石珊瑚共附生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗炎活性及化學(xué)多樣性研究

廖清楠 周龍建，2，3 楊志友，2，3 馮昀鎧 黃誼君 胡雪瓊，3張翼，2，3 劉亞月，2，3

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東海洋大學(xué)深圳研究院海洋醫(yī)藥研發(fā)中心 湛江市腦健康海洋藥物與營養(yǎng)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江），湛江 524006；3. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 大連工業(yè)大學(xué)，大連 116034）

炎癥是臨床常見的一個(gè)病理過程，是機(jī)體組織受到刺激或損傷后所產(chǎn)生的一種防御性應(yīng)答反應(yīng)，主要以紅、腫、熱、痛甚至組織器官功能喪失為癥狀［1-2］。炎癥是一把雙刃劍，適度的炎癥反應(yīng)對人體是有益的；但過度、失控的炎癥反應(yīng)則會導(dǎo)致組織的病變和二次損傷，是許多疾病的發(fā)病基礎(chǔ)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，在系統(tǒng)性血管炎、腸道克羅恩病等一些自身免疫性疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)病變的疾病中，炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，白細(xì)胞介素?1、白細(xì)胞介素?6、PGE2 等炎性相關(guān)因子的表達(dá)都有所上升，進(jìn)而傷害到人體內(nèi)部細(xì)胞，并對人體產(chǎn)生危害。目前，這些疾病正在全球范圍蔓延，并且已演變成嚴(yán)重危害人類健康和社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要公共衛(wèi)生問題，越來越受到各國政府和社會的高度重視。因此，開發(fā)治療炎癥的有效藥物對多種疾病的治療具有重要的意義。

珊瑚，隸屬于腔腸動物門中的珊瑚蟲綱，是一種常見的海洋低等無脊椎動物。作為珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛分布于我國海南、西沙群島及南沙群島等熱帶海岸地區(qū)。珊瑚表面和組織內(nèi)部聚集著豐富的微生物資源［3］，這些微生物與珊瑚宿主在長期的共同進(jìn)化過程中，通過合成如抗菌、抗腫瘤、抗病毒和抗污損等［4-5］具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，共同抵御外敵入侵和病害防御，一直是藥物先導(dǎo)化合物的重要來源之一。從珊瑚共附生的真菌中分離的代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，涉及生物堿、聚酮、萜類、內(nèi)酯類、環(huán)肽類、聚醚類、甾醇類、多糖類及不飽和脂肪酸等非甾體類化合物類型。目前，人們已經(jīng)對多種珊瑚來源的共附生真菌進(jìn)行了研究，并從中獲得了一系列具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗癌等多種生物活性物質(zhì)。如李金鳳等［6］從乳白肉芝軟珊瑚（Sarcophyton glaucum）分離得到1 個(gè)新型西松烷型二萜，顯現(xiàn)出良好的抗炎活性。李旺盛等［7］對軟珊瑚Dendronephthyasp.的化學(xué)成分和抗炎活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，化合物11?acetoxy?3β,6α-dihydroxy?9, 11?seco?5α-cholest?7?en?9?one 對LPS 誘導(dǎo)的BV?2 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。Liu 等［8］在珊瑚真菌土曲霉中發(fā)現(xiàn)10 種丁烯內(nèi)酯類化合物，活性結(jié)果表明，versicolactone B 對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 小鼠巨噬細(xì)胞中 NO 的產(chǎn)生有很強(qiáng)的抑制作用，比陽性對照吲哚美辛的作用更顯著，這表明它可能是一種潛在的新型抗炎藥的先導(dǎo)化合物。中山大學(xué)的Liu 等［9］從柳珊瑚真菌Penicillium sclerotiorum中分離得到4 種新的聚酮化合物，均能顯著抑制 LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 中NO 的產(chǎn)生，且sclerketide B 和C，以及iso?chromophilone IX 在mRNA 水平上表現(xiàn)出下調(diào)iNOS和COX?2 表達(dá)。Shen 等［10］從軟珊瑚Lobophytum sarcophytoides中分離到2 種cembrane 型二萜類化合物，其中cembratriene?4,8,11?triol 能顯著抑制LPS 激活的RAW 264.7 細(xì)胞中NO 的產(chǎn)生。但是，現(xiàn)有活性先導(dǎo)化合物的研究只涉及珊瑚資源中的一小部分，且國內(nèi)外對珊瑚共附生微生物的研究多集中在柳珊瑚或軟珊瑚等，對其他珊瑚科，尤其是石珊瑚及其共附生真菌來源的抗炎活性先導(dǎo)化合物的發(fā)掘及其作用機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究中以徐聞石珊瑚來源共附生真菌為研究對象，探究不同培養(yǎng)條件對其次級代謝產(chǎn)物抗炎活性和化學(xué)多樣性的影響。分別選用PDB 和糙米培養(yǎng)基，并設(shè)置 3 種鹽度（0.3%、3% 和 10%），對 31株石珊瑚來源共附生真菌進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。以LPS 誘導(dǎo)的BV?2 小膠質(zhì)細(xì)胞為炎癥模型，從中篩選出具有抗炎活性的菌株；并通過TLC 指紋圖譜、UPLC?QTOF?MS 以及FBMN 等技術(shù)手段進(jìn)一步分析抗炎活性菌株次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性，以期為后續(xù)深入挖掘石珊瑚共附生真菌中的抗炎活性次級代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株和細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)的31 株石珊瑚共附生真菌均采自廣東徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)，目前保藏在廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所，菌株種屬及珊瑚來源如表1 所示；BV?2 小膠質(zhì)細(xì)胞購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

表1 31 株珊瑚共附生真菌菌屬及珊瑚來源Table 1 31 coral symbiotic fungal genera and coral sources

1.1.2 培養(yǎng)基 PDB 培養(yǎng)基：配置好的馬鈴薯葡萄糖粉24.0 g，海鹽適量（鹽度為0.3%時(shí)添加量為3.0g，鹽度3.0%時(shí)添加量為30.0 g，鹽度10.0%時(shí)添加量為100.0 g），加水定容至1 L，pH =7.0，121℃滅菌30 min 備用。糙米培養(yǎng)基 ：糙米50.0 g，海鹽適量（鹽度為0.3%時(shí)添加量為3.0 g，鹽度3.0%時(shí)添加量為30.0 g，鹽度10.0%時(shí)添加量為100.0 g），加水定容至1 L，pH =7.0，121℃滅菌30 min 備用。完全培養(yǎng)基：向500 mL DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基中加入50 mL 過濾后的澳洲胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和5 mL 雙抗（青霉素-鏈霉素混合液100×）。

1.1.3 主要試劑與儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基，Gibco公司；胰蛋白酶?EDTA（0.25%），Gibco 公司；FBS，美國Zeta Life 公司；青霉素-鏈霉素混合液（100×），Gibco 公司；LPS，Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），Gibco 公司；NO 檢測試劑盒，碧云天公司；3?（4,5?二甲基?2?噻唑基）?2,5?二苯基溴化四唑（MTT），源葉生物。

多功能紫外透射儀，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；霉菌培養(yǎng)箱及生物安全柜，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；生物安全柜，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；UPLC/Xevo G2?XS QTOF 超高效液相/串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，沃特世科技（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；超凈工作臺，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國精騏有限公司；倒置顯微鏡，日本島津儀器有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，Countstar BioMed；Epoch2 酶標(biāo)儀，購自美國BioTek 公司；離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；高效薄層層析板（GF254），購自青島凱邦公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將31 株石珊瑚來源共附生真菌凍存管置于溫度 28℃、濕度 80% 的霉菌培養(yǎng)箱活化過夜后，接種到已滅菌的海水馬鈴薯瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基的平板上，將平板置于霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落孢子生長茂盛，接種到預(yù)先裝有200 mL 滅菌PDB 培養(yǎng)基的錐形培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 3-4 d，待菌落孢子生長茂盛備用。

1.2.2 OSMAC［11］策略下菌株的小規(guī)模培養(yǎng) 將平板長勢良好的31 株菌株在無菌條件下制備成種子液并分別接種到6 種不同培養(yǎng)基（鹽度0.3%、3%、10%的PDB 培養(yǎng)基，鹽度0.3%、3%、10%的糙米培養(yǎng)基），每組設(shè)3 個(gè)平行組，于室溫條件下靜置培養(yǎng)28 d。

1.2.3 菌株次級代謝產(chǎn)物的提取 將培養(yǎng)后的菌株分別用不同方法提取次級代謝產(chǎn)物，PDB 培養(yǎng)基的菌體和菌液分開，菌體用等體積甲醇進(jìn)行超聲提取3 次，菌液用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，減壓濃縮得粗提物；糙米培養(yǎng)基用等體積甲醇浸泡，超聲提取30 min，重復(fù)3 次，甲醇提取液減壓濃縮得粗提物。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 將凍存的BV?2 細(xì)胞迅速解凍后，將細(xì)胞凍存液轉(zhuǎn)移到離心管中并加入5 mL 完全培養(yǎng)基混合，1 000 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)基，重新加入5 mL 完全培養(yǎng)基將貼壁的細(xì)胞吹打下來轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，備用。把處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度100 μL/孔的體積接種到96 孔板中，分為多組培養(yǎng)（control 組，LPS 組（1 μg/mL），試驗(yàn)組（1、10、20、50、100 μg/mL），每組設(shè)5 個(gè)平行，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.5 NO 測定 本實(shí)驗(yàn)通過碧云天NO 試劑盒測定細(xì)胞中的NO 含量。其原理是：在有機(jī)酸條件下，對氨基苯磺酸和NO2-發(fā)生重氮化反應(yīng)，然后再與鹽酸-萘胺偶合生成紫紅色物質(zhì)，測定OD540nm值易知NO2-含量，進(jìn)而推算出NO 含量。待測樣品所用溶液將1 mol/L 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為不同濃度（0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L），吸取30 μL 稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品于96 孔板中，加入磺胺溶液30 μL，室溫下避光反應(yīng)5-10 min，再加入鹽酸-萘胺溶液30μL，繼續(xù)在室溫避光孵育5-10 min，用酶標(biāo)儀檢測540 nm 處的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y= 0.008 7x+ 0.049 3（R2= 0. 997）。細(xì)胞接種到96孔板分組培養(yǎng)24 h 后，分別吸取control 組、LPS 組和試驗(yàn)組中培養(yǎng)基30 μL 于新的96 孔板，每孔加入30 μL 磺胺溶液反應(yīng)5 min 后再加入30 μL 鹽酸-萘胺溶液繼續(xù)反應(yīng)5 min，使用酶標(biāo)儀檢測540 nm 處的吸光度。

1.2.6 細(xì)胞存活率 將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度和100 μL/孔的體積接種到96 孔板中培養(yǎng)，24h 后，加入待測樣品，使加入后樣品的終濃度分別為1、10、20、50、100 μg/mL；24 h 后，每孔加入10 μL 的MTT 溶液（用PBS 溶解成5 mg/mL），置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 溶液100 μL 溶解甲瓚，振蕩混勻后檢測波長540 nm 處的吸光度（λ）值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=樣品組OD540/空白組OD540×100%。

1.2.7 菌株次級代謝產(chǎn)物的TLC 分析 將上述粗提物用甲醇配置成10 mg/mL 的濃縮液，采用高效硅膠薄層層析板對各粗提物的化學(xué)多樣性進(jìn)行分析。選擇乙酸乙酯∶正己烷=2∶1 二元溶劑體系作為TLC分析展開劑，并在波長254 和365 nm 下觀察代謝產(chǎn)物的分布情況。酚類化合物在自然界中廣泛存在，在治療炎癥方面也起到了良好的效果［12］，用鐵氰化鉀-三氯化鐵試劑進(jìn)行顯色，對次級代謝產(chǎn)物中的酚類化合物進(jìn)行追蹤分析［13］。

1.2.8 LC?MS/MS 分析 將各粗提物用色譜級甲醇配成等濃度樣品溶液進(jìn)行液質(zhì)分析。液相色譜條件：進(jìn)樣量為1.0 μL，洗脫條件為：0.00-0.50 min，30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；0.50-4.00 min，30%-80%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；4.00-7.00min，80%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；7.00-7.20 min，80%-30%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；7.20-8.50 min，30% 的乙腈水溶液（含0.1%甲酸），流速：0.3 mL/min。DAD 檢測器信號采集波長為190-600 nm，監(jiān)測波長為 254 和 360 nm。色譜柱為：Waters ACQUITY UPLC BEH RP18（2.1 mm×50 mm,1.7 μm），質(zhì)譜的質(zhì)量掃描范圍設(shè)置為m/z50-2 000，電噴霧離子化，正離子模式。

1.2.9 FBMN［14］可視化分析 將原始液質(zhì)數(shù)據(jù)文件的格式轉(zhuǎn)換為.abf 格式后，將其上傳至MS?DIAL 基于化合物的母離子精確質(zhì)量和二級質(zhì)譜的相似度與數(shù)據(jù)庫中的化合物進(jìn)行匹配。然后通過MSFINDER Ver 3.52 將特征點(diǎn)列表里的化合物與不同的數(shù)據(jù)庫如PubChem、NPASS、COCONUT 和ChEBI 等進(jìn)行比較，以注釋每個(gè)特征點(diǎn)可能代表的化合物。然后上傳至全球天然產(chǎn)物分子網(wǎng)絡(luò)集群數(shù)據(jù)庫（global natural products social molecular networking，GNPS）數(shù)據(jù)庫計(jì)算分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制分子網(wǎng)絡(luò)圖，利用FBMN 基于GNPS 的二級質(zhì)譜相似度匹配功能可注釋樣品所含的已知化合物，并根據(jù)分子網(wǎng)絡(luò)圖中不同節(jié)點(diǎn)的關(guān)系，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以推斷化合物種類及結(jié)構(gòu)。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 8 軟件，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001 被認(rèn)為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株次級代謝產(chǎn)物的抗炎活性分析

小膠質(zhì)細(xì)胞（BV?2）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，響應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的病理刺激。本文以LPS 誘導(dǎo)的BV?2 小膠質(zhì)細(xì)胞為炎癥模型，對31 株石珊瑚來源共附生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗炎活性進(jìn)行篩選，結(jié)果如表2和表3 所示。PDB 培養(yǎng)基條件下，共有17 株菌株的次級代謝產(chǎn)物在不同濃度下顯示出一定的抗炎活性，其余14 株菌株均不顯示或者顯示弱（P≤ 0.05）的抗炎活性。且隨著鹽度的增加，具有抗炎活性菌株明顯增加。而糙米培養(yǎng)基條件下，27 株菌株的次級代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出顯著的抗炎活性，但隨著鹽度的增加，菌株抗炎活性無明顯差異。上述結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件對菌株抗炎活性的影響很大，如C1?5、C3?3、C3?8、C3?9 和C14?17 在PDB 培養(yǎng)條件下菌株次級代謝產(chǎn)物均不顯示抗炎活性，但在糙米培養(yǎng)基的3 個(gè)鹽度條件下均表現(xiàn)出良好的抗炎活性。同時(shí)上述5 株真菌的粗提物對NO 的抑制能力均表現(xiàn)出顯著的濃度依賴性，即隨著濃度的增大抑制NO產(chǎn)生的能力也隨之加強(qiáng)（圖1），尤其是菌株C3?9在低濃度條件下（10 和20 μg/mL）也表現(xiàn)出了顯著的NO 抑制活性。

圖1 糙米培養(yǎng)基條件下5 株共附生真菌粗提物對BV-2 細(xì)胞NO 產(chǎn)生的影響Fig. 1 Effects of crude extracts from five strains of symbiotic fungi on NO production in BV-2 cells under brown rice medium conditions

表2 PDB 培養(yǎng)基條件下各菌株粗提物的抗炎活性Table 2 Anti-inflammatory activities of crude extracts extracted from different strains under PDB medium conditions

表3 糙米培養(yǎng)基條件下各菌株粗提物的抗炎活性Table 3 Anti-inflammatory activity of crude extracts obtained from different strains under brown rice medium conditions

通過MTT 實(shí)驗(yàn)檢測樣品對BV?2 小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響，進(jìn)而確定實(shí)驗(yàn)的樣品濃度水平。如圖2 所示，大部分實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在用粗提物（濃度依次為1、10、20、50、100 μg/mL）處理24 h 后，其OD540nm值和空白組OD540nm值的比值約為100%，說明在這個(gè)濃度范圍里，粗提物對BV?2 小膠質(zhì)細(xì)胞的存活率無顯著性影響。因此，在此濃度梯度下，大部分粗提物沒有細(xì)胞毒性，可用此濃度梯度繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 糙米培養(yǎng)基條件下5 株共附生真菌粗提物對BV-2 細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of crude extracts of five strains of symbiotic fungi on the viability and survival of BV-2 cells under brown rice medium conditions

2.2 菌株次級代謝產(chǎn)物的TLC圖像分析

2.2.1 5 株具有抗炎活性的菌株表觀形態(tài)對比 根據(jù)上述抗炎活性結(jié)果，選擇C1?5、C3?3、C3?8、C3?9 和C14?17 等5 株具有顯著抗炎活性的菌株作為目標(biāo)菌株。通過對比菌株的表觀形態(tài)（圖3）和DNA 測序可知，5 株菌株分別屬旋孢腔菌屬Cochliobolussp.（C1?5），土曲霉A. terreus（C3?3 和C3?9），青霉屬P. citrinum（C3?8）和葡萄穗霉屬Stachybotryssp.（C14?17），其中3 株來源于牡丹珊瑚，1 株來源于普哥濱珊瑚，1 株來源于叢生盔形珊瑚。

圖3 5 株具有抗炎活性的菌株生長形態(tài)Fig. 3 Growth morphology of five strains with anti-inflammatory activity

2.2.2 5 株菌株次級代謝產(chǎn)物的TLC 圖像分析 利用 TLC 對上述5 株具有抗炎活性菌株的粗提物進(jìn)行了不同波長下的紫外吸收、熒光斑點(diǎn)、三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色斑點(diǎn)的 TLC 指紋譜圖綜合比較，結(jié)果如圖4 所示，不同培養(yǎng)條件下各菌株次級代謝產(chǎn)物差異較大。相比其他菌株，C3?9 在波長 254 和 365nm 下吸收斑點(diǎn)明顯更多（圖4?C1、C2），這意味著其含有的次級代謝產(chǎn)物種類更為豐富。從圖4?C3 可看出菌株C3?9 在三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色劑作用下顯現(xiàn)出豐富的藍(lán)色斑點(diǎn)，這表明其具有豐富的酚類產(chǎn)物。進(jìn)一步分析菌株C3?9 的TLC 圖像可知，PDB和糙米培養(yǎng)基下菌株代謝產(chǎn)物具有較大的差異。且隨著鹽度的增加，同一培養(yǎng)基下菌株的次級代謝產(chǎn)物也發(fā)生了一定的差異，部分次級代謝產(chǎn)物的斑點(diǎn)強(qiáng)度明顯降低，這表明鹽度的增加，會導(dǎo)致部分代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。

2.3 菌株C3?9次級代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性分析及FBMN可視化分析

為了進(jìn)一步分析不同培養(yǎng)條件對菌株C3?9 代謝情況的影響，對6 個(gè)不同培養(yǎng)條件下的提取物進(jìn)行了 LC?MS/MS 和FBMN 分析。從提取物的色譜基峰圖（圖5）可知，菌株C3?9 在PDB 和糙米培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物具有一定的差異性，且與上述TLC 分析結(jié)果一致。PDB 培養(yǎng)基條件下，菌株次級代謝產(chǎn)物無明顯差異，但隨著鹽度的增加，部分產(chǎn)物的峰面積明顯減少，這表明其產(chǎn)量的降低，說明在PDB培養(yǎng)基中鹽度對次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量影響較大。而糙米培養(yǎng)基中，0.3%和3%鹽度的條件下的粗提物的種類沒有表現(xiàn)出明顯的差異性。但是隨著鹽度的增加，10%鹽度下菌株的次級代謝產(chǎn)物豐富度明顯降低，且與3%鹽度的產(chǎn)物表現(xiàn)出了明顯的差異性，這與2.1 部分觀察到的3%鹽度產(chǎn)物抗炎活性顯著高于10%鹽度產(chǎn)物的現(xiàn)象具有很好的相關(guān)性。而MS?DIAL 特征離子表積分面積的對應(yīng)峰在3%和10%兩種鹽度條件下的積分面積比進(jìn)一步表明不同鹽度條件下的產(chǎn)物產(chǎn)量具有明顯的差異（表4），且在3%鹽度條件下產(chǎn)生的主要次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量顯著高于10%鹽度條件下。從中選擇8 個(gè)質(zhì)譜可檢測的產(chǎn)量發(fā)生顯著變化的主峰（峰1-8，差異性倍數(shù)>2），將其質(zhì)譜數(shù)據(jù)提交到FBMN，并結(jié)合COCONUT、PubChem、LOTUS 等多數(shù)據(jù)庫做注釋分析（圖6），最終確定了這8 個(gè)主峰依次為cordycepin、visnagin、thymol、6?methoxyflavone、periplogenin、spathulenol、ectoine、gallocatechin。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這8 個(gè)化合物均具有抗炎活性。這對于3%鹽度產(chǎn)物明顯優(yōu)于10%鹽度產(chǎn)物提供了合理的解釋。

圖5 不同培養(yǎng)條件下菌株C3-9 發(fā)酵產(chǎn)物的LC-MS/MS色譜基峰圖Fig. 5 LC-MS/MS base-peak chromatograms of the fermented products of strain C3-9 under different culture conditions

圖6 菌株C3-9 在0.3%和10%鹽度糙米培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物基于二級質(zhì)譜聯(lián)系的分子網(wǎng)絡(luò)局部放大圖Fig. 6 Local magnification of metabolites of strain C3-9 in 0.3% and 10% salinity brown rice medium based on secondary mass spectrometric correlation of molecular network

表4 3% 和10% 鹽度下菌株C3-9 基峰色譜圖中產(chǎn)量具有差異主峰的數(shù)據(jù)庫挖掘及其峰面積的變化倍數(shù)Table 4 Database mining of strain C3-9 base peak chromatograms with differential primary peaks in yield at 3% and 10% salinity and the multiplicity of changes in their peak areas

3 討論

OSMAC 策略［15-17］，亦稱單菌株多次級代謝產(chǎn)物策略，是通過改變培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、狀態(tài)，添加酶抑制劑，調(diào)控表觀遺傳，混合培養(yǎng)等方法，充分挖掘微生物合成次級代謝產(chǎn)物的能力，從而獲得更多類型的次級代謝產(chǎn)物。彭艾等［18］通過OSMAC策略從深海真菌Stachybotryssp.3A0009 中得到7 個(gè)單體化合物，其中包括3 個(gè)對人口腔上皮癌KB細(xì)胞有較強(qiáng)增殖抑制作用的化合物。Si 等［19］用OSMAC 策略從黃曲霉菌株中分離到8 個(gè)化合物，其中新化合物flavichalasines N 和O 及已知化合物aspochalasins I 和D 對3 種人癌細(xì)胞株有明顯的毒作用。通過OSMAC 策略，da Silva 等［20］從A. sydowii中激活沉默的代謝產(chǎn)物，得到具有較好AChE 抑制活性的5 個(gè)化合物：cyclo?（L?Leu?L?Pro）、cyclo?（L?Val?L?Pro）、cyclo?（L?Val?L?Leu）、cyclo?（L?Phe?L?Val）和ergosterol peroxide，且cyclo?（L?Val?L?Pro）的抑制活性最強(qiáng)。

本文采用OSMAC 策略，研究了不同培養(yǎng)條件和鹽度對31 株石珊瑚共附生真菌次級代謝產(chǎn)物抗炎活性和化學(xué)多樣性的影響?？寡谆钚越Y(jié)果表明，多數(shù)菌株粗提物在10%的PDB 和糙米培養(yǎng)基條件下顯示出了顯著的抗炎活性，且糙米培養(yǎng)基的粗提物的抗炎活性明顯大于PDB?；瘜W(xué)多樣性分析結(jié)果表明，菌株在PDB 和糙米培養(yǎng)基條件下次級代謝產(chǎn)物具有一定的差異性。推測可能的原因是糙米培養(yǎng)基與PDB 培養(yǎng)基營養(yǎng)源的不同，使得產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物有所區(qū)別。糙米培養(yǎng)基以淀粉作為碳源，而PDB 培養(yǎng)基則均以葡萄糖為碳源，碳源為菌體生長與代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)與能量，是培養(yǎng)基中重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一。碳源不同，菌株對碳源種類的利用程度不同，從而造成菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類和產(chǎn)量不同［21］。而在高鹽條件下表現(xiàn)出更好的抗炎活性推測可能的原因是高鹽條件下部分菌株細(xì)胞內(nèi)編碼抗炎活性組分的沉默基因被激活了，從而導(dǎo)致更多的抗炎活性的代謝產(chǎn)物能夠被合成，使得粗提物的抗炎活性增加。

GNPS 是一個(gè)開放的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)崿F(xiàn)分子網(wǎng)絡(luò)的公共基礎(chǔ)平臺［22］，能快速對LC?MS/MS 生成的數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析［23-24］。馬小翔等［25］對一株高產(chǎn)丁內(nèi)酯I 的海洋來源土曲霉C23?3進(jìn)行化學(xué)調(diào)控，運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及基于質(zhì)譜的分子網(wǎng)絡(luò)分析其次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和多樣性發(fā)現(xiàn)，菌株C23?3 經(jīng)化學(xué)調(diào)控后的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了不同程度的變化。Wang 等［26］基于 MS/MS的分子網(wǎng)絡(luò)來研究A. caelatus的化學(xué)成分，從而發(fā)現(xiàn)了新的二酮哌嗪二聚體和曲霉素。Freire 等［27］通過GNPS 對海綿Agelas dispar的甲醇部分進(jìn)行研究，從中發(fā)現(xiàn)了新的溴吡咯衍生物。

FBMN 是一種基于高分辨質(zhì)譜的改進(jìn)GNPS 方法［28］。在本研究中，利用FBMN 進(jìn)行了活性菌株次生代謝產(chǎn)物的注釋，從數(shù)據(jù)庫中匹配到了8 個(gè)抗炎化合物［29-36］，且基于二級質(zhì)譜相似性可發(fā)現(xiàn)多樣化的衍生物，從而獲得更多的抗炎活性物質(zhì)。但從匹配結(jié)果可看出化合物的生物來源主要來自于植物和細(xì)菌，在珊瑚共附生真菌中尚未被發(fā)現(xiàn)，或尚未被GNPS 數(shù)據(jù)庫所收錄，說明珊瑚共附生真菌中的次級代謝產(chǎn)物值得進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

不同培養(yǎng)條件下石珊瑚共附生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗炎活性和化學(xué)多樣性表現(xiàn)出明顯差異。其中5 株菌株在糙米培養(yǎng)基條件下表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，而菌株C3?9 粗提物在低濃度條件下也表現(xiàn)出了顯著的抑制NO 產(chǎn)生的作用。進(jìn)一步的TLC 和FBMN 分析顯示，菌株C3?9 的次級代謝產(chǎn)物中含有豐富的抗炎活性化合物，這為后續(xù)抗炎活性化合物的深入研究提供了基礎(chǔ)，對抗炎藥物的研發(fā)具有一定的科學(xué)意義。