醋酸棉酚旋光異構(gòu)體的制備及其含量測定研究

周夢宇，古麗斯坦·阿不來提，李 洋，姚 軍

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

關(guān)健詞：醋酸棉酚；衍生化反應(yīng)；旋光異構(gòu)體：分離制備

棉籽為錦葵科棉屬植物草棉(GossypiumherbaceumL.)、樹棉(G.arboreumL.)及陸地棉(G.hirsutumL.)的種子，主要化學(xué)成分為亞油酸、棕櫚酸、油酸、甾醇和棉酚等[1]。棉酚是1種倍半萜二聚體，化學(xué)結(jié)構(gòu)為2個C-C單鍵連接的萘環(huán)[2]，其中親脂性部位的甲基與親水性部位的羥基取代作用，構(gòu)成的空間位阻會阻礙聯(lián)萘環(huán)轉(zhuǎn)動，使棉酚具有旋光性，包括左旋棉酚[(-)-棉酚]和右旋棉酚[(+)-棉酚][3-4]。研究表明，棉酚具有抗腫瘤[5-6]、抗生育[7-8]等生物活性，當(dāng)人體攝入大量棉酚時，會對心臟、腎臟、肝臟、卵巢等器官造成損傷[9-12]，且(-)-棉酚和(+)-棉酚的生物活性[13-15]和毒性作用也具有一定差異[16-17]。為提高棉酚類藥物的治療效果，降低其毒副作用，本研究采用丙酮-苯胺法從棉籽中制得苯胺棉酚，經(jīng)乙醚溶解后在稀硫酸作用下轉(zhuǎn)化，使棉酚游離出來并與冰醋酸結(jié)合的方法制備醋酸棉酚，再與手性衍生化試劑進行衍生化反應(yīng)，得到醋酸棉酚旋光異構(gòu)體衍生物，該衍生物經(jīng)硅膠柱色譜常壓分離為(-)-醋酸棉酚衍生物和(+)-醋酸棉酚衍生物，經(jīng)鹽酸水解反應(yīng)可分別得到(-)-醋酸棉酚和(+)-醋酸棉酚2個單體，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器Agilent 1220 LC型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，MS3BS25型渦旋振蕩器(德國IKA公司)，TDL-5A型低速離心機(常州金壇良友儀器有限公司)，OSB-2100型水浴鍋(上海安亭科學(xué)儀器廠)，XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(美國安捷倫公司)，GL-525-A型磁力攪拌器(上海五相儀器儀表有限公司)。

1.2 材料與試劑棉籽2016年10月購買于阿拉爾市，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定為錦葵科陸地棉(G.hirsutumL.)的干燥成熟種子，醋酸棉酚對照品(陜西慈緣生物科技有限公司，批號20180823)，D-(-)蘇-1-對硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇(上海晶純生化科技股份有限公司，批號S161025)，硅膠(北京索萊寶生物科技有限公司，批號20180907，160-200目)，無水硫酸鈉(天津博迪化工股份有限公司，批號20150901)，磷酸二氫鉀(天津市富晨化學(xué)試劑廠，批號20140707)，碳酸氫鈉(上海虹光化工廠，批號20102731)，色譜乙腈(美國Fisher Scientific公司)，丙酮、苯胺、乙醚、硫酸、冰醋酸、無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)，石油醚(沸程30～60℃)、磷酸、四氫呋喃、環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲醇(天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司)，試劑均為分析純。

1.3 醋酸棉酚的制備方法稱取棉籽250 g置于具塞錐形瓶中，按料液比1∶2加入80%丙酮溶液，浸漬24 h后過濾，濾液中加入2.5 mL苯胺，室溫下避光放置過夜，濾出晶體常溫放置干燥；重復(fù)上述方法數(shù)次，即得苯胺棉酚10.29 g。將制備的苯胺棉酚置于燒杯中，依次加入乙醚300 mL、硫酸乙醇(摩爾比1∶1)溶液20 mL，在10℃下攪拌至溶解后置于分液漏斗中，乙醚層用600 mL超純水洗滌至弱酸性，再加入適量無水硫酸鈉干燥30 min，過濾，在濾液中加入15 mL冰醋酸，避光放置6 h后有黃色沉淀產(chǎn)生，濾出沉淀并置于避光處風(fēng)干；在濾液中依次加入10%冰醋酸乙醚溶液20 mL、石油醚5 mL，按上述方法放置和抽濾，干燥后合并黃色沉淀，制得醋酸棉酚。

1.4 自制醋酸棉酚含量測定方法稱取醋酸棉酚對照品10.50 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加入冰醋酸0.5 mL，用95%乙醇溶液定容至刻度，得濃度為1.05 mg/mL的醋酸棉酚對照品溶液。分別吸取對照品溶液適量，用95%乙醇溶液配置成濃度分別為2.15、5.38、13.44、33.60、84.00、210.00 μg/mL的醋酸棉酚溶液。色譜條件：色譜柱為XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為10 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH 3.0)-乙腈(27∶73)，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長247 nm。以對照品溶液濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為Y=832 687X+316 630，r=0.999 4，醋酸棉酚對照品在2.15～210.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。稱取“1.3”項下醋酸棉酚10.91 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度，即得醋酸棉酚樣品溶液，按上述方法測定并計算自制醋酸棉酚含量。

1.5 醋酸棉酚衍生化實驗分別稱取“1.3”項下醋酸棉酚1.21 g、D-(-)蘇-1-對硝基苯基-2-氨基-1，3-丙二醇1.25 g置于250 mL錐形瓶中，加入四氫呋喃50 mL，在75℃條件下水浴回流30 min，室溫冷卻后得到醋酸棉酚旋光異構(gòu)體衍生物溶液。吸取該溶液5 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按“1.4”項下色譜條件測定醋酸棉酚衍生化物反應(yīng)情況，剩余溶液揮干溶劑，得到醋酸棉酚旋光異構(gòu)體衍生物。

1.6 醋酸棉酚旋光異構(gòu)體衍生物的硅膠柱色譜分離方法稱取100 g硅膠，以環(huán)己烷為裝柱溶液，濕法裝柱，飽和12 h后上樣。稱取“1.5”項下醋酸棉酚旋光異構(gòu)體衍生物2.43 g和硅膠2.53 g，加入少量環(huán)己烷溶解后旋蒸至干燥，平鋪在硅膠柱頂端，干法上樣。(+)-醋酸棉酚衍生物洗脫條件為乙酸乙酯∶環(huán)己烷=3∶2，(-)-醋酸棉酚衍生物洗脫條件為乙酸乙酯∶環(huán)己烷∶甲醇=8∶1∶1。取各洗脫液5 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按“1.4”項下色譜條件檢測硅膠柱色譜分離各衍生物情況，剩余洗脫液濃縮后干燥，分別得到(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物。

1.7 (+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的制備方法稱取“1.6”項下(+)-醋酸棉酚衍生物1.98 g，置于250 mL錐形瓶中，依次加入乙醚140 mL、冰醋酸10 mL、濃鹽酸8 mL，45℃水浴回流4 h，1 000 r/min磁力攪拌均勻。用超純水、1%碳酸氫鈉溶液將反應(yīng)液洗滌至中性，加入無水硫酸鈉干燥1 h后，濾出固體并用乙醚洗滌至無色，合并乙醚洗液和濾液，濃縮，加入5 mL石油醚，避光放置過夜，有淺黃色沉淀析出，經(jīng)抽濾得到(+)-醋酸棉酚。稱取(-)-醋酸棉酚衍生物2.05 g，按上述流程操作，即得(-)-醋酸棉酚。

1.8 (+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的含量測定方法分別稱取“1.7”項下(+)-醋酸棉酚5.11 mg、(-)-醋酸棉酚5.18 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度，即得樣品溶液，按“1.4”項下方法測定(+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的含量。

2 結(jié)果

2.1 自制醋酸棉酚含量測定結(jié)果自制醋酸棉酚樣品濃度為46.98 μg/mL，根據(jù)樣品稱樣量和稀釋倍數(shù)計算，自制醋酸棉酚含量為93.3%，見圖1。

(A：醋酸棉酚對照品，B：自制醋酸棉酚)

2.2 醋酸棉酚衍生化實驗結(jié)果醋酸棉酚經(jīng)衍生化反應(yīng)生成了(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物，(+)-醋酸棉酚衍生物的保留時間為7.5 min，(-)-醋酸棉酚衍生物保留時間為10.5 min，在該色譜條件下(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物的分離度良好，見圖2。

[1：(+)-醋酸棉酚衍生物，2：(-)-醋酸棉酚衍生物]

2.3 硅膠柱色譜分離結(jié)果在該色譜條件下，(+)-醋酸棉酚衍生物和(-)-醋酸棉酚衍生物的分離效果良好,見圖3、4。

圖3 (+)-醋酸棉酚衍生物HPLC圖

圖4 (-)-醋酸棉酚衍生物HPLC圖

2.4 (+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚含量測定結(jié)果由標準曲線法計算，(+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚樣品的濃度分別為44.27、45.23 μg/mL，根據(jù)(+)-醋酸棉酚、(-)-醋酸棉酚的稱樣品和稀釋倍數(shù)，計算(+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚樣品的含量分別為90.8%、91.5%，見圖5。

[A：(+)-醋酸棉酚，B：(-)-醋酸棉酚；C：醋酸棉酚對照品]

3 討論

目前棉酚旋光異構(gòu)體的分離方法主要為色譜法，包括直接法和間接法，直接法通過手性固定性的色譜柱進行HPLC分離，但其成本較高，使用范圍具有一定的局限性，故本實驗使用的間接法，由手性衍生化試劑進行衍生化反應(yīng)，適合大批量的樣品制備和工業(yè)生產(chǎn)。本研究采用硅膠柱色譜分離醋酸棉酚旋光異構(gòu)體衍生物時，參照文獻[18]選擇環(huán)己烷和乙酸乙酯作為洗脫溶液，洗脫條件為：乙酸乙酯∶環(huán)己烷=3∶2、乙酸乙酯∶環(huán)己烷=4∶1；但在實際分離過程中，乙酸乙酯∶環(huán)己烷=3∶2的洗脫條件能較好的分離(+)-醋酸棉酚衍生物，而乙酸乙酯∶環(huán)己烷=4∶1的洗脫條件未能將(-)-醋酸棉酚衍生物洗脫，通過后續(xù)對洗脫條件的調(diào)整，確定洗脫條件為乙酸乙酯∶環(huán)己烷∶甲醇=8∶1∶1，在此條件下醋酸棉酚旋光異構(gòu)體衍生物分離效果良好。本實驗方法簡便、可靠，適用于(+)-醋酸棉酚和(-)-醋酸棉酚單體的制備分離和含量測定，為后期對棉酚的研究提供了理論基礎(chǔ)。