2 例Aw43 亞型的血清學(xué)和分子生物學(xué)鑒定分析

朱于莉 韓斌 馮智慧

(青島市中心血站輸血研究所，山東 青島 266071 )

ABO 血型系統(tǒng)通常可分為A、B、O、AB 這4 種表型，而ABO 亞型是指在這4 種血型之下進(jìn)一步細(xì)分的ABO 血型，這些亞型必須具有遺傳基礎(chǔ)，并且有明確的血清學(xué)特點(diǎn)[1]。其中最突出的血清學(xué)特點(diǎn)就是正反定型不符:紅細(xì)胞上A或(和)B 抗原表達(dá)減弱，多數(shù)伴有血清中含弱抗原的抗體，從而導(dǎo)致血型鑒定困難甚至誤判。 因此準(zhǔn)確的鑒定出ABO亞型，對(duì)于臨床患者輸血十分重要。 基因分型技術(shù)的快速發(fā)展，為亞型的鑒定提供了強(qiáng)有力的支持依據(jù)，也不斷擴(kuò)大著亞型的等位基因庫(kù)[2]。 我們發(fā)現(xiàn)了2 例疑難血型，通過(guò)分子檢測(cè)確定為2 例罕見(jiàn)的Aw43 亞型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

標(biāo)本1 為男性，12 歲，泌尿外科患者；標(biāo)本2 為女性，38歲，婦科患者，均在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ABO 正反定型不符，隨后送至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2 試劑和儀器

抗-A(批號(hào)20220102)、 抗-B(批號(hào)20220102)及ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(批號(hào)20235301)和抗-H 試劑(批號(hào)20210917)(上海市血液生物)，抗-A1(批號(hào)8000452124)(荷蘭Sanquin)、抗-AB(批號(hào)842000)(法國(guó)DIAGAST)，基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Invirtrogen)，Ex-Taq 試劑盒(TaKaRa，批號(hào)KA5801CA)，克隆測(cè)序使用的LA-Taq 試劑盒(TaKaRa批號(hào)KA4601YA)及高效克隆PCR 產(chǎn)物專用載體(pMD18-T vector)(TaKaRa，批號(hào)K6801AB)；血清學(xué)離心機(jī)(KA-2200，日本KUBOTA 公司)、Bio-Rad C1000 PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad)、3100 型測(cè)序儀(美國(guó)AB)。

1.3 血清學(xué)試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)試管法[3]進(jìn)行ABO 血型正反定型試驗(yàn)。

1.4 基因檢測(cè)

1.4.1 DNA 提取

采集2 例研究標(biāo)本外周血1 mL(EDTA 抗凝血)，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取血液標(biāo)本全基因。

1.4.2 DNA 序列直接分析

對(duì)ABO基因啟動(dòng)子、 第1 ～7 外顯子和側(cè)翼序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并分析序列，引物序列及PCR 反應(yīng)條件參見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)室之前發(fā)表的文章[4]。 測(cè)序結(jié)果采用GEBtle 軟件進(jìn)行序列分析。

1.4.3 克隆測(cè)序分析

擴(kuò)增ABO基因的外顯子1、3、4、5、6、7，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆入T 載體，并挑取多個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行培養(yǎng)增殖，提取質(zhì)粒DNA 用于檢測(cè)標(biāo)本的單體型。

1.5 蛋白結(jié)構(gòu)分析

采用SIB Expasy 對(duì)DNA 序列進(jìn)行氨基酸翻譯并預(yù)測(cè)蛋白讀碼框，采用DeepTMHMM 進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)和分析。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2 例標(biāo)本ABO 血型血清學(xué)結(jié)果十分相似，均表現(xiàn)為正定A 抗原減弱，同時(shí)反定存在抗-A，與抗-H 的反應(yīng)增強(qiáng)，見(jiàn)表1。

表1 2 例標(biāo)本的ABO 血型血清學(xué)結(jié)果Table 1 ABO serologic grouping results of 2 cases

2.2 ABO 基因序列分析

將2 個(gè)血液標(biāo)本提取DNA，進(jìn)行ABO基因增強(qiáng)子序列、1-7 外顯子及側(cè)翼序列的直接測(cè)序分析，并將結(jié)果與A101序列進(jìn)行比對(duì)。 標(biāo)本1 的增強(qiáng)子為A＋G 型，存在1A/G、297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1096G/A 雜合；標(biāo)本2 的增強(qiáng)子也是A＋G 型，存在 1A/G、 106G/T、 188G/A、 189C/T、 220C/T、 261delG、297A/G、467C/T、646T/A、 681G/A、771C/T、829G/A 雜合。進(jìn)一步對(duì)2 個(gè)標(biāo)本進(jìn)行克隆測(cè)序，每個(gè)標(biāo)本均可檢測(cè)到2 種基因型，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。 通過(guò)GeneBank 序列比對(duì)確認(rèn)，標(biāo)本1 基因型為Aw43/B101，標(biāo)本2 基因型為Aw43/O02。

表2 2 例標(biāo)本的ABO 基因克隆測(cè)序結(jié)果Table 2 ABO gene analysis results of 2 cases

2.3 ABO 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

Aw43 等位基因第1 位堿基發(fā)生A＞G 突變，破壞了起始密碼子ATG，導(dǎo)致翻譯起始位點(diǎn)后移。 對(duì)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)進(jìn)行分析顯示后續(xù)可能存在13 個(gè)翻譯起始位點(diǎn)(Met，M)，分別位于跨膜區(qū)、莖區(qū)和催化區(qū)(表3)。

表3 潛在的翻譯起始位點(diǎn)及定位Table 3 Potential translation initiator of the ABO gene

若以改變最小的第20 位Met 作為翻譯起始位點(diǎn)，則形成的蛋白由原來(lái)的354 個(gè)氨基酸縮短為335 個(gè)。 采用DeepTMHMM 進(jìn)一步對(duì)跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果顯示，缺失20 位氨基酸嚴(yán)重影響了跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)，形成跨膜區(qū)的概率從100%降低至＜10%，且蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也從alpha 跨膜區(qū)(alpha transmembrane，TM)轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐蔚男盘?hào)肽(signal peptide，SP)(圖1)。

圖1 DeepTMHMM 分析編碼蛋白跨膜區(qū)Figure 1 Transmembrane regions of encoding protein:DeepTMHMM analysis

3 討論

我們發(fā)現(xiàn)的2 例標(biāo)本的血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果類似AX亞型，即正定與抗-A 反應(yīng)減弱，抗-A1陰性，同時(shí)血清中存在抗-A。對(duì)這2 例標(biāo)本進(jìn)行DNA 序列分析，發(fā)現(xiàn)2 例的ABO基因中都存在1A＞G， 467C＞T 突變，經(jīng)與National Center for Biotechnology Information(NCBI)網(wǎng)站的The Blood Group Antigen Gene Mutation Database 比對(duì)確認(rèn)為Aw43 等位基因型(GeneBank:KU128404)。 同時(shí)我們也注意到，在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中Aw43 的命名存在矛盾:根據(jù)International Society of Blood Transfusion(ISBT)網(wǎng)站提供的Names for ABO (ISBT 001) blood group alleles v1.1 171023，Aw43 的突變位點(diǎn)是c.467C＞T、 c.721C＞T，與NCBI 的不同。 在此我們選擇按照NCBI 的等位基因定義，本文所指Aw43 即1A＞G， 467C＞T，以避免混淆。

Aw43 亞型是2016 年由浙江省血液中心許先國(guó)課題組發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的[5]，經(jīng)序列提交GeneBank后命名為Aw43。Aw43 亞型相對(duì)較少，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前相關(guān)報(bào)道僅有2 篇文獻(xiàn)，且均為中國(guó)人報(bào)道，除了首次發(fā)現(xiàn)的上述報(bào)道外，江蘇省血液中心在2021 年報(bào)道了1 例[6]，這2 例的血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果與我們此次報(bào)道的相似，均為A 抗原減弱甚至無(wú)法檢測(cè)，反定有或未檢測(cè)到抗-A。 上述數(shù)據(jù)提示此Aw43 亞型的發(fā)生概率極低。

Aw43 亞型的分子特征是ABO基因存在1A＞G， 467C＞T 突變，其中1A＞G 破壞了起始密碼子ATG，導(dǎo)致翻譯起始位點(diǎn)后移；而467C＞T 則導(dǎo)致156 位氨基酸由CCG(脯氨酸，Pro)突變?yōu)镃TG(亮氨酸，Leu)。 單獨(dú)467C＞T(P156L)突變是等位基因A102(GeneBank:AF134413)的分子特征[7]。 雖然與A101 相比，A102 的基因序列發(fā)生了突變，也導(dǎo)致編碼氨基酸的序列改變，但此突變并未影響到所編碼的α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(α-1，3-N-Acetylgalactosaminyltransferase，GTA)的活性，紅細(xì)胞膜上A 抗原表達(dá)正常，與A101 類似[8]。 并且目前日本和我國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)，在亞洲黃種人中A102 比A101 更占數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)[9]。 因此我們認(rèn)為導(dǎo)致Aw43 亞型A 抗原減弱的原因應(yīng)該是1A＞G。

GTA 是Ⅱ型跨膜蛋白，這些跨膜蛋白定位于高爾基體內(nèi)，包含1 個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的16 個(gè)氨基酸的N 段結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)21 個(gè)氨基酸的單跨膜結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)擴(kuò)展的莖區(qū)，然后是1 個(gè)在高爾基體腔內(nèi)的C 端催化結(jié)構(gòu)域[10]。 高爾基體的主要功能是將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工、分揀與運(yùn)輸，然后分門(mén)別類地送到細(xì)胞特定的部位或分泌到細(xì)胞外。這其中最重要的1 項(xiàng)加工就是糖基化:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起始合成N-連接的糖鏈由順面進(jìn)入高爾基體后，在各膜囊之間的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)生了一系列有序的加工和修飾，被多種糖基轉(zhuǎn)移酶依次加上了不同類型的糖分子，形成了結(jié)構(gòu)各異的糖鏈，最終這些糖鏈分泌到細(xì)胞外或錨定在膜上，發(fā)揮各自的功能[11]。1A＞G 突變導(dǎo)致GTA 翻譯起始位點(diǎn)后移，很可能后移到穿膜區(qū)的M26 或柄狀莖區(qū)的M53 或M69，形成N 端截短的蛋白。 通過(guò)我們的預(yù)測(cè)分析，哪怕是后移到第1 次出現(xiàn)的M20，也會(huì)嚴(yán)重影響跨膜區(qū)的形成，導(dǎo)致所形成的GTA 蛋白缺失跨膜區(qū)，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

除Aw43 外，其他存在翻譯起始位點(diǎn)突變的亞型還有A309(1A＞G)[12]、Aw13(2T＞C)[13]和Aw16(1A＞G， 467C＞T， 1061delC)[14]。 這3 種亞型均表現(xiàn)為正定A 抗原減弱，有的會(huì)出現(xiàn)混合凝集。 研究人員針對(duì)此類突變?cè)O(shè)計(jì)了體外功能試驗(yàn)，比如發(fā)現(xiàn)Aw13 亞型的Seltsam 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了突變質(zhì)粒的Hela 細(xì)胞，結(jié)果與A101 相比，發(fā)現(xiàn)突變后表達(dá)A 抗原的細(xì)胞數(shù)降低了33%，A 抗原的表達(dá)量降低了41%[13]。 Yamamoto 等[10]在對(duì)不同轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)對(duì)A 抗原表達(dá)影響的體外研究試驗(yàn)中得出結(jié)論:GTA 的跨膜和莖干結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏 抗原的合成是必須的，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的尾部是可有可無(wú)的。 但GTA 的跨膜區(qū)除了維持蛋白穩(wěn)定性外，是如何影響酶活性的? 由跨膜結(jié)構(gòu)域或莖區(qū)的替代翻譯起始位點(diǎn)觸發(fā)的N 端截?cái)嗟腉TA 又是如何表達(dá)和修飾的? 這些問(wèn)題目前還沒(méi)有相關(guān)研究。 因此，Yamamoto 等[10]對(duì)此提出猜測(cè):GTA 對(duì)A 抗原合成的作用也許同β-1，4-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β4GalNAcT)和β-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β3GalT)的作用類似，在高爾基體中，這2 個(gè)酶的N 端結(jié)構(gòu)域(含胞內(nèi)、跨膜和少量氨基酸莖區(qū))參與相互作用，通過(guò)轉(zhuǎn)移步驟將中間體從產(chǎn)物位置引導(dǎo)到受體位置，從而提高了糖脂合成的效率[10，15]。 但這一切目前均處于理論假說(shuō)階段，N 端缺失對(duì)GTA 功能的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。