漆酶BmLac 的異源表達(dá)、酶學(xué)特性及棉酚降解的研究

魏婷柳 苗華彪，2 吳倩，2 黃遵錫，2

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2. 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，昆明 650500）

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，我國飼料原料極其緊缺。我國是棉花生產(chǎn)大國，每年都會有棉花副產(chǎn)品產(chǎn)生，如棉籽粕、棉籽殼［1］。棉籽粕粗蛋白含量34%-40%，優(yōu)質(zhì)蛋白含量約22.5%［2］，可作為植物性蛋白原料［3］，部分緩解飼料原料緊缺的現(xiàn)狀，但棉籽粕中含有游離棉酚（free gossypol）抗?fàn)I養(yǎng)因子，限制了其在飼料工業(yè)上的應(yīng)用［4］。游離棉酚會引起人體、動物組織和器官高度中毒［5］，導(dǎo)致生殖功能障礙［6］，肝功能受損，呼吸窘迫［7-10］。目前降解棉籽粕中游離棉酚的方法有物理法、化學(xué)法、微生物發(fā)酵法、酶解法［11］，前兩種方法會影響棉籽粕的風(fēng)味，脫毒效率低［12］，微生物發(fā)酵法是目前最佳脫除棉籽粕中游離棉酚的方法［4］，但是此法操作復(fù)雜，對所用菌株類型及其用量要求嚴(yán)格。酶解法相比于其他方法是安全、綠色的方法。

漆酶（laccas，EC 1.10.3.2）屬于多銅氧化酶（MCOs）家族，MCOs 是一類在自然界中廣泛分布，氧化多種底物時以氧為電子受體將O2還原為H2O 的一類含銅的蛋白質(zhì)［13］。漆酶由3 個銅氧還蛋白結(jié)構(gòu)域（D1-D3）組成，其活性中心是4 個銅離子，I 型銅有共價銅-半胱氨酸鍵，是底物氧化的部位；II型銅有2 個組氨酸殘基配體，在電子順磁共振（EPR）下有一個特征信號；Ш 型銅是一個具有抗偶磁性并有6 個組氨酸殘基配體的雙核銅中心，與II 型銅形成三核中心成為氧的還原部位［14-17］。

漆酶在高等植物、昆蟲、細(xì)菌和真菌中均能產(chǎn)生［18］。目前細(xì)菌和真菌來源的漆酶研究較多，真菌漆酶雖然是被用于工業(yè)生產(chǎn)最多的漆酶，但其產(chǎn)酶量低、發(fā)酵周期長、高溫下穩(wěn)定性差［19-21］。細(xì)菌漆酶能在較寬的溫度和pH 下作用，高溫下穩(wěn)定性良好，對抑制劑有一定的穩(wěn)定性［22-23］。在Azospirillum lipoferum中較早發(fā)現(xiàn)原核漆酶［24］，隨后從Pseud?omonassp.［25］、Escherichia coli［26］和B.subtilis［27］中相繼發(fā)現(xiàn)漆酶。枯草芽孢桿菌的芽孢外殼蛋白CotA是細(xì)菌漆酶的典型代表，目前已報道產(chǎn)生漆酶的芽孢桿菌有B.clausii［28］、B.amyloliquefaciens［29］、B.licheniformis［30］、B.pumilus［31］和B. thuringiensis［32］。Wang 等［33］首次發(fā)現(xiàn)漆酶能催化棉酚的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，將棉酚的醛基和羥基氧化為半醌自由基，并產(chǎn)生釋放的羥基自由基。本文通過菌株篩選，獲得一株B.amyloliquefaciensXP?13并從中挖掘漆酶基因，并在畢赤酵母中異源表達(dá)獲得BmLac 蛋白，測定其酶學(xué)性質(zhì)及對棉酚的降解效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 解淀粉芽孢桿菌、大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115、pPic9k 由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 ABTS（羅恩公司），棉酚（上海源葉），細(xì)菌基因組提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega 公司，pMD?18?T、rTap 酶、EcoR I、NotI、SalI 均購自TaKaRa 公司，其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%NaCl、2%瓊脂、0.25 mmol/L CuSO4。

Amp?LB：0.5%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、1%NaCl、2%瓊脂、終濃度100 μg/mL 的Amp。

YEPD：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基BMGY、BMMY 根據(jù)畢赤酵母操作手冊配制（由Invitrogen 公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 土樣采集于普洱市思茅區(qū)茶山，稱取1 g 土樣于含0.25 mmol/L CuSO4的LB 培養(yǎng)基中37℃，180 r/min 培養(yǎng)12-24 h，稀釋倍數(shù)涂布于含0.25mmol/L CuSO4的LB 固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5 d，在菌落周圍滴加1 mmol/L ABTS，菌落周圍出現(xiàn)綠色，表示有漆酶活性。將顯色菌落進(jìn)行多次平板劃線純化，進(jìn)行鑒定。

1.2.2 菌株鑒定 XP?13 菌株基因組用細(xì)菌基因組試劑盒提取，以基因組為模板，27F、1492R 為引物，PCR 程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃90 s；72℃ 10 min，30 個循環(huán)進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增，膠回收純化，與pMD?18?T 載體連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR 陽性克隆驗證。測序結(jié)果16S rDNA 序列在NCBI 進(jìn)行BLAST 同源比對，用MEGA?X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用光學(xué)顯微鏡觀察XP?13 的芽孢。

1.2.3 漆酶BmLac 的分析、克隆與表達(dá)

1.2.3.1 漆酶BmLac 的分析 將BmLac基因序列在NCBI 進(jìn)行BLASTX 分析，用ExPASY 進(jìn)行BmLac 的PI/MW 以及帶正負(fù)電荷總數(shù)預(yù)測，用Pfam 進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測，PSIPRED 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，SWISS?MODEL 進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.3.2 漆酶BmLac 的克隆與表達(dá) 根據(jù)pPic9k 序列設(shè)計BmLac 上下游引物，引物序列如下：

F：5'?GCTGAAGCTTACGTAGAATTCATGGCAC TAGAAAAATTTGCAG?3'；

R：5'?AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCCTGCT TATCCGTGACGTCCA?3'。

以XP?13 菌株基因組為模板，以F、R 為上下游引物，以PCR 程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s；60℃1 min；72℃ 90 s；72℃ 10 min，30 個循環(huán)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，將pPic9k 用EcoR I、NotI 雙酶切，膠回收純化，回收產(chǎn)物用Exnase II 重組酶連接，獲得重組質(zhì)粒pPic9k?BmLac。用SalI 酶線性化pPic9k?BmLac 質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115 中，稀釋涂布在含G418 抗生素的YEPD 平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

挑取陽性克隆于BMGY 培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，離心10 min，加入BMMY 培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，離心10 min，取上清液以ABTS 為底物測酶活，進(jìn)行SDS?PAGE：煮沸失活的酶液進(jìn)行SDS?PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色；具有活性的酶液進(jìn)行SDS?PAGE 后用0.5 mmol/L ABTS 進(jìn)行染色，目的條帶顯示綠色。

1.2.4 漆酶酶活測定 酶活測定［34］：50 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2.83 mL，50 mmol/L ABTS 120 μL，酶液50 μL，反應(yīng)10 min，冰浴1 min 終止反應(yīng)，分光光度計420 nm 讀值，對照組調(diào)零。

酶活定義（U）：在特定條件下，在1 min 內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol 底物所需的酶量。酶活計算公式：U/mL=（A×V0×106）/（V1×ε×d×T），其中A 是吸光度值，V0是反應(yīng)總體系（mL），V1酶液體積（mL），ε 消光系數(shù)（εABTS=36 000 L/(cm·mol·L)，d 比色皿直徑（cm），T 反應(yīng)時間（min）。

1.2.5 漆酶酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.2.5.1 漆酶最適pH 及pH 穩(wěn)定性測定 最適pH測定：將酶液于37℃、pH 2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 的檸檬酸-磷酸氫二鈉50 mmol/L 緩沖液反應(yīng)10 min，分光光度計測吸光度，以最高酶活為100%。

pH 穩(wěn)定性測定：將酶液與pH 2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液混勻在37℃下孵育1 h，在pH 4，55℃反應(yīng)10 min，分光光度計測吸光度，以未處理酶液酶活為100%。

1.2.5.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性測定 最適溫度測定：酶液在最適pH、溫度10、20、30、40、50、55、60、65、70、80、90℃下反應(yīng)10 min，分光光度計測吸光度，以最高酶活為100%。

溫度穩(wěn)定性測定：酶液在70℃、80℃、90℃下分別耐受0、10、20、30、40、50、60 min，在pH 4，55℃反應(yīng)10 min，分光光度計測吸光度，以0 min酶液酶活為100%。

1.2.5.3 金屬離子及有機(jī)試劑對酶活性的影響 酶液反應(yīng)體系中分別加入終濃度1 mmol/L、10 mmol/L的NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、ZnSO4、CoCl2、CuSO4、MgSO4、MnSO4、Pb(CH3CO2)2、FeSO4、NiSO4、FeCl3、AlCl3金屬離子和有機(jī)試劑溶液Guanidine Hydrochloride、Urea、EDTA，在pH 4，55℃反應(yīng)10 min，分光光度計測吸光度，以不加金屬離子或有機(jī)試劑酶液酶活為100%。

1.2.5.4 漆酶動力學(xué)參數(shù)測定 配制不同濃度的ABTS，濃度分別是1、3、5、7、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50 mmol/L，在pH 4，55℃反應(yīng)10 min，分光光度計測吸光度，計算酶活。

1.2.6 漆酶對棉酚的降解效果 總反應(yīng)體系1 mL 中含：50 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、終濃度0.05 mg/mL 的棉酚、酶液（或終濃度1.25 mmol/L ABTS）。在反應(yīng)體系中不加介體ABTS，在55℃下分別反應(yīng)0 h、1 h、2 h；在反應(yīng)體系中加入終濃度1.25mmol/L 的介體ABTS，在55℃下分別反應(yīng)0 h、1 h、2 h；均以0 h 為對照。反應(yīng)結(jié)束后過濾膜，通過高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行定性定量分析。HPLC 條件［35］：色譜柱型號：LCMS?2020（C18，4.6 nm×250 nm，5 μm），流動相是乙腈∶0.2%磷酸=85∶15，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，紫外檢測波長235 nm，柱溫25℃。

2 結(jié)果

2.1 XP?13菌株鑒定

PCR 產(chǎn)物片段大小是1 500 bp 左右（圖1?A），在100 倍物鏡下觀察到大小均勻，呈圓柱形的芽孢（圖1?B），XP?13 菌株的16S rDNA 測序結(jié)果通過NCBI 比對并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1?C），XP?13 菌株與B.amyloliquefaciens是在同一分支，并且與B.amyloliquefaciens stiandB15 的同源性是99.93%，由此初步將該菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 XP-13 菌株鑒定Fig. 1 Identification of XP-13 strain

2.2 漆酶BmLac的分析、克隆與表達(dá)

2.2.1 漆酶BmLac 的分析 通過NCBI blastx 比對顯示，BmLac 與來源于解淀粉芽桿菌的多銅氧化酶家族的 WP_031378818.1 具有100%同源性；與Lysinibacillus fusiformis的漆酶AYW03784.1 的同源性是77.25%，與報道過具有降解棉酚效果的漆酶WP_161541154.1 同源性是19%。經(jīng)ExPASY 預(yù)測了BmLac 的PI/MW 是6.34/58.07 kD，帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)是63 個，帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)是56 個。通過Pfam 結(jié)構(gòu)域分析BmLac 具有1 個Cu oxidase、1 個Cu?oxidase_2 和2個Cu?oxidase_3 結(jié)構(gòu)域（圖2?A），PSIPRED 預(yù)測二級結(jié)構(gòu)有α-helix（4.10%）、β-sheet（31.45%）、Coli（64.45%），說明該酶具有以β-sheet 為主，α-helix 為輔的二級結(jié)構(gòu)。通過SWISS?MODEL 預(yù)測BmLac 的三維結(jié)構(gòu)（圖2?B）。

圖2 漆酶BmLac 的分析Fig. 2 Analysis of laccase BmLac

2.2.2 漆酶BmLac的克隆與表達(dá)BmLac基因全長是1 536 bp，編碼512 個氨基酸，PCR 產(chǎn)物驗證條帶大小正確（圖3?A），與pMD?18?T 載體連接測序結(jié)果正確。pPic9k 雙酶切結(jié)果如圖3?B 所示。把重組質(zhì)粒pPic9k?BmLac 轉(zhuǎn)入到畢赤酵母GS115，進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)，取上清發(fā)酵液進(jìn)行SDS?PAGE 電泳驗證。結(jié)果表明蛋白條帶大小在58 kD 左右，與理論分子量一致（圖4，泳道1），經(jīng)ABTS 染色顯示只有一條單一的目的條帶，大小與理論分子量一致（圖4，2 泳道）。

圖3 BmLac 和pPic9k 凝膠電泳圖Fig. 3 BmLac and pPic9k gel electrophoresis

圖4 BmLac 的SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE of BmLac

2.3 漆酶BmLac酶學(xué)特性分析

2.3.1 最適pH 及pH 穩(wěn)定性 對漆酶BmLac 進(jìn)行最適pH 測定，結(jié)果表明在pH 4 時漆酶BmLac 的酶活達(dá)到最高（圖5?A）；酶液分別在37℃，pH 2.5-7保持60 min 后測定酶活，結(jié)果表明pH 2.5-3 相對酶活在50%以上，pH 3.5-7 之間相對酶活在90%以上（圖5?B），說明該酶作用的pH 范圍較廣。

圖5 BmLac 最適pH 及pH 穩(wěn)定性Fig. 5 Optimal pH and pH stability of the BmLac

2.3.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 在最適pH 4 測定不同溫度下漆酶BmLac 的酶活，結(jié)果表明在40-65℃之間的相對酶活在70%以上，在55℃時酶活達(dá)到最高（圖6?A）。在pH 4，55℃條件測定的酶活是101.56 U/mL。漆酶BmLac 分別在70、80、90℃下保持60 min 后，在55℃，pH 4 下測定酶活，結(jié)果表明其相對酶活均在70%以上，未到達(dá)半衰期（圖6?B），說明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 BmLac 最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig. 6 Optimal temperature and temperature stability of the BmLac

2.3.3 金屬離子及有機(jī)試劑的影響 漆酶BmLac 在金屬離子及有機(jī)試劑的存在下測定酶活，結(jié)果表明加入終濃度1 mmol/L Cu2+后酶活提高了1.93 倍，1mmol/L 的Mn2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、K+、Na+、Ca2+等對酶活的影響不明顯，而Fe2+幾乎完全抑制；10 mmol/L 的Cu2+、Mn2+、Mg2+對酶活影響不明顯，Pb2+、Ni2+、K+、Na+、Ca2+、Li+起到部分抑制作用，F(xiàn)e3+、Al3+、Fe2+完全抑制酶活。1 mmol/L的Guanidine Hydrochloride、Urea 的相對酶活均保持在92%以上，10 mmol/L 的Guanidine Hydrochloride、EDTA 對酶活有部分抑制作用；10 mmol/L 的Urea 對酶活沒有影響（表1）。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對BmLac 的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on BmLac

2.3.4 動力學(xué)曲線 以不同濃度1-5 mmol/L 的ABTS 為底物，在pH 4、55℃下測定酶活，利用GraphPad Prism 5.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行非線性曲線擬合，如圖7 所示，曲線計算得Vmax=（126.7±1.829）μmol/(min·mL)、Km=（0.451 9±0.034 9）mmol/L。

圖7 BmLac 的動力學(xué)曲線Fig. 7 Enzyme kinetic curves of BmLac

2.4 漆酶BmLac對棉酚的降解

結(jié)果表明，不加介體反應(yīng)1 h 后的棉酚降解率為84.07%，反應(yīng)2 h 后的棉酚降解率為94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反應(yīng)1 h 后棉酚降解率為95.68%，反應(yīng)2 h 后棉酚降解率達(dá)到98.73%（圖8）。該酶在無ABTS 存在時對棉酚降解的比較慢，而加入1.25mmol/L ABTS，反應(yīng)1 h 后降解率比不加時提高了11.61%。

圖8 BmLac 降解棉酚的HPLC 分析Fig. 8 HPLC analysis of BmLac degrading gossypol

3 討論

棉籽粕不經(jīng)處理飼喂動物，長時間積累會導(dǎo)致中毒，通過食物鏈傳遞直接或間接危害人類健康［36］。降低棉籽粕中游離棉酚的含量是提高棉籽粕利用率的重要途徑。Wang 等［33］以小鼠體重的100 mg/kg棉酚和漆酶催化棉酚后的環(huán)化產(chǎn)物飼喂小鼠，結(jié)果表明經(jīng)過漆酶催化的棉酚能降低棉酚對肝臟、生殖器官的毒性。王雨辰等［37］驗證了棉酚在漆酶BA4、終濃度1 mmol/L ABTS 存在下，30℃和40℃分別反應(yīng)1 h 后，棉酚的降解率均是30%。本文通過用漆酶BmLac 降解棉酚，不加介體反應(yīng)1 h 后降解率是84.07%，反應(yīng)2 h 后降解率是94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反應(yīng)1 h 后降解率是95.68%，反應(yīng)2 h后降解率達(dá)到98.73%，但沒有證明BmLac 蛋白對棉酚是否發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化作用及催化產(chǎn)物種類分析。

近年對漆酶的研究越來越多，獲得了來源廣泛的漆酶基因，但是基于漆酶自身的局限性，還未獲得滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的漆酶。解淀粉芽孢桿菌漆酶是芽孢外壁CotA 蛋白，有良好的熱穩(wěn)定性［38］，適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，如B. amyloliquefaciensTCCC 111018 漆酶在80℃中孵育120 min 后留有酶活［30］；B. amyloliquefaciensA1 在80℃孵育10 min，相對酶活剩余79%［39］。真菌漆酶的熱穩(wěn)定性相比于其是較差的，如Ganoderma lucidumTR6 中通過RT?PCR獲得漆酶基因的cDNA，在最適溫度60℃下孵育1 h，酶活幾乎完全喪失［40］；Botrytis cinerea241 的Bcl1 漆酶在60℃孵育1 h 達(dá)到了半衰期，相對酶活剩余50%［41］。此外，其他細(xì)菌漆酶的熱穩(wěn)定性也比真菌漆酶好，如Li 等［42］從短小芽孢桿菌中獲得漆酶rLAC，在最適溫度80℃孵育1 h 后相對酶活剩余40%左右。Zhang 等［43］從宏基因組中得到漆酶Lacz1 蛋白，最適pH 4.5，最適溫度75℃，在85℃下孵育60 min，相對酶活剩余20%。漆酶BmLac 最適pH 4，最適溫度55℃，80℃下孵育1 h 后相對酶活剩余80%，在90℃下孵育1 h，相對酶活剩余70%，均未到達(dá)半衰期。該酶的最適溫度比其他漆酶低，但其耐熱性較好，具備用于工業(yè)生產(chǎn)的潛能。

金屬離子、有機(jī)試劑對漆酶的影響也非常重要，BmLac 添加1 mmol/L CuSO4相對酶活提高了93%，添加1 mmol/L FeSO4卻幾乎完全抑制酶活。研究表明Cu2+對漆酶有激活作用，Zhang 等［43］在乙酸鈉緩沖液中添加10 mmol/L 的CuSO4，酶活從0.10 U/mg提高至16.39 U/mg；Lin 等［44］在10 mg/L Cu2+下酶活提高15%，這可能是由于II 型銅的銅離子結(jié)合位點(diǎn)被Cu2+占據(jù)［45］。其他金屬離子低濃度下對BmLac的影響不是很大，除了Fe2+幾乎完全抑制酶活。

本研究從B.amyloliquefaciensXP?13 獲取漆酶基因，進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測定及其對棉酚的降解效果。為后期降解棉籽粕中游離棉酚奠定基礎(chǔ)，讓棉籽粕成為植物性蛋白飼料原料成為可能，同時也能緩解飼料原料緊缺的現(xiàn)狀。后續(xù)研究可通過對BmLac 漆酶進(jìn)行分子改造，如蛋白質(zhì)工程、酶分子修飾等，進(jìn)而提高酶活、穩(wěn)定性及游離棉酚降解效率，旨在獲得一種適合于工業(yè)生產(chǎn)的漆酶。

4 結(jié)論

本研究從土壤中篩選得到一株產(chǎn)漆酶菌株B.amyloliquefaciensXP?13，從中獲得漆酶基因BmLac在畢赤酵母GS115 中異源表達(dá)獲得漆酶BmLac 蛋白，最高酶活為101.56 U/mL，最適反應(yīng)條件為55℃，pH 4，具有較好的熱穩(wěn)定性，對棉酚降解效果好，不加介體反應(yīng)1 h 后棉酚降解率為84.07%，反應(yīng)2 h后棉酚降解率為94.57%；加1.25 mmol/L ABTS 反應(yīng)1 h 后棉酚降解率為95.68%，反應(yīng)2 h 后棉酚降解率達(dá)到98.73%，具有成為漆酶酶制劑規(guī)?；a(chǎn)及用于棉籽粕中游離棉酚降解的潛力。