohilum各種同屬于一個類群,且與E.rostratum的遺傳進(jìn)化關(guān)系最為密切。因此,本研究將SP01鑒定為E.rostratum(嘴突凸臍蠕孢)。

    RM02菌株的分生孢子呈橢圓形,具3個假膈膜,孢子平直,兩端鈍圓,孢子一端具臍點(diǎn),臍點(diǎn)與孢子壁表面平齊,該菌具有平臍孢屬(Bipolaris)和彎孢屬(Curvularia)真菌的典型特征,其中與平臍孢屬真菌B.spicifera、B.australiensis最為相似[8]?;贗TS、GAPDH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明,RM02菌株與彎孢屬(Curvularia)菌株處于同一類群,與C.spicifera、C.australiensis、C.hawaiiensis遺傳進(jìn)化關(guān)系較近,其中與C.spicifera遺傳進(jìn)化關(guān)系最近。而C.spicifera、C.australiensis、C.hawaiiensis分別是B.spicifera、B.australiensis、B.hawaiiensis的同物異名,故本研究將RM02鑒定為C.spicifera≡Bipolaris spicifera(長穗離蠕孢)[11,12]。

    在蠕形分生孢子真菌中,突出的臍點(diǎn)是凸臍孢屬區(qū)別于平臍孢屬、內(nèi)臍孢屬等其他蠕形菌的最典型特征。但在實(shí)際觀察中,真菌的形態(tài)變異較大,受培養(yǎng)條件的影響較大,僅據(jù)此來區(qū)分它們?nèi)菀自斐苫煜濇邔俸推侥氭邔俚南嗨瞥潭群芨?,而且具有相同的有性?旋孢腔菌屬(Cochliobolus)。有學(xué)者認(rèn)為分生孢子是否彎曲或分生孢子的膈膜類型可作為區(qū)分彎孢屬和平臍孢屬的重要依據(jù)[11]。但本研究表明,平臍孢屬中的某些種的孢子也會出現(xiàn)彎曲,而彎孢屬中的某些種的孢子是直的。Alcorn認(rèn)為Bipolaris的分生孢子的膈膜為假膈膜,而Curvularia的膈膜為真膈膜,Bipolaris、Curvularia應(yīng)為兩個獨(dú)立的屬[12]。但Sivanesan認(rèn)為,Curvularia中的未成熟或成熟的孢子中其膈膜并未與外壁相連,也是假膈膜[13]。因此,僅根據(jù)真菌的形態(tài)很難將2個屬中的各個種嚴(yán)格區(qū)分開來[8]。

    近年來,在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析技術(shù)為真菌的種屬分類提供了必要的技術(shù)手段,如ITS、GAPDH、LSU、EF-1α、Brn1等序列已廣泛用于蠕形分生孢子真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究[8]。Li等[11]、Manamgoda等[12]對Bipolaris、Curvularia真菌的ITS、GAPDH序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果表明,Bipolaris和Curvularia的各個種均被分別劃分到Cochliobolus的2個類群中。Manamgoda等[13]、Tan等[14]根據(jù)ITS、GAPDH、EF-1α等序列的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果,對Bipolaris、Curvularia中的各種進(jìn)行了重新劃分,其中將B. spicifera、B.australiensis、B. hawaiiensis等明確劃分到Curvularia中。在本研究中,基于ITS、GAPDH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均將B.spicifera、B.australiensis、B.hawaiiensis劃分到Curvularia類群中,與Bipolaris類群明顯處于不同的進(jìn)化樹分支,這與Brebee等[10]、Manamgoda等[13]的報(bào)道相一致。據(jù)Shimizu等[15]、Sun等[16]、孫廣宇等[17]報(bào)道,Brn1序列適用于對Exserohilum、Bipolaris、Curvularia中不同菌株的遺傳變異分析,而且能夠區(qū)分E.rostratum中的種間變異。本研究的結(jié)果表明,ITS、GAPDH序列也適用于對Exserohilum各種的區(qū)分。

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