基于Fas/Fas L通路探討象皮生肌膏對(duì)肛瘺術(shù)后模型大鼠創(chuàng)面細(xì)胞凋亡的影響＊

劉 穎，余 煉，尹園緣，詹 敏，鄒巍瑩，黃靜雯，程 揚(yáng)，賓東華＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長(zhǎng)沙 410208）

肛瘺是指肛管直腸在感染、損傷、異物、疾病等因素影響下所形成的與肛門周圍皮膚相互貫通的一種感染性管道，臨床表現(xiàn)為肛旁腫痛難忍、破潰流膿等，反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈，可發(fā)于任何年齡，以20-40 歲青壯年相對(duì)高發(fā)[1]。有調(diào)查顯示[2]，我國城市居民肛腸疾病發(fā)病率已達(dá)51.14%，肛瘺的發(fā)病率為0.43%?；诟亻T部的特殊生理及解剖學(xué)特點(diǎn)，手術(shù)是目前肛瘺的首選治療方式[3]。瘺管手術(shù)后的糞便污染是不可避免的，易導(dǎo)致的傷口愈合延遲，不僅給患者帶來了沉重的身心、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，更是給肛腸外科醫(yī)生帶來了巨大挑戰(zhàn)[4]。因此，如何快速且有效地促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合具有重要的臨床意義。已有研究表明，凋亡機(jī)制見于創(chuàng)面修復(fù)的各個(gè)階段，且創(chuàng)面愈合的快慢、優(yōu)良等均與修復(fù)過程中細(xì)胞凋亡與增殖之間的平衡關(guān)系密不可分[5-7]。

象皮生肌膏為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，以清末醫(yī)家張山雷《瘍科綱要》之經(jīng)典膏方象皮膏為基礎(chǔ)方化裁而來，內(nèi)含象皮、當(dāng)歸、生地黃、血余炭、醋龜甲等成分，具有活血化瘀、祛腐生肌的功效，廣泛應(yīng)用于我院多種創(chuàng)面修復(fù)，生肌效果顯著。課題組前期研究表明，象皮生肌膏能有效減輕肛瘺患者術(shù)后疼痛、水腫等癥狀，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，具有良好的臨床效果[8-10]。而通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該機(jī)制可能與提高創(chuàng)面組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)水平，降低白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)水平相關(guān)[11-12]。細(xì)胞凋亡已被證實(shí)與創(chuàng)面修復(fù)關(guān)系密切，而Fas/Fas L 通路作為細(xì)胞凋亡的經(jīng)典外源性信號(hào)途徑在針對(duì)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)的相關(guān)研究中暫未見報(bào)道。為進(jìn)一步探究象皮生肌膏促肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制，本研究擬從細(xì)胞凋亡相關(guān)通路及調(diào)控因子著手，通過構(gòu)建肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型，觀察象皮生肌膏對(duì)肛瘺術(shù)后大鼠創(chuàng)面愈合及細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控因子的影響，以期為象皮生肌膏的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

選取36 只雄性SPF 級(jí)健康 Sprague-Dawley 大鼠，體質(zhì)量200-220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度24-26℃，相對(duì)濕度50%-70%。本實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：ZYFY20211104-04）。

1.2 藥物

象皮生肌膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，湘藥制字Z20070276，藥品批次20211212）。

1.3 主要試劑與儀器

Fas抗體、Fas L 抗體、Caspase-8抗體（湖南豐暉生物科技有限公司，貨號(hào)分別為 Fab5301、Fab5305、Fab1938）；Cytochrome c（136F3）抗 體（美 國Cell Signaling technology公司，貨號(hào)#4280T）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP 標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG、山羊抗小鼠二抗、DAB顯色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為GB23303、GB23302、G1214-100UL、G1212-200T）；TUNEL 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)C1090）；蘇木素-伊紅染色液（廣州維格斯生物科技有限公司，貨號(hào)3201121）；TRIpure（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)RP1001）；BeyoRT II MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)D7160L）；RNase Inhibitor（生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號(hào)B600478）；2×Taq PCR MasterMix（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)PC1150）；SYBR Green（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)SY1020）。

生物組織攤烤片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)JK-6）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒儀器公司，型號(hào)LRH）；石蠟切片機(jī)（德國萊卡公司，型號(hào)RM2235）；全自動(dòng)病理切片掃描儀（匈牙利3DHIESTECH 公司，型號(hào)Pannoramic MIDI II）；CaseViewer 2.4 掃描瀏覽軟件（匈牙利3DHIESTECH 公司）；超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)H-2050R）；真空干燥箱（上海SYSBERY 儀器有限公司，型號(hào)DZF-6050）；紫外分光光度計(jì)（美國Thermo 公司，型號(hào)NANO 2000）；熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司，型號(hào)Exicycler 96）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

2.1.1 肛瘺模型的建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，36只SD大鼠予以構(gòu)建肛瘺模型，實(shí)驗(yàn)步驟參照本課題組前期相關(guān)研究[13]。SD 大鼠采用2%戊巴比妥鈉以40 mg·kg-1的劑量腹腔注射麻醉。待麻醉生效后，使用脫毛膏脫除大鼠肛周毛發(fā)，絡(luò)合碘清潔并消毒肛周手術(shù)區(qū)域。大鼠取俯臥位，取50 mL 注射器針頭，自大鼠肛門緩慢進(jìn)入，穿過括約肌，針尖抵達(dá)據(jù)肛緣約1 cm 處，自9 點(diǎn)位肛緣皮膚穿出（時(shí)鐘定位法），退出注射器針頭，沿針頭所致的通道放置直徑約2 mm 的不銹鋼鋼絲，將鋼絲尾端扭轉(zhuǎn)固定，放置30天。

2.1.2 肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型的建立

鋼絲掛線留置30 天后，隨機(jī)選取27 只造模成功的肛瘺大鼠進(jìn)一步構(gòu)建肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型。麻醉生效后，使用0.1%絡(luò)合碘消毒大鼠肛周手術(shù)區(qū)域，隨后沿鋼絲進(jìn)行“瘺管切除術(shù)”，術(shù)后無菌棉球壓迫止血，創(chuàng)面保持開放，將大鼠放回飼養(yǎng)盒，后續(xù)自由飲食，觀察大鼠存活情況。剩余9只肛瘺模型大鼠持續(xù)鋼絲掛線留置，不予以特殊處理。

2.2 分組及給藥

27 只肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型SD 大鼠被隨機(jī)分為以下3組：象皮生肌膏組、凡士林組、模型組，每組9只；剩余9 只肛瘺模型大鼠則納入假手術(shù)組。創(chuàng)面模型建立次日，各組進(jìn)行創(chuàng)面給藥，給藥前各組均予以絡(luò)合碘消毒，生理鹽水沖洗。象皮生肌膏組采用象皮生肌膏紗條覆蓋創(chuàng)面；凡士林組采用凡士林紗條覆蓋創(chuàng)面，后各組均蓋上醫(yī)用無菌敷料加以固定。模型組絡(luò)合碘消毒，生理鹽水沖洗后蓋上醫(yī)用無菌敷料固定。假手術(shù)組無特殊處理。每日給藥干預(yù)1 次，連續(xù)給藥干預(yù)10天。

2.3 創(chuàng)面愈合率

使用數(shù)碼相機(jī)于干預(yù)后第3、5、7、10天，拍攝創(chuàng)面愈合情況，同時(shí)使用0.5 cm×0.5 cm 透明方格面積測(cè)量器測(cè)定創(chuàng)面面積，與造模的初始創(chuàng)面面積進(jìn)行比較，獲得各組創(chuàng)面動(dòng)態(tài)愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）=（初始創(chuàng)面面積-干預(yù)后第n天的面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

2.4 動(dòng)物取材

給藥干預(yù)10 天后，次日在2%戊巴比妥鈉麻醉下取各組創(chuàng)面肉芽組織，假手術(shù)組在行“瘺管切除術(shù)”后取瘺管下創(chuàng)面組織，取材后的部分標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定，部分標(biāo)本液氮速凍后置于-80℃冰箱保存用于進(jìn)一步檢測(cè)。所有大鼠取材后均遵循動(dòng)物倫理福利處死。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 蘇木素-伊紅（Hematoxylin eosin，HE）染色檢測(cè)創(chuàng)面組織病理變化

取創(chuàng)面組織標(biāo)本石蠟切片，將切片脫蠟至水用于染色。隨后將切片經(jīng)蘇木素染色、1%鹽酸乙醇分化、碳酸鋰返藍(lán)、伊紅染色。后經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，將切片用中性樹膠封固。使用Pannoramic MIDI II 全自動(dòng)病理切片掃描儀掃描玻片，CaseViewer2.4 掃描瀏覽軟件查看玻片并采集病理圖片，觀察組織病理變化。

2.5.2 TUNEL染色法檢測(cè)創(chuàng)面組織中細(xì)胞凋亡數(shù)目

創(chuàng)面組織石蠟切片經(jīng)充分脫蠟和水化后，滴加20 μg·mL-1不含DNase 的蛋白酶K，于37℃下處理20 min。PBS 充分漂洗，滴加制備的50 μL TUNEL 檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌3 次，滴加DAPI染核，室溫避光孵育5min，PBS 洗滌后抗熒光淬滅封片液封片。切片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，可見凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色熒光，其他細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。使用病理切片掃描儀、CaseViewer軟件對(duì)玻片進(jìn)行掃描、觀察并采集圖片，采用Image J軟件，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.5.3 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）法檢測(cè)創(chuàng)面組織中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白的表達(dá)

將石蠟切片經(jīng)脫蠟及水化后，置于盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，微波爐中加熱進(jìn)行修復(fù)抗原，8 min后拿出，冷卻至室溫，PBS 洗滌。將切片置于3% H2O2溶液室溫孵育10 min，PBS沖洗。在切片中滴加5%羊血清，室溫封閉20 min，PBS 洗滌。滴加稀釋的一抗，4℃孵育過夜。復(fù)溫洗滌后滴加100 μL 二抗，37℃孵育30 min，PBS 沖洗。滴加新鮮配制的DAB顯色液顯色，于顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性染色為棕黃色。將切片用蘇木素復(fù)染，返藍(lán)液返藍(lán)，蒸餾水洗滌，經(jīng)脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察。使用全自動(dòng)切片掃描儀掃描，在CaseViewer2.4 軟件進(jìn)行觀察及圖像采集，圖片采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析、統(tǒng)計(jì)IOD值。

2.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)創(chuàng)面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA的表達(dá)

取創(chuàng)面組織充分研磨后加入1 mL TRIpure裂解液，混勻后靜置5 min，加入200 μL 氯仿，充分混勻后靜置3 min，4℃ 12000 r·min-1離心10 min。取無色的水相于離心管，加入異丙醇，-20℃下過夜。4 ℃ 2000 r·min-1離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，4℃ 7000 r·min-1離心3 min，棄上清，靜置5-6 min。加30 μL RNase-free ddH2O，靜置2 min，使充分混勻溶解，由此得到樣本總RNA。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣本RNA 濃度。對(duì)得到的RNA 樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到對(duì)應(yīng)的cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)；72℃ 1.5 min，40℃ 1 min，60℃-94℃ 1℃·s-1，25℃ 1 min。以β-actin 為內(nèi)參。利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。引物由通用生物股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0軟件，作圖采用GraphPad Prism 9.3軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素ANOVA 分析。P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 造模情況

肛瘺造模期間各組大鼠未見死亡，參加造模的大鼠于肛周觸及條索樣管道，并可見膿性樣分泌物，提示各組均造模成功。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型造模期間各組大鼠未見死亡，各組造模成功。故實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組9只大鼠均存活，均納入統(tǒng)計(jì)。

3.2 創(chuàng)面愈合情況比較

象皮生肌膏組、凡士林組和模型組大鼠藥物干預(yù)后3、5、7、10 天的創(chuàng)面情況見圖1，創(chuàng)面愈合率比較見表2。與模型組相比，象皮生肌膏組及凡士林組在干預(yù)后7、10天時(shí)顯著促進(jìn)傷口愈合（P＜0.01），且象皮生肌膏組創(chuàng)面愈合率明顯高于凡士林組（P＜0.01）。

表2 象皮生肌膏對(duì)肛瘺術(shù)后大鼠創(chuàng)面愈合率的影響（±s，n=9，%）

表2 象皮生肌膏對(duì)肛瘺術(shù)后大鼠創(chuàng)面愈合率的影響（±s，n=9，%）

注：與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與凡士林組相比，&P＜0.05，&&P＜0.01。

干預(yù)后10 d 84.44±2.95##&&77.16±2.51##68.71±3.52組別象皮生肌膏組凡士林組模型組干預(yù)后3 d 17.14±1.16 16.53±1.19 16.32±1.14干預(yù)后5 d 29.08±2.25 28.25±1.45 27.86±1.69干預(yù)后7 d 50.26±2.08##&&47.21±1.89##44.02±2.35

圖1 象皮生肌膏對(duì)肛瘺術(shù)后大鼠創(chuàng)面愈合的影響

3.3 傷口組織病理學(xué)變化比較

HE 染色結(jié)果如圖2所示，象皮生肌膏組創(chuàng)面組織可見膠原纖維、成纖維細(xì)胞排列整齊，致密，組織中少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見較成熟血管形成，未見組織出血，創(chuàng)面修復(fù)良好。凡士林組大鼠創(chuàng)面組織病理切片中可見新生肉芽組織形成，周圍伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，創(chuàng)面修復(fù)程度低于象皮生肌膏組。模型組大鼠創(chuàng)面可見細(xì)胞排列紊亂，有明顯組織出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 各組肛瘺術(shù)后大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化（HE，×200）

3.4 創(chuàng)面組織中細(xì)胞凋亡數(shù)目比較

細(xì)胞凋亡情況見圖3、圖4，與假手術(shù)組相比，象皮生肌膏組、凡士林組、模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；與凡士林組相比，象皮生肌膏組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，×200）

圖4 各組大鼠創(chuàng)面組織細(xì)胞凋亡情況（±s，n=3）

3.5 創(chuàng)面組織中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果如圖5、圖6所示，與假手術(shù)組相比，模型組、象皮生肌膏組、凡士林組創(chuàng)面組織中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）；與凡士林組相比，象皮生肌膏組Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）。

圖6 各組大鼠創(chuàng)面組織Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白的表達(dá)情況（±s，n=3）

3.6 創(chuàng)面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

RT-PCR 結(jié)果如圖7 所示，與假手術(shù)組相比，模型組、象皮生肌膏組、凡士林組創(chuàng)面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組Fas、Fas L、cytoc mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與凡士林組相比，象皮生肌膏組Fas、Fas L、cyto-c mRNA 表達(dá)水平下降（P＜0.05）。

圖7 各組大鼠創(chuàng)面組織Fas、Fas L、cyto-c mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s，n=3）

4 討論

中醫(yī)對(duì)肛瘺有“肛漏”“痔漏”“穿腸漏”等稱謂，認(rèn)為其因濕熱下注，局部氣血淤滯所致，早于《五十二病方》中便載以“牽引切除法”，為外科手術(shù)治療肛瘺的雛形[14]。至今肛瘺無法通過藥物根治，國內(nèi)外醫(yī)生仍將手術(shù)作為肛瘺的根治手段[15]。而因部位的特殊性，肛瘺術(shù)后創(chuàng)面不予以縫合，呈開放性，在排便污染、局部感染等因素的影響下，術(shù)后創(chuàng)面多愈合緩慢，使得患者飽受痛苦，因此，尋求有效的方法以促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面快速愈合始終是研究的熱點(diǎn)。近年來諸多文獻(xiàn)報(bào)道，中藥外用具簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)，并通過發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多層次的綜合作用，可有效促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面愈合[16-19]。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為肛瘺術(shù)后局部經(jīng)絡(luò)血肉受損，氣血運(yùn)行受阻，加之濕熱未盡，導(dǎo)致創(chuàng)面肌膚筋肉氣血虧虛，無以為養(yǎng)，新肉難生，創(chuàng)面難愈，故肛瘺術(shù)后應(yīng)注意補(bǔ)氣活血，化瘀止痛，祛腐生肌[20]。本實(shí)驗(yàn)所采用的象皮生肌膏屬祛腐生肌之代表性方藥，由象皮、當(dāng)歸、生地黃、血余炭、醋龜甲、生石膏、爐甘石等藥物組成，方中象皮止血止痛、斂瘡生肌，爐甘石、生石膏清熱解毒，當(dāng)歸補(bǔ)血活血、生肌止痛，血余炭化瘀止血，生地清熱養(yǎng)陰、涼血止血，龜甲益腎養(yǎng)血，諸藥配伍合用以達(dá)清熱解毒、活血化瘀、祛腐生肌之效。本研究顯示：與模型組相比，象皮生肌膏組及凡士林組在干預(yù)后7、10天時(shí)顯著促進(jìn)傷口愈合，且象皮生肌膏組創(chuàng)面愈合率明顯高于凡士林組，病理學(xué)結(jié)果顯示象皮生肌膏組創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞少，膠原纖維和成纖維細(xì)胞排列較整齊，致密，創(chuàng)面修復(fù)情況優(yōu)于模型組及凡士林組，表明象皮生肌膏可有效促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合。

細(xì)胞凋亡作為機(jī)體重要的細(xì)胞死亡形式之一，存在于創(chuàng)面修復(fù)的全過程，通過平衡細(xì)胞生長(zhǎng)并消除已經(jīng)完成特定任務(wù)的細(xì)胞群，而不會(huì)引起組織損傷或炎癥反應(yīng)，推動(dòng)創(chuàng)面愈合的進(jìn)展[21]。創(chuàng)面愈合通常分為四大重疊且有序的階段：止血期、炎癥期、增殖期和重塑期[22]，其中增殖期是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵時(shí)期，通過細(xì)胞的快速增殖、遷移，新生肉芽組織逐漸去除炎癥，填補(bǔ)創(chuàng)口缺損，繼而老化形成瘢痕組織，使創(chuàng)面得以愈合。若增殖期肉芽組織中的細(xì)胞過度凋亡，則會(huì)導(dǎo)致愈合延遲，甚至不愈合，因此，通過調(diào)控肉芽組織中的細(xì)胞凋亡，或可達(dá)到促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面快速愈合的目的[23-25]。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，象皮生肌膏組、凡士林組、模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高；與模型組相比，象皮生肌膏組、凡士林組細(xì)胞凋亡率顯著降低；與凡士林組相比，象皮生肌膏組細(xì)胞凋亡率顯著降低，表明象皮生肌膏可通過抑制創(chuàng)面組織細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

凋亡信號(hào)的傳遞涉及到一連串的復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中典型的死亡受體Fas 介導(dǎo)的凋亡通路及線粒體/細(xì)胞色素C（Cytochrome C，cyto c）介導(dǎo)的凋亡通路為調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)外途徑[26]。當(dāng)Fas與配體Fas L結(jié)合，F(xiàn)as 通過三聚化激活并與Fas 相關(guān)死亡域蛋白（Fas-associatingviadeath domain，F(xiàn)ADD）結(jié)合，使得Caspase-8/10 被 募 集，從 而 形 成 由Fas、FADD 和caspase-8/10 組成的死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（Deathinducing signaling complex，DISC），從而導(dǎo)致Procaspase-8激活，進(jìn)而引發(fā)Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而cyto c 是凋亡內(nèi)部信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，當(dāng)細(xì)胞凋亡信號(hào)的刺激使cyto c 從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)，cyto c 與細(xì)胞凋亡激活因子1（Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合募集并激活caspase-9，進(jìn)而活化下游的效應(yīng)子Caspase，引起細(xì)胞凋亡。此外，激活的Caspase-8 可以切割促凋亡蛋白Bid 為tBid，tBid 移位至線粒體，進(jìn)而導(dǎo)致cyto c 介導(dǎo)的凋亡通路激活，使得內(nèi)在及外在凋亡途徑有效串聯(lián)，擴(kuò)大了凋亡信號(hào)[27-31]。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、象皮生肌膏組、凡士林組創(chuàng)面組織中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 相對(duì) 表 達(dá)量及Fas、Fas L、Caspase-8、cyto-c 的蛋白表達(dá)水平顯著升高；與模型組相比，象皮生肌膏組及凡士林組Fas、Fas L、cyto-c mRNA相對(duì)表達(dá)量及Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達(dá)水平顯著下降；與凡士林組相比，象皮生肌膏組Fas、Fas L、cyto-c mRNA 相對(duì) 表達(dá)量及Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表達(dá)水平顯著下降，表明象皮生肌膏可通過抑制Fas/Fas L 通路的激活，抑制細(xì)胞凋亡，利于創(chuàng)面愈合。

綜上所述，本研究證實(shí)象皮生肌膏能抑制肛瘺術(shù)后創(chuàng)面細(xì)胞凋亡，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其作用機(jī)制可能與抑制Fas/Fas L通路的激活有關(guān)。