一株耐低溫異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的分離鑒定及其脫氮特性

董怡華 王凌瀟 任涵雪 陳峰

（1. 沈陽大學(xué)區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點實驗室，沈陽 110044；2. 沈陽大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽 110044）

隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活污水中氮含量急劇增加，過量的氮排放導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，進而引起水質(zhì)惡化，嚴(yán)重破壞水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)，威脅人類健康［1］。因此，高效去除水中的氮已成為環(huán)境污染治理領(lǐng)域的研究熱點。生物脫氮技術(shù)因其簡單高效、成本低廉和無二次污染等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注［2］。傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)包括自養(yǎng)硝化和厭氧反硝化兩個過程［3］。通常，硝化是自養(yǎng)硝化菌在好氧條件下將氨氮（NH4+?N）轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮（NO2-?N）或硝態(tài)氮（NO3-?N）的過程［4］。而反硝化則是通過異養(yǎng)反硝化菌在厭氧條件下將NO2-?N或NO3-?N 轉(zhuǎn)化為氮氣得以實現(xiàn)［5］。由于好氧硝化菌和厭氧反硝化菌的生長環(huán)境條件和代謝途徑不同，導(dǎo)致硝化和反硝化作用不能同步進行，這不僅增加了投資成本和能耗，還影響了脫氮效率［6］。

20 世紀(jì)80 年代，一株好氧反硝化細(xì)菌——泛養(yǎng)硫球菌（Thiosphaera pantotropha）的首次發(fā)現(xiàn)，打破了反硝化作用只能在厭氧條件下進行的傳統(tǒng)觀念，為實現(xiàn)同步硝化反硝化工藝奠定了重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)［7］。此后，在眾多微生物物種中不斷分離出了多株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（heterotrophic nitrification and aerobic denitrification, HN?AD）菌，如Microbacteriumsp. SFA 13［8］、Alcaligenes faecalisC16［9］、Pseudomonas aeruginosaP?1［10］、Acinetobac?ter juniiYB［11］等。這些功能菌不僅可以利用各種有機碳作為能源和電子供體，將NH4+?N 轉(zhuǎn)化為NO3-?N 或NO2-?N，還可以在好氧條件下逐步將NO3-?N或NO2-?N 還原為氣態(tài)氮，從而實現(xiàn)同步硝化和反硝化作用［12］。此外，好氧反硝化過程中產(chǎn)生的堿還可以平衡硝化作用產(chǎn)生的酸，從而降低調(diào)節(jié)pH 的額外成本［13］。與傳統(tǒng)自養(yǎng)硝化菌和厭氧反硝化菌相比，HN?AD 菌具有諸多優(yōu)勢，包括更快的生長速率和脫氮速率，更低的操作成本和空間占用，以及在氮轉(zhuǎn)化過程中更少的中間產(chǎn)物殘留量等［14］。然而，文獻中報道的大多數(shù)HN?AD 菌都是中溫細(xì)菌，其細(xì)胞生長和脫氮的最佳溫度為25-37℃。當(dāng)溫度低于15℃時，這類功能菌的生長和代謝活性就會受到嚴(yán)重抑制［15-16］。寒冷地區(qū)冬季的地表水和大部分生活污水溫度均在15℃以下，甚至低于5℃。在這種情況下，HN?AD 菌對實際含氮廢水的處理效果較差。分離篩選高效耐低溫HN?AD 菌是解決上述問題的一種有效方法。然而目前其相關(guān)研究尚處于起步階段，只有少數(shù)HN?AD 細(xì)菌在低溫條件下能夠有效去除氮，如Arthrobacter arilaitensisY?10［17］和Acinetobacter calco?aceticusTY1［18］。此外，這類功能菌在低溫條件下的脫氮特性和氮去除途徑仍不明晰。

本研究從寒冷地區(qū)冬季河水底泥中分離、篩選得到一株耐低溫HN?AD 菌株，通過菌落及細(xì)胞形態(tài)特征觀察和16S rRNA 基因序列分析對其進行了菌種鑒定。在10℃條件下考察了以NH4+?N、NO3-?N 或NO2-?N 為唯一氮源，以及NH4+?N 和NO3-?N 為混合氮源時，該菌株的異養(yǎng)硝化、好氧反硝化和同步硝化反硝化性能。最后，通過PCR 擴增了硝化和反硝化特異酶的相關(guān)功能基因，并由此推測了該菌株在低溫條件下可能的氮代謝途徑。本研究為耐低溫異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌在含氮廢水凈化中的實際應(yīng)用提供了一種新的菌種資源，為低溫廢水生物脫氮處理奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本研究所用樣品取自冬季遼寧省沈陽市南部污水處理廠二沉池活性污泥和北運河河水底泥沉積物，并置于4℃冰箱中保存。

1.1.2 培養(yǎng)基組成 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g）［19］：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，蒸餾水 1 L，pH 調(diào)節(jié)至7.0-7.2。在培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉即為對應(yīng)的固體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)、菌落的形態(tài)觀察和菌株保存。

參照湯默然等［20］有所改進的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（nitrification medium, NM）（g）：Na3C6H5O7·2H2O 2.0，（NH4）2SO40.5，K2HPO40.8，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 0.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04，CaCl2·H2O 0.03， 蒸餾水1 L，微量元素溶液1 mL，pH 調(diào)節(jié)至7.0-7.2。該培養(yǎng)基用于菌株的硝化性能研究。

參照湯默然等［20］有所改進的好氧反硝化培養(yǎng)基（denitrification medium, DM）（g）：Na3C6H5O7·2H2O 2.5，NaNO30.64（DM?1 培養(yǎng)基）或NaNO20.52（DM?2培養(yǎng)基），K2HPO40.8，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 0.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04，CaCl2·H2O 0.03，蒸餾水1 L，微量元素溶液1 mL，pH 調(diào)至7.0-7.2。該培養(yǎng)基用于菌株的反硝化性能研究。

溴百里酚藍(lán)（BTB）固體培養(yǎng)基：在DM?1 培養(yǎng)基中添加0.2%溴百里酚藍(lán)（體積分?jǐn)?shù)為1%，溶于乙醇）和2%瓊脂粉。

參照NM 培養(yǎng)基并有所改進的同步硝化反硝化培養(yǎng)基（simultaneous nitrification and denitrifica?tion medium, SNDM）（g）：Na3C6H5O7·2H2O 2.5，(NH4)2SO40.25，NaNO30.32，K2HPO40.8，Mg?SO4·7H2O 0.4，NaCl 0.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04，Ca?Cl2·H2O 0.03，蒸餾水1 L，微量元素溶液1 mL，pH調(diào)至7.0-7.2。該培養(yǎng)基用于菌株的同步硝化反硝化性能研究。

上述培養(yǎng)基中的微量元素液組成（g）：H3BO31.5，ZnSO4·7H2O 0.06，MnSO4·H2O 0.8，CuSO4·5H2O 0.1，CoSO4·7H2O 0.01，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.2，KI 0.18，蒸餾水1 L。

上述所有培養(yǎng)基均在接種前于121℃，1.0×105Pa 條件下高溫高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 耐低溫異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的分離篩選 取5 g 活性污泥或河水底泥用無菌玻璃珠打散均勻后，轉(zhuǎn)接至含有100 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，并于10℃、140 r/min 的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h。重復(fù)上述相同步驟3 次后獲得細(xì)菌培養(yǎng)物。用無菌去離子水將1 mL 上述富集培養(yǎng)物按濃度梯度10-3、10-4、10-5和10-6倍進行稀釋，吸取每種濃度下的稀釋菌液100 μL 均勻涂布在BTB固體培養(yǎng)基上，并于10℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d。挑取周圍變藍(lán)且具有明顯形態(tài)差異的獨立菌落進行平板劃線分離培養(yǎng)，重復(fù)多次直到在光學(xué)顯微鏡下確定為純菌，然后進行斜面試管培養(yǎng)，并置于冰箱4℃下保存。

用接種環(huán)挑取分離的不同純菌以相同接種量（1×106CFU/mL）分別接種于100 mL 的NM、DM?1和DM?2 液體培養(yǎng)基中，于10℃、140 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液于6 000 r/min 離心10 min 后測定上清液中NH4+?N、NO3-?N、NO2-?N和TN 的質(zhì)量濃度，從而對分離的純菌進行硝化反硝化能力檢測。篩選除氮效果最好且NO2-?N 殘留量最少的菌株作為后續(xù)研究對象。

1.2.2 菌株的鑒定 將所分離篩選的純菌株接種至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d 后觀察菌落特征。利用掃描電子顯微鏡（SEM, Thermo Scientific Apreo 2, USA）觀察菌株細(xì)胞的個體形態(tài)，并進行革蘭氏染色。

采用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒SK8255（Sangon Biotech，上海）提取菌株的DNA，并利用通用引物27F 和1492R（表1）進行16S rRNA 基因的擴增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Taq Plus DNA 聚合酶1 μL，MgSO42.5 μL，引物27F 和1492R 各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；9℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30 個循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。通過BLAST 軟件與GenBank 基因數(shù)據(jù)庫中其他菌株進行16S rRNA 基因序列同源性對比，選擇序列相似度較高的菌株，利用MEGA7.0 軟件通過鄰接法（neighbor?joining, NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR 引物序列表Table 1 PCR primer sequences list

1.2.3 功能基因的PCR 擴增 采用試劑盒B518255（Sangon Biotech，上海）提取菌株的DNA，對周質(zhì)硝酸鹽還原酶（NAP）、羥胺氧化酶（HAO）、亞硝酸鹽還原酶（NIR）、一氧化氮還原酶（NOR）、一氧化二氮還原酶（NOS）的編碼基因napA、hao、nirS、nirK、cnorB和nosZ分別進行PCR 擴增，PCR 特異性目標(biāo)引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 1 μL，引物F 和R 各1 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，Taq Plus DNA 聚合酶 0.2 μL，ddH2O 25 μL。PCR 的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環(huán)；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能 以(NH4)2SO4、NaNO3和NaNO2分別作為NM、DM?1和DM?2 培養(yǎng)基中的唯一氮源，探索菌株在低溫條件（10℃）下的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能。采用(NH4)2SO4+NaNO3作為SNDM 培養(yǎng)基中的混合氮源，考察菌株在低溫（10℃）條件下的同步硝化反硝化能力。上述培養(yǎng)基中的N 含量均為105 mg/L。將所篩選的菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，用無菌去離子水配制濃度為1×106CFU/mL 的菌懸液，以10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量分別接種至150 mL 的NM、DM?1、DM?2、SNDM 無菌培養(yǎng)基中，在10℃、140 r/min 的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h。每4 h 取樣測定菌體生長量（D600）、NH4+?N、NO3-?N、NO2-?N 和TN 的質(zhì)量濃度，并計算相應(yīng)的氮去除率和氮去除速率。

1.2.5 分析方法 通過測定細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm 波長處的吸光度值（D600）表征菌體生長量?？偟╰otal nitrogen, TN）質(zhì)量濃度是培養(yǎng)液搖勻后直接取樣分析測定。NH4+?N、NO3-N、NO2-?N 和溶解性總氮（dissolved total nitrogen, DTN）是將培養(yǎng)液以6 000 r/min 離心10 min 后取上清液測定。上述氮指標(biāo)的測定根據(jù)水和廢水監(jiān)測分析方法進行［27］，如表2 所示。實驗中對各項氮指標(biāo)以及菌體生長量的測定均采用紫外-可見分光光度計（DR6000, HACH, USA）進行。

表2 水質(zhì)指標(biāo)及分析方法Table 2 Analysis methods for water quality indicators

上述測定結(jié)果用以下公式計算菌株的生長速率、脫氮率、細(xì)胞內(nèi)生物氮和氣態(tài)氮質(zhì)量濃度等指標(biāo)。

① 生長速率μ/h 的計算如下：

式中，D600、D'600分別是細(xì)菌培養(yǎng)液培養(yǎng)初始和終態(tài)在600 nm 波長處的吸光度值，用以表征菌體生長量，t 為培養(yǎng)時間，單位為h。

② 氮去除率R（%）和氮去除速率V［mg/（L·h）］的計算如下：

式中，C0和Ct分別是培養(yǎng)液中各種形態(tài)氮的初始質(zhì)量濃度和培養(yǎng)t h 后的質(zhì)量濃度，單位為mg/L。

③ 細(xì)胞內(nèi)生物氮質(zhì)量濃度CIntracellular?N（mg/L）的計算方法為［26］：

式中，CTN和CDTN分別為培養(yǎng)液的TN 質(zhì)量濃度及其離心后上清液DTN 質(zhì)量濃度。

④ 氣態(tài)氮質(zhì)量濃度CGas?N（ mg/L）的計算方法：

其中，C0為氮的初始質(zhì)量濃度，和分別為t h 后培養(yǎng)液離心上清液中NH4+?N、NO3-?N、NO2-?N 的質(zhì)量濃度。

本研究所有實驗重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation, SD）表示。采用Excel 和Origin Pro 2021 軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析與繪制圖形。

2 結(jié)果

2.1 耐低溫異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的分離篩選與鑒定

2.1.1 菌株的分離篩選 經(jīng)過富集培養(yǎng)、劃線分離和純化，從活性污泥和河水底泥樣品中分離出19 株能夠在低溫（10℃）條件下生長，且菌落形態(tài)不同的純菌株。通過異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的初步檢測，從中篩選出1 株在10℃條件下脫氮效果最好且NO2-?N 累積量最少的菌株DH?3，培養(yǎng)48 h 后對NH4+?N、NO3-?N 和NO2-?N 的去除率分別為99.07%、96.89%和90.29%。

2.1.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 菌株DH?3 是從冬季河水底泥樣品中分離得到，其在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上生長的菌落呈淡黃色不透明，邊緣規(guī)則整齊，表面光滑凸起有黏性，直徑約為1-3 mm（圖1?A）；經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性菌（圖1?B），掃描電鏡下觀察其細(xì)胞呈長桿狀，大小為（0.1-0.2）μm×（1.5-2.8）μm（圖1?C）。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定 通過PCR 擴增和測序獲得菌株DH?3 的部分16S rRNA 基因序列（1 428 bp），測序結(jié)果在GenBank 中的登錄號為OQ152538。與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有基因序列進行BLAST 同源性對比，采用MEGA7.0 軟件通過鄰接法（neighbor?joining, NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明菌株DH?3 與維氏假單胞菌（Pseudomonas veronii）的基因序列相似性達(dá)99%以上，其中與Pseudomonas veroniistrain CIP 104663（NR 028706.1）基因片段的親緣性最高。

圖2 基于16S rRNA 基因序列同源性構(gòu)建的菌株DH-3 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain DH-3 based on 16S rRNA homologous sequences

綜上，結(jié)合菌株DH?3 的菌落特征、細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征以及16S rRNA 基因序列分析結(jié)果，初步鑒定該菌株為維氏假單胞菌（Pseudomonas veronii），命名為P.veroniiDH?3。

2.2 菌株P(guān). veronii DH?3的低溫異養(yǎng)硝化性能

在去除碳源（Na3C6H5O7·2H2O）的NM 培養(yǎng)基中進行探索試驗，培養(yǎng)48 h 后，培養(yǎng)液的D600為0，表明碳源的缺乏嚴(yán)重抑制了菌株DH?3 的生長，由此證明菌株DH?3 是一株異養(yǎng)菌。以（NH4）2SO4作為NM 培養(yǎng)基中的唯一氮源，考察10℃條件下菌株P(guān).veroniiDH?3 的異養(yǎng)硝化性能。脫氮過程中菌體生長量和各種氮指標(biāo)的質(zhì)量濃度變化如圖3 所示。

圖3 以NH4+-N 為唯一氮源時菌株DH-3 的生長及異養(yǎng)硝化特性Fig. 3 Growth and heterotrophic nitrification performance of strain DH-3 with NH4+-N as the sole nitrogen source

經(jīng)過8 h 的生長停滯期后，菌株P(guān).veroniiDH?3迅速生長繁殖并進入對數(shù)生長期，24 h 時D600達(dá)到最大值1.796，隨后進入穩(wěn)定生長期，D600變化不大。NH4+?N 的去除率隨菌株的生長繁殖而升高。好氧培養(yǎng)48 h 后，NH4+?N 濃度從初始的105.5 mg/L 下降至0.98 mg/L，去除率為99.07%。培養(yǎng)48 h 后，TN 質(zhì)量濃度從105.6 mg/L 顯著下降到1.78 mg/L，去除率為98.31%。在整個脫氮過程中沒有檢測到中間產(chǎn)物NO2-?N 的累積，而NO3-?N 在培養(yǎng)24 h 出現(xiàn)最大累積濃度值2.74 mg/L，48 h 后降至0.37 mg/L。

表3 的氮平衡分析結(jié)果表明，約有53.9%的初始NH4+?N 通過硝化作用轉(zhuǎn)化為含氮氣體（如N2O 或N2），而約44.8%的初始NH4+?N 通過同化作用轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生物氮，這與之前得到的NH4+?N 去除率與菌株DH?3細(xì)胞生長密切相關(guān)的結(jié)果是一致的。因此，菌株P(guān).veroniiDH?3 的異養(yǎng)硝化過程主要是在好氧條件下通過同化和異化作用將NH4+?N 轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生物氮和含氮氣體。

2.3 菌株P(guān). veronii DH?3的低溫好氧反硝化性能

以NO3-?N 和NO2-?N 分別作為DM?1 和DM?2培養(yǎng)基中的唯一氮源，考察菌株P(guān).veroniiDH?3 在10℃下的生長和好氧反硝化性能，結(jié)果如圖4 和圖5 所示。

圖4 NO3--N 為唯一氮源時菌株DH-3 的生長及好氧反硝化特性Fig. 4 Growth and aerobic denitrification performance of strain DH-3 with NO3--N as the sole nitrogen source

圖5 NO2--N 為唯一氮源時菌株DH-3 的生長及好氧反硝化特性Fig. 5 Growth and aerobic denitrification performance of strain DH-3 with NO2--N as sole nitrogen source

由圖4 可知，以NO3-?N 為唯一氮源時，菌株P(guān).veroniiDH?3 在好氧條件下培養(yǎng)0-8 h，D600僅從0.068增加至0.103，此階段為菌株的生長停滯期；隨著菌株進入對數(shù)生長期（8-28 h）的快速增殖，D600達(dá)到最大值1.572；之后菌株進入穩(wěn)定期；培養(yǎng)40 h后菌株進入衰亡期，D600逐漸下降。在對數(shù)生長期，NO3-?N 濃度從105.43 mg/L 迅速下降至52.18 mg/L，48 h 后NO3-?N 的去除率為96.89%。在氮轉(zhuǎn)化過程中積累了少量的NO2-?N，32 h 達(dá)到最大累積濃度2.51 mg/L，48 h 后被完全去除。

由圖5 可知，以NO2-?N 為唯一氮源時，菌株DH?3 經(jīng)歷了12 h 的生長停滯期以適應(yīng)NO2-?N 的細(xì)胞毒性。隨后菌株迅速生長并進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)32 h 時D600達(dá)到最大值1.378，之后逐漸降低進入衰亡期。培養(yǎng)48 h 后，NO2-?N 質(zhì)量濃度從105.53 mg/L 下降到10.24 mg/L，去除率為90.29%。培養(yǎng)過程中檢測到在32 h 出現(xiàn)NO3-?N 最大累積濃度5.27 mg/L，之后逐漸降低至0.25 mg/L。菌株DH?3 以NO3-?N 和NO2-?N 分別為唯一氮源時對TN 的去除率為94.69%和88.03%，低于以NH4+?N 為唯一氮源時的去除率（98.31%）。表3 的氮平衡分析結(jié)果表明，分別有52.6%的初始NO3-?N和50.4%的初始NO2-?N 通過反硝化作用轉(zhuǎn)化為含氮氣體，相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)生物氮含量分別為（42.76 ±2.07）mg/L 和（38.58 ± 2.31）mg/L，氣體和細(xì)胞內(nèi)生物氮的轉(zhuǎn)化率均低于NH4+?N 為唯一氮源時的轉(zhuǎn)化率，說明NH4+?N 更容易被菌株DH?3 所利用，同時表明該菌株的異養(yǎng)硝化能力強于好氧反硝化能力。

2.4 菌株P(guān). veronii DH?3的同步硝化反硝化特性

以NH4+?N 和NO3-?N 作為混合氮源，研究了菌株P(guān). veroniiDH?3 在10℃下的同步硝化反硝化性能，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 NH4+-N 和NO3--N 為混合氮源時菌株DH-3 的生長及脫氮特性Fig. 6 Growth and SND performance of strain NR-5 with NH4+-N and NO3--N as mixed nitrogen source

由圖6 可知，菌株DH?3 在SNDM 培養(yǎng)基中于10℃條件下培養(yǎng)28 h 后菌體生長量達(dá)到最大值1.484，之后進入到穩(wěn)定生長期；培養(yǎng)36 h 后菌株進入衰亡期。NH4+?N 在48 h 內(nèi)被完全去除。與NH4+?N 濃度始終下降的趨勢不同，NO3-?N 濃度在最初的24 h 內(nèi)從52.61 mg/L 下降到27.24 mg/L，然后在28 h 略微升高到29.05 mg/L，可能是該菌株在異養(yǎng)硝化過程中積累了少量硝酸鹽所致。NO3-?N 在48 h 內(nèi)的去除率為87.09%，平均去除速率為0.95 mg/（L·h）。TN 在48 h 內(nèi)的去除率為93.45%，沒有檢測到NO2-?N 的積累。表3 的氮平衡分析結(jié)果表明，約有51.2%的初始NH4+?N 和NO3-?N 在同步硝化反硝化作用轉(zhuǎn)化為含氮氣體。上述結(jié)果進一步證實了P.veroniiDH?3 是一株有效的HN?AD 菌，能夠在低溫好氧條件下實現(xiàn)同步硝化反硝化脫氮。

2.5 菌株的功能基因檢測

基因hao、napA、nirS、nirK、cnorB 和nosZ 常被認(rèn)為是參與HN?AD 過程的關(guān)鍵功能酶基因。在本研究中，通過PCR 擴增這些潛在基因，以期深入闡明菌株P(guān).veroniiDH?3 低溫脫氮途徑，結(jié)果如圖7所示。

圖7 菌株DH-3 功能基因的擴增Fig. 7 PCR amplification results of functional genes in strain DH-3

由圖7 可知，該菌株成功擴增出hao、napA、nirS、nirK、cnorB 和nosZ 的基因產(chǎn)物，其對應(yīng)的序列長度分別為365、452、414、642、575 和500 bp。這些功能基因產(chǎn)物的成功擴增表明菌株P(guān).veroniiDH?3 可產(chǎn)生參與HN?AD 過程的關(guān)鍵功能酶，進一步證明該菌株具有硝化反硝化的能力。

3 討論

低溫菌是一種極端微生物，根據(jù)生長溫度特性可分為嗜冷菌（Psychrophilies）和耐冷菌（Psychro?trophs）兩類［28］。其中，耐冷菌的關(guān)鍵特征是能夠在較寬泛的溫度（0-30℃）下有效代謝營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生各種酶類，促進低溫水體中營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與能量流動，維持水體環(huán)境中生物群落的穩(wěn)定和生態(tài)系統(tǒng)平衡，因此在實際推廣應(yīng)用中具有顯著的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益［29］，是目前微生物處理低溫廢水研究的熱點。本研究從東北寒冷地區(qū)冬季河水底泥樣品中分離出一株耐低溫HN?AD 菌P.veroniiDH?3，與Pseudomonassp.中一些具有HN?AD 能力的菌株具有較高的同源性，例如Pseudomonas tolaasiiY?11（KP 410739）［30］和P. putidaY?9（MK 561362.1）［6］。目前國內(nèi)外關(guān)于P.veronii在低溫條件下作為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的研究尚未見報道。

3.1 菌株P(guān). veronii DH?3具有較快的生長速率和良好的異養(yǎng)硝化性能

大多數(shù)中溫HN?AD 菌以NH4+?N 為唯一氮源時生長停滯期較短，例如，在30℃條件下，Exiguo?bacterium mexicanumSND?01［31］能夠快速生長，沒有停滯期，而Ochrobactrum anthropicLJ81［24］的停滯期為4 h。相比之下，菌株P(guān).veroniiDH?3 需要較長的生長停滯期（8 h）以適應(yīng)低溫環(huán)境。然而，在低溫條件下，菌株DH?3 的生長停滯期短于其他耐冷HN?AD 菌，例如Bacillus simplexH?b 在10℃下為24 h［32］，Arthrobacter arilaitensisY?10 在15℃下為12 h［17］。此外，檢測到菌株DH?3 在培養(yǎng)16-20 h時出現(xiàn)最大生長速率0.21/h，高于一些文獻報道的HN?AD 細(xì) 菌， 如Acinetobacter sp. YS2（30℃，0.11/h）［33］和Acinetobactersp. ND7（28℃，0.12/h）［26］。上述結(jié)果表明，P.veroniiDH?3 在10℃條件下具有較短的代際時間和較快的生長速度，這對于低溫含氮廢水的生物處理具有重要意義。

當(dāng)NH4+?N 為唯一氮源時，P.veroniiDH?3 對NH4+?N 的平均去除速率為2.18 mg/（L·h），高于Moraxella osloensisLT?01［1.48 mg/（L·h），10℃］［34］和Arthrobacter arilaitensisY?10［0.4 mg/（L·h），15℃］［17］，甚至比某些中溫菌，如Pseudomonassp.ADN?42［1.38 mg/（L·h），30℃］ 更具優(yōu)勢［35］。Guo 等［36］對P. indoloxydansYY?1 轉(zhuǎn)錄組的分析，初步揭示了HN?AD 細(xì)菌的耐冷機制是由參與TCA循環(huán)、氨基酸代謝和冷休克蛋白相關(guān)的一些關(guān)鍵酶隨著溫度的降低而上調(diào)所引起的，而NH4+?N 為這些關(guān)鍵酶提供了額外的必要能量需求。

3.2 菌株P(guān). veronii DH?3具有良好的好氧反硝化性能

以NO3-?N 為唯一氮源時，菌株P(guān).veroniiDH?3對NO3-?N 平均去除速率為2.13 mg/（L·h），明顯高于P. putidaY?12［1.57 mg/（L·h），15℃］［37］和Rhodococcussp. CPZ24［0.93 mg/（L·h），30℃］［38］。先前的研究表明［39］，反硝化過程中NO3-?N 和NO2-?N 存在相互轉(zhuǎn)化，而本研究的氮轉(zhuǎn)化過程中盡管出現(xiàn)少量的NO2-?N 累積，然而48 h 后被完全去除。推測原因可能是由于NO3-?N 在脫氮過程中被轉(zhuǎn)化的同時，中間產(chǎn)物NO2-?N 也被用作氮源以維持微生物所需的生物合成，從而導(dǎo)致NO2-?N 濃度下降。此外，在脫氮過程中還檢測到微量NH4+?N 存在，這可能是由死亡菌體細(xì)胞發(fā)生裂解而釋放出胞內(nèi)氮所引起的［40］。

菌株P(guān). veroniiDH?3 以NO2-?N 為唯一氮源時，培養(yǎng)48 h 平均去除速率為2.13 mg/（L·h），低于以NO3-?N 為唯一氮源時的平均去除率［1.99 mg/（L·h）］。先前的研究表明，當(dāng)NO2-?N 濃度超過30 mg/L 時會阻礙微生物生長，從而抑制反硝化活性［24,30］，本研究結(jié)果與之相似。然而，該菌株對NO2-?N 的最大瞬時去除速率為4.87 mg/（L·h），仍然高于其他耐冷反硝化細(xì)菌，例如Bacillus simplexH?b［0.18 mg/（L·h），10℃］［32］和Acinetobacter calcoaceticusTY1［2.74 mg/（L·h），8℃］［18］。

3.3 菌株P(guān). veronii DH?3具有良好的同步硝化反硝化性能

菌株P(guān).veroniiDH?3 具有良好的同步硝化反硝化特性。以NH4+?N 和NO3-?N 為混合氮源時，NO3-?N在48 h 內(nèi)的平均去除速率為0.95 mg/（L·h），低于DM?1 培養(yǎng)基中的平均去除率［2.13 mg/（L·h）］。分析上述現(xiàn)象的原因可能是由于NH4+?N 和NO3-?N的共存導(dǎo)致它們之間出現(xiàn)“反饋抑制”，從而影響硝酸鹽的去除［23］。此外，菌株DH?3 在SNDM 培養(yǎng)基中對NO3-?N 的平均去除速率低于NH4+?N，再次證明該菌株優(yōu)先利用NH4+?N 而不是NO3-?N，這個結(jié)果與Acinetobactersp. JR1［31］和Acinetobactersp.C?13［41］特性一致，這可能是由于菌株的羥胺氧化還原酶（HAO）的活性高于硝酸鹽還原酶（NR）。因此可以推斷HN?AD 細(xì)菌對氮源的利用可能與其相應(yīng)的催化酶活性有關(guān)。

3.4 菌株P(guān). veronii DH?3的脫氮途徑

生物脫氮是將氨氮和硝氮轉(zhuǎn)化為含氮氣體的過程，為了研究菌株P(guān).veroniiDH?3 的脫氮途徑，選擇了6 個潛在的硝化反硝化酶及基因進行PCR 擴增。hao是硝化過程中的關(guān)鍵酶基因，它通過編碼羥胺氧化酶（HAO）催化異養(yǎng)硝化的中間產(chǎn)物NH2OH氧化為NO2［42］。從菌株P(guān).veroniiDH?3 中成功擴增得到hao功能基因，表明該菌株具有潛在的異養(yǎng)硝化能力。先前的文獻報道從其他HN?AD 菌中也擴增出了hao基因，如蠟樣芽孢桿菌GS?5（Bacillus cereusGS?5）［43］和不動桿菌ND7（Acinetobactersp.ND7）［26］。napA 基因是在好氧條件下參與硝酸鹽呼吸和反硝化作用的關(guān)鍵酶基因，能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)周質(zhì)硝酸鹽還原酶（NAP）［44］，該酶可以在有氧條件下將NO3-?N 還原為NO2-?N，因此napA 基因常被作為鑒定好氧反硝化菌的典型標(biāo)志［45］。亞硝酸鹽還原酶（NIR）負(fù)責(zé)將NO2-?N 催化轉(zhuǎn)化為NO［46］，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和輔因子分為兩類：以血紅素為輔因子的同二聚體細(xì)胞色素cd1 型亞硝酸鹽還原酶（cd1?NIR）和以Cu 為輔因子的銅型亞硝酸還原酶（Cu?NIR），這兩種酶分別有由nirS 和nirK 基因編碼［47］。先前研究普遍認(rèn)為nirS 和nirK 基因不能在同一微生物細(xì)胞中共存［43］。然而，本研究從菌株P(guān).veroniiDH?3 中擴增出了nirS 基因和nirK 基因，表明這兩種基因同時存在于菌株DH?3 中，以實現(xiàn)亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化。同樣在Ochrobactrum anthropicLJ81［25］中也觀察到了兩種功能基因共存的現(xiàn)象。此外，nirS 和nirK 的共存也表明在NO3-?N 去除過程中，NO2-?N 的積累可能較少，這與之前的脫氮實驗中未檢測出NO2-?N 的結(jié)果一致。從菌株P(guān).veroniiDH?3 中還成功擴增出了表達(dá)一氧化氮還原酶（NOR）的cnorB 基因和表達(dá)一氧化二氮還原酶（NOS）的nosZ 基因，這兩種關(guān)鍵酶分別負(fù)責(zé)將NO 轉(zhuǎn)化為N2O 以及將N2O 轉(zhuǎn)化為N2。cnorB 基因和nosZ 基因的成功擴增表明該菌株更有可能在不產(chǎn)生N2O 的情況下實現(xiàn)完全脫氮［35］。

基于HN?AD 性能研究、氮平衡分析和關(guān)鍵酶功能基因擴增結(jié)果推測菌株P(guān).veroniiDH?3 的脫氮途徑如圖8 所示。

圖8 菌株DH-3 的氮代謝途徑Fig. 8 Proposed nitrogen metabolism pathway of strain DH-3

根據(jù)先前的研究報道，HN?AD 菌株的脫氮主要包括以下兩種代謝途徑［31］：

在本研究中，菌株P(guān).veroniiDH?3 在低溫條件下的脫氮過程遵循代謝途徑I，這與大多數(shù)其他HN?AD 細(xì)菌的代謝途徑基本一致，如Microbacteriumsp. SFA13［8］、Acinetobacter sp. HA2［48］和Halomonassp. H36［49］。菌株DH?3 可以利用無機氮化合物（如銨、亞硝酸鹽和硝酸鹽）作為唯一或混合氮源，通過同化作用將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生物氮，以及通過HN?AD 作用將其轉(zhuǎn)化成含氮氣體。該菌株異養(yǎng)硝化過程的第一步是利用檸檬酸鈉作為碳源和電子供體，將NH4+?N 氧化為NH2OH，然后由HAO 進一步氧化為NO2-?N。在好氧反硝化過程中，NAP 可以將NO3-?N 還原為NO2-?N。隨后，通過功能酶NIR、NOR 和NOS 依次將NO2-?N 轉(zhuǎn)化為NO、N2O 和N2。具有這種代謝途徑的HN?AD 細(xì)菌可以轉(zhuǎn)化多種形式的氮，如NH4+?N、NO2-?N 和NO3-?N，使這類細(xì)菌在環(huán)境中具有廣泛的生態(tài)位和良好的環(huán)境適應(yīng)性，從而表現(xiàn)出對廢水中各種氮底物的出色代謝能力［50］。與途徑I 中的細(xì)菌相比，途徑II 中的細(xì)菌只代謝NH4+?N，這阻礙了它們在實際污水處理中的應(yīng)用［51］。因此，在低溫和好氧條件下，良好的氮去除效能和較低的中間產(chǎn)物積累表明菌株P(guān).veroniiDH?3 是一種在凈化含氮廢水方面具有應(yīng)用前景的脫氮菌劑。

4 結(jié)論

從河水底中分離篩選得到一株耐低溫假單胞菌Pseudomonas veroniiDH?3。10℃條件下，該菌培養(yǎng)48 h 后對NH4+?N、NO2-?N 和NO3-?N 的去除率分別為99.07%、96.88%和90.30%，并且脫氮過程中沒有檢測到明顯的NO2-?N 積累。以NH4+?N 和NO3-?N為混合氮源時，48 h 后NH4+?N 被完全去除，而NO3-?N 的去除率為87.09%。該菌展現(xiàn)出良好的氮去除性能，推測其脫氮途徑為硝化、反硝化作用和同化作用。