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    4株石杉堿甲生產(chǎn)菌原生質(zhì)體制備與再生條件的研究

    2016-01-27 14:45張方方劉海元張曉瓊等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年11期

    張方方 劉海元 張曉瓊等

    摘要:為高效獲得內(nèi)生真菌U29、U32、U50、U51石杉堿甲生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體和為原生質(zhì)體融合及基因組改組選育高產(chǎn)石杉堿甲菌株提供參考,研究了溶解酶的濃度、加酶量、酶解溫度、穩(wěn)定劑等因子對4株菌原生質(zhì)體制備的影響。通過研究獲得了菌株原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件:溶壁酶濃度為3.0%、加酶量為2.0 mL/100 mg、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃、0.6 mol/mL氯化鈉為穩(wěn)定劑、CYM培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基。在此優(yōu)化條件下,4株菌的原生質(zhì)體的產(chǎn)量均大于7.0×107 個/mL,再生率可達(dá)20%以上。

    關(guān)鍵詞:內(nèi)生真菌;溶解酶;原生質(zhì)體制備;原生質(zhì)體再生

    中圖分類號: S336文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2015)11-0085-05

    收稿日期:2015-05-14

    基金項(xiàng)目:福建省社會發(fā)展引導(dǎo)性項(xiàng)目(編號:2015Y01010244);福建省財(cái)政廳專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)[編號:閩財(cái)指(2011)1238];福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(編號:201310393057)。

    作者簡介:張方方(1990—),女,碩士研究生,主要從事中藥生物工程研究。E-mail:1170563131@qq.com。

    通信作者:吳水生,從事中藥生物工程研究。E-mial:wushuishengwss@163.com。石杉堿甲 (huperzine A,HupA) 是20世紀(jì)80年代,我國學(xué)者從藥用植物蛇足石杉[Huperziaserrata (Thunb.) Trev.]中分離到的一種石松類倍半萜生物堿,具有高效、低毒、可逆性的乙酰膽堿酯酶抑制作用,目前已成為治療阿爾茨海默病最有效的藥物之一[1-3]。

    內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的化學(xué)成分[4]。自從1996年Strobel等[5]從短葉紅豆杉中分離到1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌,利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)化合物被人們廣泛接受[6]。筆者從閩澤馬尾杉中分離到1株產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌炭團(tuán)菌NX9,但產(chǎn)量僅為1.12 μg/L,經(jīng)紫外誘變得到4株產(chǎn)量較高的石杉堿甲生產(chǎn)菌U29、U32、U50、U51,產(chǎn)量分別為17.10、17.46、19.89、16.85 μg/L,但該產(chǎn)量仍較低無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。通過菌種選育獲得產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定性好的菌種是實(shí)現(xiàn)利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲的首要前提。

    原生質(zhì)體育種能夠快速、有效地提高菌株中代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,包括原生質(zhì)體再生育種、原生質(zhì)體誘變育種、原生質(zhì)體融合育種等方法[7]。Jin等以10株產(chǎn)量較高的多殺菌素產(chǎn)生菌(Saccharopolyspora spinosa)為出發(fā)菌株,進(jìn)行原生質(zhì)體融合后獲得的融合菌株S. spinosa 4~7,其多殺菌素產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了200.55%以上[8]。2002年出現(xiàn)的基因組改組技術(shù)則是在原生質(zhì)體融合的基礎(chǔ)上通過對正向突變株庫進(jìn)行多親本的原生質(zhì)體遞推式融合而實(shí)現(xiàn)高效的定向育種,極大地加快了獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的菌株的速度[9]。制備大量有活性的原生質(zhì)體是原生質(zhì)體融合及基因組改組育種的前提[7]。有效的原生質(zhì)體制備和再生方法是保證原主質(zhì)體產(chǎn)量和活性的主要途徑,原生質(zhì)體的制備和再生主要受酶的種類與濃度、酶解時間與溫度、菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑、培養(yǎng)基成分等因素[10-11]的影響,且由于菌株間存在的差異性,導(dǎo)致原生質(zhì)體制備和再生的方法存在差異[12]。優(yōu)化原生質(zhì)體制備及再生的最優(yōu)條件是原生質(zhì)體育種的重要方法。為此,本試驗(yàn)研究了溶解酶的濃度、加酶量、酶解溫度、穩(wěn)定劑、再生條件等對內(nèi)生真菌U29、U32、U50、U51石杉堿甲生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體制備效率的影響,旨在篩選出適合產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌的原生質(zhì)體制備與再生的最優(yōu)條件,為原生質(zhì)體育種及基因組改組育種奠定基礎(chǔ),最終為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)石杉堿甲且早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ),從根本上解決石杉堿甲藥源不足的問題。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1菌種石杉堿甲產(chǎn)生菌U29、U32、U50、U51:由石杉堿甲產(chǎn)生菌NX9誘變所得,實(shí)驗(yàn)室保藏。

    1.1.2培養(yǎng)基的配制(1) PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L;葡萄糖20 g/L。(2) PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L;葡萄糖20 g/L;瓊脂15~20 g/L。(3)查氏培養(yǎng)基:蔗糖30 g/L;硝酸鈉3 g/L;磷酸二氫鉀1 g/L;氯化鉀0.5 g/L;硫酸鎂0.5 g/L;硫酸亞鐵0.001 g/L;瓊脂16 g/L。(4)CYM培養(yǎng)基:蛋白胨2 g/L;葡萄糖20 g/L;酵母膏2 g/L;硫酸鎂5 g/L;磷酸二氫鉀0.46 g/L;磷酸氫二鉀1 g/L;瓊脂16 g/L。(5) MYG培養(yǎng)基:麥芽糖5 g/L;酵母膏5 g/L;葡萄糖10 g/L。(6)酵母膏培養(yǎng)基:酵母膏5 g/L;蔗糖10 g/L。(7)再生固體培養(yǎng)基:以0.6 mol/L NaCl配制的PDA培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、CYM培養(yǎng)基和酵母膏培養(yǎng)基。(8)再生半固體培養(yǎng)基:再生培養(yǎng)基中瓊脂減半。所有培養(yǎng)基均以121 ℃,滅菌20 min。

    1.1.3試劑溶壁酶(美國sigma公司);氯化鈉、蔗糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硝酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);酵母膏 (廣東江門生物技術(shù)開發(fā)中心有限公司);蛋白胨 (廣西環(huán)凱微生物科技有限公司)。

    滲透壓穩(wěn)定劑:采用0.6 mol/L的NaCl溶液。HupA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%,長沙中仁生物技術(shù)有限公司,批號:2012120301)。

    1.1.4儀器與設(shè)備MJP-250型霉菌培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),BSC-1360ⅡA2超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司),超高效液相質(zhì)譜儀(Waters,Milford,MA,USA),ACQUITY UPLC BEH C18反相柱(Waters,100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。

    1.2方法

    1.2.1菌絲體培養(yǎng)將菌株U29、U32、U50、U51孢子液以10%(體積比)的接種量接種于含80 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中,于28 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)5 d,6層高級擦鏡紙過濾,0.6 mol/L NaCl溶液淋洗3次,將菌絲體轉(zhuǎn)移到直徑為6 cm培養(yǎng)皿中,稱質(zhì)量待用。

    1.2.2原生質(zhì)體的制備、純化與再生每100 mg菌絲體加 2 mL 酶解液,于適宜溫度的恒溫?fù)u床中振蕩酶解。每30 min吸取一定量的酶解液觀察,計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)。酶解完畢后,酶解液用無菌棉花過濾,于3 700 r/min離心10 min,倒掉上清液,用滲透壓穩(wěn)定劑離心洗滌2次,收集原生質(zhì)體重懸于滲透壓穩(wěn)定劑中,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋原生質(zhì)體,使之達(dá)到一定濃度,然后吸取0.3 mL加入含有4.7 mL再生半固體培養(yǎng)基的具塞試管中,搖勻后倒入再生固體培養(yǎng)基平板內(nèi),于28 ℃下培養(yǎng)7 d;同時,再吸取0.3 mL原生質(zhì)體懸液加入已含有4.7 mL低滲半固體培養(yǎng)基的具塞試管中,搖勻后倒入PDA固體培養(yǎng)基平板,作為對照。觀察菌落生長情況,用以下公式計(jì)算再生率:再生率=(再生固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)-低滲固體培養(yǎng)基上菌落數(shù))/原生質(zhì)體數(shù)×100%。分別考察不同的溶解酶濃度、加酶量、菌齡、酶解時間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑及濃度、再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體制備與再生的影響。每個影響因素均平行考察3份,結(jié)果取平均值,獲得石杉堿甲生產(chǎn)菌原生質(zhì)體形成和再生的最佳條件。

    2結(jié)果與分析

    2.1酶濃度的選擇

    分別采用2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的溶壁酶酶解菌株U29、U32、U50、U51的菌絲體,在其他條件一致的情況下通過計(jì)算其原生質(zhì)體的產(chǎn)量與再生率,考察原生質(zhì)體制備與再生的最適酶濃度。發(fā)現(xiàn)溶壁酶濃度由2.0%至3.0%時石杉堿甲生產(chǎn)菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均增大,雖然溶解酶濃度為35%時4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量均較大,但是原生質(zhì)體的再生率卻比3.0%時低,因此確定溶解酶的濃度為3.0%(表1)。

    2.2加酶量的選擇

    分別將100 mg新鮮菌絲體加入1.0、2.0、3.0、3.5、4.0 mL 的酶液,溶解酶濃度為3.0%,研究加酶量對4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響。加入的酶液過多或過少都難以得到最大量的原生質(zhì)體,當(dāng)加酶量為2.0 mL/100 mg時,4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均達(dá)到最大(表2),因此確定最適宜的加酶量為2.0 mL/100 mg。

    2.3菌齡的選擇

    將3.0%溶壁酶分別加入靜止培養(yǎng)3、4、5、6、7 d的U29、U32、U50、U51菌絲體,加酶量2.0 mL/100 mg,考察菌齡對原表2加酶量對菌U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率的影響。發(fā)現(xiàn)隨著菌齡的增加,4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均增大,但培養(yǎng)時間過長原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均下降。當(dāng)培養(yǎng)時間為5 d時,原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率均最大(表3),因此確定最佳菌齡為5 d。

    2.4酶解時間的研究

    在確定的最佳酶濃度、加酶量及菌齡條件下,分別研究了酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h后的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生情況。發(fā)現(xiàn)酶解時間過短會導(dǎo)致細(xì)胞壁水解不充分,原生質(zhì)體不能充分釋放,產(chǎn)量較低,但原生質(zhì)體活性較高,再生率較高;而酶解時間過長導(dǎo)致了原生質(zhì)體皺縮,損害細(xì)胞質(zhì)膜導(dǎo)致再生率急劇下降[13]。其中酶解2.5 h時4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均達(dá)最大(表4)。因此,確定2.5 h為最佳酶解時間。

    2.5酶解溫度的選擇

    在上述最佳條件下,分別將U29、U32、U50、U51菌絲體置于26、28、30、32、34 ℃的恒溫?fù)u床中,在70 r/min條件下酶解2.5 h后對原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶解溫度為28~30 ℃時,原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率隨溫度升高而增大,溫度高于30 ℃后,4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率均明顯下降(表5)。

    2.6滲透壓緩沖劑的選擇

    在上述最佳條件下,分別研究了氯化鉀、氯化鈉、蔗糖、甘露醇、硫酸鎂、氯化鈣等滲透壓緩沖劑對菌U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶濃度為30%、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃時,以氯化鈉作為滲透壓穩(wěn)定劑制備4株菌的原生質(zhì)體時,原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均最大,故選用氯化鈉為最佳的滲透壓穩(wěn)定劑(表6)。此外,研究了不同濃度氯化鈉對菌U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響,發(fā)現(xiàn)氯化鈉濃度在0.4~0.6 mol/L時,4株菌的原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率隨濃度的增大而增大,當(dāng)濃度大于0.6 mol/L時,產(chǎn)量及再生率均下降(表7)。

    2.7再生培養(yǎng)基的選擇

    采用上面研究所得最優(yōu)條件制備4株菌的原生質(zhì)體,然后分別將其接種到PDA、CYM、MYG、沙氏、酵母膏等再生培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基其再生率明顯不同,以CYM再生培養(yǎng)基培養(yǎng)U29、U32、U50、U51原生質(zhì)體時,再生率最高(圖1)。因此,確定最佳的再生培養(yǎng)基為CYM培養(yǎng)基。

    2.8原生質(zhì)體的觀察

    4株菌菌絲體經(jīng)溶壁酶在30 ℃作用下,恒溫振蕩處理約30 min后開始釋放出原生質(zhì)體,原生質(zhì)體形狀基本一致,多呈球形、透亮,同時可觀察到大量菌絲片段(圖2)。

    3討論

    3.1酶濃度及加酶量對原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響

    真菌細(xì)胞壁組分復(fù)雜,不同培養(yǎng)條件和不同菌齡細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分差異很大,而且酶解真菌細(xì)胞壁的過程還涉及到多個影響因素,本研究通過研究溶壁酶濃度、加酶量、菌齡、培養(yǎng)時間等因子對4株石杉堿甲生產(chǎn)菌原生質(zhì)體制備的影響,獲得了制備4株菌原生質(zhì)體的最優(yōu)條件。

    真菌細(xì)胞壁的主要成分包括幾丁質(zhì)、糖原、蛋白質(zhì)、半纖維素等。在形成原生質(zhì)體的過程中,細(xì)胞壁被溶解酶酶解出孔洞,原生質(zhì)體從這些孔洞中溢到周圍的穩(wěn)滲劑中。因此,細(xì)胞壁溶解酶在真菌制備原生質(zhì)體的反應(yīng)系統(tǒng)中起直接作用[14]。吳正鋼等研究發(fā)現(xiàn)采用單一酶制備原生質(zhì)體,消除細(xì)胞壁不完全只能形成少量的原生質(zhì)體[15],但本研究通過考察單一溶壁酶不同濃度對4株菌原生質(zhì)體形成與再生的影響,研究發(fā)現(xiàn)溶壁酶的濃度應(yīng)適當(dāng),過低或過高的酶濃度都不利于原生質(zhì)體的形成與再生。低濃度的溶壁酶酶解作用不徹底,不利于原生質(zhì)體的生成,過高濃度降低了原生質(zhì)體的數(shù)量和活性,致使形成量與再生率都有明顯下降。當(dāng)酶濃度為30%時,原生質(zhì)體的產(chǎn)量均大于6.0×107個/mL,再生率均大于16%,比采用復(fù)合酶系制備原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率高[14-15],不僅簡化了試驗(yàn)步驟而且節(jié)約成本。

    加酶量對提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率的影響也較大,過大或過小都難以得到最大量的原生質(zhì)體。加酶量過少酶解不徹底,菌絲中的原生質(zhì)體無法得到充分的釋放,且影響原生質(zhì)體的活性,降低再生率。

    3.2菌齡對原生質(zhì)體制備及再生率的影響

    真菌生理狀態(tài)是決定原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的主要因素之一,不同的生長時期,真菌生理狀態(tài)不同,細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體活力及代謝水平也不相同。因此,菌齡是明顯影響原生質(zhì)體釋放頻率的主要因素。絲狀真菌以年輕的菌絲用來分離原生質(zhì)體最佳,尤其是生長對數(shù)期的菌體。本研究通過繪制4株菌的生長曲線,發(fā)現(xiàn)4株菌的對數(shù)生長期均為3~7 d,幼齡菌絲和老齡菌絲均不利于酶解。菌齡過長,細(xì)胞壁發(fā)生老化增厚,不易釋放原生質(zhì)體,菌齡過短則菌絲體易破裂[16]。研究還發(fā)現(xiàn)3~5 d的菌體隨著培養(yǎng)時間的增加,原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均提高,當(dāng)菌齡為5 d時,原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率均達(dá)最大值,隨后逐漸降低。

    3.3酶解溫度對原生質(zhì)體制備及再生率的影響

    不同的酶具有不同的最適溫度,酶解溫度直接影響酶的活性。只有在最適的酶解溫度下,酶的活性才最高,酶促反應(yīng)速率才最大。此外,酶解溫度還影響真菌的生理狀態(tài)、菌絲體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性疏散及原生質(zhì)體的活力。通常,真菌的最適酶解溫度為25~35 ℃,當(dāng)溫度在30 ℃時,4株菌原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率均達(dá)最大值,表明30 ℃為溶壁酶作用4株菌細(xì)胞壁的最適溫度。

    3.4不同滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體制備及再生的影響

    滲透壓穩(wěn)定劑既能維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓的平衡,維持原生質(zhì)體的形態(tài),防止破裂或皺縮,影響原生質(zhì)體活力,對酶的活性也有一定的促進(jìn)作用,是影響原生質(zhì)體制備與再生的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)6種常用穩(wěn)定劑中,以0.6 mol/L氯化鈉為滲透壓穩(wěn)定劑時,4株菌的原生質(zhì)體制備效果最好,可能由于氯化鈉等有助于酶與底物結(jié)合,對酶反應(yīng)起促進(jìn)作用[17]。

    3.5不同再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生的影響

    再生培養(yǎng)基的選擇直接影響原生質(zhì)體的再生率。本研究比較了PDA、CYM、MYG、酵母等5種再生培養(yǎng)基對4株菌原生質(zhì)體再生率的影響,發(fā)現(xiàn)CYM再生培養(yǎng)基效果最好??赡苡捎诮湍父?、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)可能是細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì),或經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化成細(xì)胞壁的前體物質(zhì),或促進(jìn)細(xì)胞代謝,參與細(xì)胞壁的加速合成。CYM培養(yǎng)基中同時含有酵母膏、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類,豐富的營養(yǎng)物質(zhì)更有利于細(xì)胞壁再生。

    4結(jié)論

    本試驗(yàn)研究了4株石杉堿甲生產(chǎn)菌原生質(zhì)體制備及再生的條件,獲得了原生質(zhì)體制備及再生的最優(yōu)體系:溶壁酶濃度為3.0%、加酶量為2.0 mL/100 mg、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃、0.6 mol/L氯化鈉為穩(wěn)定劑、CYM培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基。在此體系下,4株菌原生質(zhì)體的產(chǎn)量均大于7.0×107個/mL,再生率均超過20%。本研究為原生質(zhì)體融合及基因組改組選育高產(chǎn)石杉堿甲菌株奠定了重要基礎(chǔ)。

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