計劃免疫后出生獻(xiàn)血者乙肝無癥狀慢性感染血清學(xué)與分子生物學(xué)特征分析

葉賢林 李彤 王若楠 李然 劉衡 曾勁峰

（深圳市血液中心，廣東 深圳 518040）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是目前全球有待解決的公共衛(wèi)生問題之一。世界上約5%的人口感染慢性乙型肝炎，近25%的HBV 攜帶者發(fā)展為慢性乙型肝炎，可能導(dǎo)致肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌[1-2]。在我國，乙肝是3 大傳染病之一，每年約有30萬患者死于乙肝相關(guān)疾病[3]。此外，HBV感染是導(dǎo)致癌癥死亡的2 個常見危險因素之一[4]。乙肝疫苗接種是預(yù)防乙肝感染最有效方法之一，但由于疫苗3 針保護(hù)差異，疫苗接種無反應(yīng)，抗體滴度下降（保護(hù)時間一般在8～12 年），基因型差異及病毒免疫逃逸株出現(xiàn)，使仍有新感染不斷出現(xiàn)[5]。我國自1992 年開始對新生兒接種乙肝疫苗，2002年全部免費(fèi)接種。為了探討乙肝疫苗對獻(xiàn)血人群乙肝感染的影響，我們通過對深圳市獻(xiàn)血人群經(jīng)過HBsAg和核酸NAT篩查后的乙肝感染者，進(jìn)行兩對半、巢式PCR、基因測序等方法檢測，調(diào)查分析計劃免疫后出生獻(xiàn)血者的感染情況及基因突變情況，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2020年9月—2021年10月深圳市血液中心收集的1992 年1 月1 日后出生并經(jīng)HBsAg ELISA 和ALT 初篩合格的無償獻(xiàn)血者標(biāo)本46 632 份（男性31 612 份，女性15 020 份），其中HBsAg ELISA+共99份。

1.2 試劑與儀器

大容量病毒核酸提取試劑（羅氏公司,批號：39452000）。Premix Ex Taq 酶試劑盒（TAKARA 公司，批號:AJ52058A），DL2000 DNA Marker（TAKARA 公司,批號:A1301A）；瓊脂糖（BIOWEST 公司，批號：WXBB0828V）；基因測序外送華大基因科技公司檢測。Veriti Dx PCR 儀（ABI 公司），MX3005P實(shí)時熒光PCR 儀（Agilent 公司），5840 離心機(jī)（Eppendorf 公司），DK-8B 電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司），水平電泳儀（上海伯樂公司），UV-254暗箱紫外透射儀（北京鼎國公司）。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA提取

采用2.5 mL 核酸大容量提取方法提取標(biāo)本血漿的HBV DNA。操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.2 乙肝兩對半檢測

所有HBsAg ELISA+標(biāo)本送廣州金域（廣州）科技有限公司采用羅氏化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb。

1.3.3 BCP/PC和S目的基因片段的擴(kuò)增

以巢式PCR 擴(kuò)增BCP/PC 和S 片段（長度為263 bp和496 bp），進(jìn)行2輪擴(kuò)增，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，陽性標(biāo)本的第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物外送深圳華大基因公司測序。

1.3.4 標(biāo)本DNA定量檢測

使用實(shí)時熒光定量PCR 儀和配套試劑對標(biāo)本病毒載量進(jìn)行測定。洗脫液上樣量為5 μL，補(bǔ)蒸餾水至25 μL進(jìn)行測定。

1.3.5 陽性結(jié)果判定

以下3種情況滿足任意1種即為確證陽性：1）化學(xué)發(fā)光法:HBsAg 陽性；2）巢式PCR:S 片段或者BCP/PC 片段至少有1 個是陽性；3）實(shí)時定量PCR:陽性。

1.3.6 HBV S序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

選取A-I 基因型HBV 野毒株各3 份，用MEGA7.0 系統(tǒng)進(jìn)化軟件以鄰接法Kimura 2-parameter 模式，驗(yàn)證復(fù)數(shù)1 000，構(gòu)建HBV S 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用STATA 14.0 統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，分類變量資料采用χ2檢驗(yàn)，連續(xù)變量資料采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV感染獻(xiàn)血者HBV檢測總體情況

HBV感染獻(xiàn)血者HBV檢測總體結(jié)果見表1、表2，乙肝兩對半檢測結(jié)果見表3。

表1 HBV感染獻(xiàn)血者檢測總體結(jié)果（一）（n，%）Table 1 Overall results of blood donors infected with HBV（n，%）（Part1）

表2 HBV感染獻(xiàn)血者檢測總體結(jié)果（二）Table 2 Overall results of blood donors infected with HBV（Part2）

表3 61份確證陽性獻(xiàn)血者標(biāo)本血清學(xué)模式分布Table 3 Serological pattern distribution of 61 confirmed positive blood donor samples

2.2 HBV感染獻(xiàn)血者HBsAg滴度比較

不同性別HBV感染獻(xiàn)血者HBsAg滴度取對數(shù)進(jìn)行比較，P＞0.05，見圖1。

圖1 不同性別HBV感染獻(xiàn)血者HBsAg滴度比較Figure 1 Comparison of HBsAg titers in blood donors infected with HBV of different genders

2.3 HBV感染獻(xiàn)血者HBV基因分型

共50份標(biāo)本獲得S序列，其中B型46份[（92%,46/50），男性38份，女性8份]，C型4份[（8%,4/50），男性3 份，女性1 份]，不同性別間比較無差異（P＞0.05）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析見圖2。

圖2 HBV感染獻(xiàn)血者HBV S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 2 Phylogenetic tree analysis of HBV S gene in blood donors infected with HBV

2.4 HBV感染獻(xiàn)血者HBV S區(qū)突變分析

46 份B 型乙肝感染者病毒株S 區(qū)突變頻率高的是N40S（8/46，17.39%）、G44E（7/46，15.22%）、T126S/N/I/A（5/46,10.87%）、Q129H/R（6/46,13.04%）、Y161F/S（7/46，15.22%）、V179A（4/46，8.70%），其中免疫逃逸突變有T126S/N/I/A、Q129H/R。發(fā)現(xiàn)2 份G145R 免疫逃逸突變，男女各1 份。4 份C型乙肝感染者病毒株S 區(qū)突變頻率高的是S53L（2/4,50%）、C69T（2/4,50%）、I126S/T（2/4,50%），其中免疫逃逸突變有I126S/T。在主要親水區(qū)（MHR，aa99-aa169）經(jīng)檢測B型有63%（29/46）,C型有50%（2/4）發(fā)生突變。

3 討論

HBV 感染是危害人類生命安全的最嚴(yán)重問題之一。HBV 的感染特點(diǎn)為感染率高、感染人數(shù)眾多、病程長、且缺乏特效藥物及難以完全治愈[3]。目前預(yù)防HBV 感染最有效的措施就是注射疫苗。1992 年我國出臺了《全國乙肝免疫接種實(shí)施方案》，將乙肝疫苗納入計劃免疫管理。隨著乙肝疫苗在全國范圍內(nèi)的推行，我國的乙肝預(yù)防工作取得了初步成效。然而，HBV 在一些如宿主、免疫、病毒以及誘發(fā)因素的壓力下容易產(chǎn)生突變，這是因?yàn)镠BV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，其中S 基因發(fā)生的突變會影響HBV產(chǎn)生抗體免疫應(yīng)答，影響疾病進(jìn)展，這被稱之為免疫逃逸相關(guān)突變。已有研究表明，HBVS基因區(qū)的變異，特別是S基因的a 決定簇和MHR 上的氨基酸變異，將會減少S 蛋白的分泌，同時降低與抗-HBs 的親和力，從而導(dǎo)致HBsAg 檢測失敗以及HBV產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象[5]。目前，計劃免疫后出生的疫苗接種獻(xiàn)血者已逐漸占獻(xiàn)血主體地位，為提高輸血安全，有必要深入研究和監(jiān)測免疫壓力下病毒突變株流行概況，分析其生物學(xué)特征。

位于HBV 親水區(qū)（MHR，aa99-aa169）的逃逸突變在全世界范圍內(nèi)被廣泛報道，例如阿根廷14.8%[6]、摩洛哥15%[7]、波蘭15.4%[8]、伊朗14%～32.8%[9-11]、塞爾維亞22.6%[12]、法國27.8%[13]、韓國44.1%[14]等。MHR 突變能夠帶來一系列的診斷問題，還會導(dǎo)致隱匿性乙肝（OBI）、疫苗逃逸突變以及乙肝免疫球蛋白治療無效[15-19]。病毒突變引起HBV 疫苗突破感染的機(jī)制包括：1）改變構(gòu)象結(jié)構(gòu)和/或T細(xì)胞表位結(jié)構(gòu)，進(jìn)而通過免疫系統(tǒng)使突變病毒逃避識別和清除；2）通過疏水情況和推定的糖基化位點(diǎn)的變化來改變HBsAg的抗原性，因而減少或消除對HBsAb的親和力，導(dǎo)致保護(hù)減少[20]和HBsAb反應(yīng)正常的患者感染不同基因型或亞型的HBV毒株；3）由于突變型在“a”決定區(qū)域內(nèi)或周圍，aa替代的積累可能會改變HBsAg的免疫性，產(chǎn)生對HBsAb的無效響應(yīng)，使得突變病毒逃避清除、有著更長的生存期[21]。本研究發(fā)現(xiàn)63%的基因型B和50%基因型C在MHR 區(qū)間發(fā)生突變，遠(yuǎn)高于上述幾個國家的報道，應(yīng)引起高度重視和關(guān)注。

本研究中HBV 感染獻(xiàn)血者HBV基因s126 和s129 上的突變主要為s T126S/N/I/A（5/46,10.87%）和s Q129H/R（6/46,13.04%），這2 種突變均被認(rèn)為是免疫逃逸突變，僅在基因型為B的突變株上出現(xiàn)[18,22]。B基因型T126S/N/I/A 和C基因型I126S/T 突變型與免疫逃逸有關(guān)，其與單克隆抗體（MAbs）的結(jié)合將會受到影響[24]。有研究表明sQ129R會減少表面蛋白和病毒顆粒的分泌[24]。這一突變在HBsAg 和HBsAb 共存的慢性乙肝患者中被多次發(fā)現(xiàn)[25-27]。因此，在我國sT126S/N/I/A 和sQ129R 是B型突變株中重要的逃逸突變。s145 位置上的突變率約為2.3%，包括sG145R（2/46，4.35%），這種突變主要在C突變型中被發(fā)現(xiàn)，而本研究的標(biāo)本發(fā)生在B基因型突變，應(yīng)引起高度重視。sG145R 首次在1名乙肝患兒體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，該名嬰兒已有保護(hù)滴度的HBsAb[28]，在后來的幾十年中，sG145R 成為了被報道最多的疫苗逃逸突變[18,22,27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，sG145R可以顯著地減少病毒顆粒的分泌，還會減弱對乙肝表面抗原的檢測[24]。同時，sG145R/A在不同的試劑檢測中還會表現(xiàn)出不同程度的HBsAg結(jié)合改變[15,29]。另外針對B型和C型突變株的研究發(fā)現(xiàn)，sG145R/A與隱匿性乙肝（OBI）有關(guān)[18]。更重要的是，sG145R會隨著時間的推移變得更加穩(wěn)定，最終導(dǎo)致水平傳播[18,30]。因此，表面基因的sG145R/A突變可能會在未來對“全球疫苗計劃”造成威脅。

我國自1992年起實(shí)施了全面的乙肝疫苗接種計劃，使15 周歲以下人群乙肝HBsAg 陽性率迅速由8%下降到0.8%～1.99%，同時在疫苗接種獻(xiàn)血人群中抗-HBc 水平（20.8%）明顯低于一般人群（42%～58%）[31-32]，計劃免疫后出生獻(xiàn)血人群總體HBV 檢出率（乙肝急慢性感染和OBI）也顯著性低于計劃免疫前出生獻(xiàn)血人群[33]。本研究HBsAg 陽性率為0.13%，遠(yuǎn)低于同地區(qū)總獻(xiàn)血人群中的確證比例0.5%[33]，表明疫苗接種的確能降低輸血感染乙肝風(fēng)險。疫苗接種是否具有保護(hù)性主要是抗-HBs 滴度。本研究發(fā)現(xiàn)HBV 感染獻(xiàn)血者中只有2 名抗-HBs+，滴度＜20 IU/L，HBsAg 滴度＜20 IU/mL，表明即使接種了疫苗，由于接種無反應(yīng)或抗體滴度減弱，也會失去保護(hù)性。而男性HBsAg陽性率高于女性（P＜0.05），性別差異是由一系列因素引起的，例如：基因、激素，以及細(xì)胞因子等[34]。

綜上所述，目前高頻率的HBV毒株突變，尤其免疫逃逸相關(guān)突變無疑對輸血安全產(chǎn)生了很大威脅。對此，除大力普及乙肝相關(guān)性疾病的健康知識（如傳播途徑、防護(hù)手段），提高大眾的防范意識，構(gòu)建更加安全采供血體系外，還應(yīng)該加強(qiáng)對病毒基因突變尤其免疫逃逸突變的監(jiān)測和研究。