藍(lán)莓酵素復(fù)合菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化及品質(zhì)分析

楊彬彥，黨 婭，3*，黎坤怡

（1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省果業(yè)管理局秦巴山區(qū)藍(lán)莓研究所，陜西 漢中 723000；3.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000）

藍(lán)莓是抗氧化性最高的水果之一，富含活性酶和各種酚類(lèi)物質(zhì)，包括花色苷、黃酮醇和原花青素[1]。然而，由于藍(lán)莓容易受到機(jī)械損傷、微生物腐爛和水分流失的影響，因此極易變質(zhì)，導(dǎo)致保質(zhì)期短[2]。為了解決這些問(wèn)題，將藍(lán)莓鮮果進(jìn)行益生菌發(fā)酵用于生產(chǎn)藍(lán)莓酵素，可提高食品保質(zhì)期、營(yíng)養(yǎng)及感官品質(zhì)，并去除食品基質(zhì)中的不良化合物[3]。

隨著人們養(yǎng)生意識(shí)的增強(qiáng)，酵素因其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能逐漸出現(xiàn)在大眾的視野中[4]。酵素是指以動(dòng)物、植物、菌類(lèi)等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[5]。藍(lán)莓漿果經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵不僅可以提高藍(lán)莓漿果的利用率，還能提高原料營(yíng)養(yǎng)多樣性和生物活性[6-7]。而益生菌發(fā)酵菌種對(duì)藍(lán)莓酵素的品質(zhì)和口感密切相關(guān)。益生菌的定義為“當(dāng)攝入足夠量時(shí)，為宿主提供健康益處的活的微生物”[8]?；谌樗峋陌l(fā)酵有助于提高食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化率，控制潛在感染，還與功能性生物活性物質(zhì)有關(guān)[9]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是最常用于發(fā)酵植物性食品的菌種[10]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）可以產(chǎn)生各種活性酶，將原料基質(zhì)轉(zhuǎn)化為功能性成分[11]。酵母菌能夠促進(jìn)乳酸菌等有益菌群繁殖，抑制病原微生物生長(zhǎng)，提高食物消化率及增強(qiáng)人體免疫力[12]。利用益生菌在水果基質(zhì)中發(fā)酵比乳制品更復(fù)雜，并且生長(zhǎng)受其他微生物和發(fā)酵條件的影響，例如pH、溫度、時(shí)間等[13-14]。目前，已有關(guān)于發(fā)酵菌種制備藍(lán)莓酵素的研究報(bào)道[15-16]。LI S J等[17]從水果中篩選出植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，發(fā)現(xiàn)其在藍(lán)莓汁中具有良好的發(fā)酵能力，活菌數(shù)超過(guò)10.0 lg CFU/mL，同時(shí)提高了酚類(lèi)含量和抗氧化能力。白琳等[18]利用植物乳桿菌、乳酸片球菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵藍(lán)莓果汁，均勻設(shè)計(jì)確定其最佳接種體積比例分別為22.45%、42.86%、14.29%、16.33%、4.10%，響應(yīng)面優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時(shí)間36 h，發(fā)酵溫度37 ℃，初始接種量5.5×106CFU/mL，初始總可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量為11°Bx，發(fā)酵后藍(lán)莓酵素的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力達(dá)87.45 U/g。李虹甫等[19]選擇植物乳桿菌J26對(duì)藍(lán)莓果汁在發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵劑接種量3%的條件下進(jìn)行發(fā)酵，活菌數(shù)可達(dá)1×109CFU/mL。然而，我國(guó)的藍(lán)莓酵素還處于初步階段，其生產(chǎn)研究和產(chǎn)業(yè)化都不完善[20-23]。此外，發(fā)酵工藝還存在原料利用率低；發(fā)酵參數(shù)變化復(fù)雜、難以控制且發(fā)酵周期較長(zhǎng)；營(yíng)養(yǎng)成分損失大、成本高、品質(zhì)低、效率差等問(wèn)題。

本研究以藍(lán)莓為主要原料，以酵母菌、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）為發(fā)酵菌種制備藍(lán)莓酵素，以SOD酶活性為考察指標(biāo)，首先通過(guò)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定復(fù)合菌種的最佳體積接種比例；其次通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始總可溶性固形物含量及料液比對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響；最后通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)獲得最佳發(fā)酵工藝條件。以期生產(chǎn)具有高抗氧化能力的新型發(fā)酵非乳制飲料，為生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富的藍(lán)莓酵素提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，提高藍(lán)莓的利用率和附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍(lán)莓：產(chǎn)自陜西漢中；葡萄酒果酒專(zhuān)用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：西安灃東新城永勝食品廠(chǎng)；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21809、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）6104：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；果膠酶（30 000 U/g）、纖維素酶（100 000 U/g）、半纖維素酶（50 000 U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；冰乙酸（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；DSX-18L高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司；TDZ4A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠(chǎng)；NR-EW63WXA-H冰箱：中國(guó)海爾公司；CP114電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；JYL-C50T打漿機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；DH3600BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；手持式折光儀：艾普計(jì)量?jī)x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓酵素加工工藝流程及操作要點(diǎn)

藍(lán)莓預(yù)處理→清洗、打漿→酶解→調(diào)整糖度→滅菌→接種→發(fā)酵→靜置→過(guò)濾→藍(lán)莓酵素成品

操作要點(diǎn)：

酵母菌活化：將葡萄酒果酒專(zhuān)用酵母用10倍蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蛑寥芙?，放置?0～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，當(dāng)出現(xiàn)大量泡沫即表明活化完畢，取出備用。植物乳桿菌（干酪乳桿菌）活化：將斜面保藏的植物乳桿菌（干酪乳桿菌）在MRS肉湯培養(yǎng)基中活化，兩次繼代培養(yǎng)后，36 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，備用。

將冷凍的藍(lán)莓（-20 ℃）在4 ℃解凍后清洗晾干，用榨汁機(jī)破碎得到藍(lán)莓果漿，在55 ℃條件下加入0.8%的果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶（2∶1∶1）酶解3 h[18]。酶解結(jié)束后向藍(lán)莓果漿中加入一定量的白砂糖，調(diào)整初始TSS含量為12°Bx。采用巴氏殺菌法殺菌（85 ℃、15 min）。將活化完成的酵母菌、植物乳桿菌及干酪乳桿菌接種發(fā)酵（采用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)保證菌種的活菌數(shù)達(dá)到109CFU/mL，體積比為0.1%、2%、0.47%），在31 ℃發(fā)酵40 h，4 ℃條件下靜置2 h、使用紗布對(duì)其過(guò)濾，獲得藍(lán)莓酵素成品。

1.3.2 復(fù)合菌種接種量?jī)?yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)成福等[24-25]的方法進(jìn)行3因素8水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，以SOD酶活性、pH值為響應(yīng)值，以3種復(fù)合菌種（酵母菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌）的接種體積比例為影響因素。在溫度為31 ℃，初始TSS含量為12 °Bx，料液比為1∶5的條件下發(fā)酵40 h，均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 復(fù)合菌種接種量?jī)?yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of uniform design tests for inoculum optimization of mixed strains

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定各菌種初始接種量為109CFU/mL，參考上述工藝固定其他指標(biāo)，考察發(fā)酵時(shí)間（32 h、36 h、40 h、44 h、48 h）、發(fā)酵溫度（28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃）、料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL））、初始TSS含量（9°Bx、10°Bx、11°Bx、12°Bx、13°Bx）4個(gè)因素對(duì)SOD酶活力的影響。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以SOD酶活（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始TSS含量（C）、料液比（D）4個(gè)因素為自變量，采用4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化藍(lán)莓酵素發(fā)酵的最佳工藝條件。發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.5 分析檢測(cè)

pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)；SOD酶活力的測(cè)定：采用SOD酶試劑盒；總可溶性固形物含量的測(cè)定：采用折光計(jì)法；乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》?？偦ㄉ蘸康臏y(cè)定：采用pH示差法[26]。酒精度的測(cè)定：參照GB 5009.225—2023《酒中乙醇濃度的測(cè)定》；總酚含量的測(cè)定：采用福林酚法[27]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，Origin 2021進(jìn)行繪圖，Design-Expert 13.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌種接種量?jī)?yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與分析

均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合菌種接種量的結(jié)果與分析見(jiàn)表3。

表3 復(fù)合菌種接種量?jī)?yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of uniform design tests for inoculum optimization of mixed strains

由表3可知，在8組試驗(yàn)中，各組試驗(yàn)的pH值差異不明顯，SOD酶活顯示出較大不同。故以SOD酶活（Y）為響應(yīng)值，運(yùn)用SPSS 24.0軟件建立二次多項(xiàng)式回歸方程如下：

Y=18.756-32.227X2+561.391X3-8.976X1X2+4.393X22-587.476X3X2

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，決定系數(shù)R2=0.96，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.92，F(xiàn)值為11.77，P值為0.01＜0.1，達(dá)到極顯著水平，證明該回歸方程可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)最佳接種量。運(yùn)用Excel 2016預(yù)測(cè)藍(lán)莓酵素的最佳接種量分別為酵母菌0.1%、植物乳桿菌2%、干酪乳桿菌0.47%，在此條件下，SOD酶活達(dá)105 U/mL。根據(jù)預(yù)測(cè)出的最佳條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出藍(lán)莓酵素的SOD酶活為101 U/mL。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始可溶性固形物和料液比對(duì)藍(lán)莓酵素SOD酶活力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始總可溶性固形物含量（C）和料液比（D）對(duì)藍(lán)莓酵素SOD酶活的影響Fig.1 Effects of fermentation time (A), temperature (B), initial total soluble solid content (C), and solid and liquid ratio (D) on SOD activity of blueberry Jiaosu

由圖1A可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在32～40 h范圍內(nèi)延長(zhǎng)，SOD酶活逐漸增加；發(fā)酵時(shí)間為40h時(shí)，SOD酶活達(dá)到最大，為102 U/mL；發(fā)酵時(shí)間＞40 h，SOD酶活力降低。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為40 h。由圖1B可知，隨著發(fā)酵溫度在28～31 ℃的升高，SOD酶活逐漸增加；發(fā)酵溫度為31 ℃時(shí)，SOD酶活達(dá)最高值，為92 U/mL；當(dāng)發(fā)酵溫度高于31 ℃時(shí)，SOD酶活力逐步下降。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為31℃。由圖1C可知，隨著初始TSS含量的升高，SOD酶活力逐漸增加；當(dāng)初始TSS含量為12°Bx時(shí)，SOD酶活力達(dá)最大值，為105 U/mL；當(dāng)初始TSS含量＞12°Bx時(shí)，SOD酶活力逐漸下降。因此，確定最佳初始TSS含量為12°Bx。由圖1D可知，當(dāng)料液比為1∶4、1∶5（g∶mL）時(shí)，SOD酶活力逐漸增加；當(dāng)料液比為1∶5（g∶mL）時(shí)，SOD酶活達(dá)最高值，為102 U/mL；當(dāng)料液比為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL）時(shí)，SOD酶活逐漸下降。因此，確定最佳料液比為1∶5（g∶mL）。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以SOD酶活（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始TSS含量（C）、料液比（D）4個(gè)因素為自變量進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化藍(lán)莓酵素發(fā)酵的最佳工藝條件。發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

通過(guò)Design-Expert 13.0軟件對(duì)表4結(jié)果進(jìn)行方差分析和二元多次回歸擬合，獲得SOD酶活與發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始TSS含量、料液比的二次多項(xiàng)式回歸方程如下：

Y=105.52-1.89A+1.29B+0.78C+0.39D-3.48AB+1.88AC+0.4AD-

1.93BC+0.14BD-1.91CD-12.13A2-8.93B2-11.08C2-6.33D2

由表5可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P值為0.472 7＞0.05，即失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)R2=0.991，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.983，說(shuō)明此模型擬合效果良好，能夠分析預(yù)測(cè)藍(lán)莓酵素的發(fā)酵工藝參數(shù)。由P值可知，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB、AC、BC、CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對(duì)SOD酶活影響大小順序?yàn)锳＞B＞C＞D。

響應(yīng)面的等高線(xiàn)形狀及響應(yīng)面坡度可以反映自變量之間的交互影響，響應(yīng)面坡面越陡，表明因素之間的相互作用越顯著。由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間（A）與發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（A）與初始TSS值（C）、發(fā)酵溫度（B）與初始TSS（C）、初始TSS含量（C）與料液比（D）之間存在交互作用，且這些因素的相互作用對(duì)SOD酶活力影響極顯著（P＜0.01）。

圖2 各因素間交互作用對(duì)藍(lán)莓酵素SOD酶活影響的響應(yīng)曲面及等高線(xiàn)Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on SOD activity of blueberry Jiaosu

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果得到藍(lán)莓酵素的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間41.43 h，發(fā)酵溫度31.09 ℃，初始TSS含量12.04 °Bx，料液比1∶4.99（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，藍(lán)莓酵素的SOD酶活力預(yù)測(cè)值可達(dá)103.29 U/mL。為方便實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵工藝條件修正為發(fā)酵時(shí)間41.5 h，發(fā)酵溫度31 ℃，初始TSS含量12°Bx，料液比1∶5（g∶mL），在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到SOD酶活實(shí)際值為103.01 U/mL，與預(yù)測(cè)值相差不大。

2.4 藍(lán)莓酵素的品質(zhì)評(píng)價(jià)

藍(lán)莓酵素成品呈深紫紅色，色澤均勻，果香濃郁，口感酸甜適宜，無(wú)外來(lái)雜質(zhì)。制備的藍(lán)莓酵素pH值為3.14，酒精度為0.2%vol，總酚含量為3.14 mg/mL，花色苷含量為26.06 mg/mL，乳酸菌活菌數(shù)為1.01×107CFU/mL，SOD酶活性為103.01 U/mL，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5323—2018《植物酵素》要求。

3 結(jié)論

該研究以藍(lán)莓為主要原料，以酵母菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌為發(fā)酵菌種制備藍(lán)莓酵素，確定酵母菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌三種菌株的最佳接種體積比分別為0.1%、2%、0.47%，藍(lán)莓酵素的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間41.5 h，發(fā)酵溫度31 ℃，初始總可溶性固形物含量12°Bx，料液比1∶5（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，藍(lán)莓酵素的SOD酶活力可達(dá)103.01 U/mL，pH值為3.14，酒精度為0.2%vol，總酚含量為3.14 mg/mL，花色苷含量為26.06 mg/mL，乳酸菌活菌數(shù)為1.01×107CFU/mL。本研究開(kāi)發(fā)出一款具有高SOD酶活力的藍(lán)莓酵素產(chǎn)品，今后可進(jìn)一步研究酵素制品對(duì)人類(lèi)健康的益處。