豬源致病性大腸桿菌基因組比較與毒力因子分析

吳莉丹 冉雪琴 牛熙 黃世會(huì) 李升 王嘉福

（1. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025）

大腸桿菌（Escherichia coli）是腸桿菌科埃希氏菌屬的革蘭氏陰性菌，是動(dòng)物腸道最主要的兼性厭氧菌，通常對(duì)宿主無(wú)害。由于大腸桿菌基因組具有高度的可塑性，通過(guò)遺傳變異可能獲得和丟失一些基因［1］，導(dǎo)致特定的血清型對(duì)動(dòng)物致病，豬尤其易感［2］。豬大腸桿菌病在全球各地普遍存在，各年齡段均可發(fā)病，尤其是新生幼豬最易感，常給豬場(chǎng)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失。豬源致病性大腸桿菌主要的毒力因子包括黏附系統(tǒng)、鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)和毒素等［3］，多種毒力因子相互協(xié)調(diào)作用，決定疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。豬源致病性大腸桿菌首先通過(guò)黏附系統(tǒng)和鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，黏附并定植于豬的小腸腔內(nèi)表面，大量繁殖并產(chǎn)生毒素，再通過(guò)分泌系統(tǒng)將毒素分泌到細(xì)菌外，毒素被宿主吸收，損傷胃腸道血管和皮下組織，導(dǎo)致黃白痢、水腫病［4］。豬源致病性大腸桿菌的毒力不同，臨床癥狀輕重不一［5］。

毒力強(qiáng)弱與毒力因子的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。采用比較基因組學(xué)方法，比較多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida, PM）的強(qiáng)毒株DY120818與4 株弱毒株，表明毒力的差異可能與整合結(jié)合元件ICEPmu2 有關(guān)［6］；豬源腸外致病性大腸桿菌強(qiáng)毒菌株P(guān)CN033 和弱毒菌株P(guān)CN061 的基因序列分析提示，強(qiáng)毒菌株基因組中特有水平轉(zhuǎn)移DNAs、特有編碼黏附素、脂多糖等毒力因子基因，且擁有較多的前噬菌體序列［7］。為了系統(tǒng)解析本地流行的致豬腹瀉大腸桿菌的致病機(jī)制，本研究以不同毒力的6 株豬源致病性大腸桿菌為研究材料，通過(guò)全基因組測(cè)序，挖掘基因組中致病相關(guān)的毒力因子基因，分析毒力因子基因發(fā)生的變異，為大腸桿菌病的診斷和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌弱毒菌株P(guān)32、P111 和中等毒菌株P(guān)555、P211，由本實(shí)驗(yàn)室從貴州某豬場(chǎng)腹瀉仔豬糞樣中分離獲得［8］；強(qiáng)毒菌株S10670（菌種編號(hào)：CICC 10670）、E24190（ 菌 種 編 號(hào)：CICC 24190）購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 序列測(cè)定 應(yīng)用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)各株細(xì)菌，離心收集菌體，利用天根DNA 試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，構(gòu)建DNA 文庫(kù)，應(yīng)用Illumina Hiseq 2500 測(cè)序平臺(tái)（華大基因）進(jìn)行基因組測(cè)序（雙端，2×150bp）。此外，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載E. coli. str.K?12 的基因組序列作為參考。

1.2.2 基因組序列組裝與基因注釋 利用軟件FastQC［9］評(píng)估原始測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，以軟件FastP［10］對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量reads 進(jìn)行過(guò)濾；通過(guò)Spades［11］軟件對(duì)過(guò)濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，GapClose［12］軟件對(duì)未知堿基進(jìn)行填充；采用SeqKit［13］軟件過(guò)濾掉組裝序列中小于500 bp 的小片段，Quast［14］軟件對(duì)組裝序列進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)多次優(yōu)化，得到6 株大腸桿菌的基因組組裝序列。應(yīng)用Prokka［15］軟件對(duì)組裝的基因組序列進(jìn)行注釋，得到編碼基因和非編碼RNAs，使用PhiSpy［16］軟件預(yù)測(cè)組裝基因組中的前噬菌體區(qū)域，通過(guò)在線網(wǎng) 站CRISPRFinder（https://crispr.i2bc.paris?saclay.fr/Server/）分析組裝基因組中的CRISPR 序列。

1.2.3 進(jìn)化類型分析 參照文獻(xiàn)［17］合成chuA、yjaA和TspE4.C2基因的特異性引物（上海生工）。采用煮沸法提取受試菌株的基因組DNA 為模板，進(jìn)行三重PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×TaqPCR MasterMix 10 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各0.5μL；DNA 模板1 μL；ddH2O 為6 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 45 s，退火60℃ 30 s，72℃18 s，30 次循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。取3 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，據(jù)檢測(cè)結(jié)果鑒定大腸桿菌的系統(tǒng)進(jìn)化群。用Abricate 軟件將基因組組裝序列比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)ECOH［18］（https://github.com/katholt/srst2/tree/master/data），據(jù)基因序列相似性鑒定菌株的血清型。利用mlst［19］軟件對(duì)組裝的基因組實(shí)施多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）。

1.2.4 毒力因子基因的篩選與驗(yàn)證 將測(cè)序菌株的基因集，應(yīng)用Abricate 軟件與VFDB［20］數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）的核心序列集進(jìn)行比對(duì)（BLAST 參數(shù)：e?value 10-5，最小覆蓋度80%，最小相似度80%），得到毒力因子候選基因。從基因組注釋文件中提取各菌株分泌系統(tǒng)基因簇，繪制分泌系統(tǒng)的基因簇分布圖，比較不同菌株各類分泌系統(tǒng)的異同。根據(jù)基因組與毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果，從每種毒力因子基因類型中挑選代表性的毒力因子基因（共23 個(gè)）進(jìn)行PCR 驗(yàn)證（表1），基因組DNA 提取、PCR 反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳同1.2.3。

表1 毒力因子基因檢測(cè)引物Table 1 Primers for the detection of virulence factor genes

1.2.5 具有高影響變異的毒力因子基因的篩選與驗(yàn)證 將質(zhì)控后各菌株的測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)軟件BWA 比對(duì)到參考基因組E. coli. str.K?12 上，應(yīng)用SAMtools和GATK 軟件檢測(cè)菌株基因組中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）和短序列插入缺失突變（InDel），以SnpEff［21］軟件對(duì)SNPs 和InDels 影響的基因進(jìn)行注釋，從中篩選出具有高影響變異的毒力因子基因。在毒力因子基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1）。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序（上海生工），用DNAMAN［22］軟件對(duì)基因序列進(jìn)行拼接，根據(jù)測(cè)序圖譜校正拼接序列，將各基因的拼接序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，分析基因中發(fā)生的堿基變異。

2 結(jié)果

2.1 基因組序列組裝與注釋

經(jīng)拼接（表2），毒力不同的6 株大腸桿菌最終獲得108-191 條scaffolds；N50 為91-161 kb，確保了基因組組裝的質(zhì)量。菌株的基因組全長(zhǎng)為4.62-5.3 Mb，對(duì)參考基因的覆蓋率約為90%，其中菌株S10670 對(duì)參考基因組的覆蓋率最低（87.45%），P32的覆蓋率最高（91.98%）。

表2 菌株基因組組裝質(zhì)量分析Table 2 Quality analysis of the assembly genomes in E. coli strains

經(jīng)Prokka 注釋（表3），從6 株大腸桿菌中鑒定出4 308-5 040 個(gè)CDS 和3 364-3 557 個(gè)編碼基因，普遍高于參考基因組的數(shù)量。參考菌株有88個(gè)tRNA 編碼基因，檢測(cè)菌株的tRNA 基因數(shù)目為83-98 個(gè)，預(yù)測(cè)到菌株的rRNA 基因顯著少于參考菌株。菌株S10670 的前噬菌體數(shù)目最多（3 個(gè)），菌株E24190 和P555 基因組中沒(méi)有預(yù)測(cè)到前噬菌體序列。P211 的CRISPR 序列最多，其余菌株基因組中可能存在的CRISPR 序列數(shù)量高于參考菌株。

表3 基因組注釋分析Table 3 Genome annotation

2.2 進(jìn)化類型分析

通過(guò)三重PCR 檢測(cè)和序列相似性分析，菌株S10670 屬于系統(tǒng)進(jìn)化D 群，其余菌株屬于A 群。各菌株的血清型不同（表4），基于7 個(gè)管家基因的等位基因序列比對(duì)得到各菌株的多位點(diǎn)序列類型（sequence typing, ST）和克隆復(fù)合體類型（clonal complex, Cplx），E24190、P555、P32 為ST10 Cplx，P211 是一種新的ST 型。

表4 系統(tǒng)進(jìn)化群、血清型及MLST 分型Table 4 Phylogenetic groups, serotypes and MLST typing

2.3 毒力因子基因的篩選與驗(yàn)證

6 株大腸桿菌的毒力因子基因相比（表5），菌株之間毒力因子基因數(shù)量為112-280 個(gè)，基因數(shù)量相差1 倍以上，強(qiáng)毒菌株的毒素基因數(shù)量明顯多于中等毒菌株和弱毒菌株。除強(qiáng)毒菌株S10670 外，其余菌株的鞭毛相關(guān)基因占總毒力因子基因的一半以上。菌株P(guān)211 的鐵攝取和生物膜相關(guān)基因較多。各菌株的分泌系統(tǒng)基因數(shù)量差異較大，弱毒菌株也可以擁有豐富的分泌系統(tǒng)基因。

表5 菌株基因組中毒力因子分析Table 5 Virulence factors in genomes of strains

6 株致病菌分泌系統(tǒng)的差異集中于T2SS 和T6SS（圖1）。強(qiáng)毒菌株中預(yù)測(cè)出全部的T2SS 基因簇（11-13 個(gè)基因），參考基因組和弱毒菌株P(guān)32 中的T2SS基因簇不完整，2 個(gè)中等毒菌株中未檢測(cè)到T2SS 基因。大腸桿菌三型分泌系統(tǒng)（E. colitype III secretion systems, ETT）分為ETT1 和ETT2，其中ETT1 型只在強(qiáng)毒菌株S10670 基因組中分布；菌株S10670、P32 和P211 含有ETT2 基因，其中富含假基因，其余菌株不含ETT2 基因。菌株S10670 和P555 中預(yù)測(cè)出全部的T6SS 基因簇（19-20 個(gè)基因），E24190和P32 的T6SS 基因較少，只有3-6 個(gè)，其余菌株未檢測(cè)到T6SS 基因。

圖1 六株菌的分泌系統(tǒng)基因簇比較Fig. 1 Comparison of the secretion system gene cluster from six strains

從各類毒力因子基因中挑選代表性的23 個(gè)毒力因子基因，采用PCR 技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證（圖2，表6）。從強(qiáng)毒菌株S10670 基因組中檢測(cè)到T2SS 的外膜管道蛋白基因etpD、ETT1 的緊密黏附素基因eae、ETT2 中的轉(zhuǎn)錄因子eivF和脂蛋白前體基因eprK、T3SS 的效應(yīng)物espX1和espO1?2基因、T6SS 溶血素共溶蛋白家族基因aec16、血紅素吸收系統(tǒng)基因chuA、T5SS 的ehaA和ehaB基因、志賀樣毒素基因stx2A和stxB、侵襲素EaeH。強(qiáng)毒菌株E24190 基因組中檢測(cè)到T2SS 的GspD基因和六聚體ATP 酶基因GspE，其中GspD與etpD基因同源；含有T3SS 的效應(yīng)物基因espX1，T6SS 的溶血素共溶蛋白家族基因hcp1、自分泌黏附素基因aatB、耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素基因、腸聚集黏附性耐熱毒素基因east1，溶血素基因hlyA、侵襲素基因EaeH。

圖2 23 個(gè)毒力因子基因PCR 擴(kuò)增分析Fig. 2 PCR amplification of 23 virulence factor genes

表6 23 個(gè)毒力因子基因驗(yàn)證匯總分析Table 6 Summary of 23 validated virulence factor genes

中等毒菌株P(guān)555 基因組中檢測(cè)出espX1、aec16、hcp1、EaeH和ehaB基因；P211 中含有eprK、espX1、鐵載體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因sitA、ehaB基因和CFA/I 菌毛基因cfaB。弱毒菌株P(guān)32 基因組中含有GspE、eprK、hcp1、EaeH和ehaB基因；而P111基因組中只有espX1和ehaB兩個(gè)毒力因子基因。上述PCR 檢測(cè)結(jié)果與基因組測(cè)序和注釋分析的毒力因子基因一致。

2.4 毒力因子基因變異分析與驗(yàn)證

對(duì)6 株致病性大腸桿菌的基因組進(jìn)行SNP 和InDel 變異分析（表7），從中檢測(cè)到豐富的SNP 位點(diǎn)，菌株S10670 擁有的SNP 最多。除菌株P(guān)111 外，其他菌株基因組中的缺失突變比插入突變數(shù)量多。進(jìn)一步分析變異對(duì)基因的影響，得出受變異影響大的毒力因子基因只有7 個(gè)，分別是T3SS 效應(yīng)因子基因espY1、espL4和espX4，F(xiàn)im 鞭毛基因FimD和FimI，轉(zhuǎn)錄因子基因rpoS和尿囊素酶基因allB。采用PCR 和Sanger 測(cè)序（表8），證實(shí)菌株S10670 和P555 的espY1基因發(fā)生了一個(gè)移碼突變（圖3?A）；菌株E24190、P211、P32、P111 的espL4基因都缺失了612 bp（圖3?B），菌株P(guān)111 的espL4基因中還有一段超過(guò)900 bp 的插入序列，菌株P(guān)555 的espL4基因中檢測(cè)到一段不同于參考基因的序列；菌株P(guān)555 的espX4基因也檢測(cè)到一段超過(guò)900 bp 插入序列，S10670 的espX4基因還有兩個(gè)移碼突變（圖3?C）；E24190 中FimD基因檢測(cè)到一個(gè)無(wú)義突變（圖3?D）；菌株P(guān)32 的FimI有一個(gè)移碼突變（圖3?E）；菌株S10670 中allB基因含有一個(gè)無(wú)義突變（圖3?F）。E24190 的rpoS基因發(fā)生771 bp 的插入變異。這些變異將導(dǎo)致相關(guān)基因編碼的蛋白失活。

圖3 毒力因子基因的高影響變異位點(diǎn)Fig. 3 High-impact variant loci in virulence factor genes

表7 各菌株的基因組變異位點(diǎn)Table 7 Variation sites in the genome of each strain

表8 七個(gè)具有高影響變異的毒力因子基因Table 8 Seven virulence factor genes with high impact variants

3 討論

豬源致病性大腸桿菌是一種常見(jiàn)的傳染性病原體，可引起嚴(yán)重腹瀉等疾病［23］。為了有效地預(yù)防和控制豬大腸桿菌病，本研究通過(guò)基因組測(cè)序、組裝，得到6 株不同毒力的豬源致病性大腸桿菌的基因組信息。相比之下，強(qiáng)毒菌株S10670 和E24190 的基因組較大（5.3 Mb 和4.96 Mb），基因組最小的是弱毒菌株P(guān)111，僅有4.62 Mb，與參考基因組的大小相似。參考基因組E. coli. str.K?12 屬于非致病的腸道共生菌，全長(zhǎng)4.64 Mb，有4 288 個(gè)編碼基因，與致病性大腸桿菌（O157:H7，菌株EDL933）相比少了1 387 個(gè)基因［24］。菌株S10670、E24190、P555、P211、P32、P111 的CDS 數(shù)目依次為5 040、4 732、4 531、4 483、4 837、4 308，編碼基因從3 519 個(gè)降至3 364 個(gè)?？傮w上，隨著菌株的毒力從高到低變化，基因組長(zhǎng)度、CDS 和編碼基因數(shù)量表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。

大腸桿菌的致病力與種系發(fā)育分群有一定關(guān)系，B2 和D 群是主要的腸道外致病性大腸桿菌，A和B1 群多為腸道共生型大腸桿菌，四川地區(qū)豬源致病性大腸桿菌多屬于A 和B1 群［25］，新疆地區(qū)的多為B1 和A 群［26］，本研究檢測(cè)的菌株中，本地分離的4 株菌均屬于A 群，提示養(yǎng)豬業(yè)應(yīng)關(guān)注腸道共生型大腸桿菌對(duì)大腸桿菌病的影響。大腸桿菌的某些特殊血清型具有致病性［27］。本研究中，從患病豬糞樣中分離的菌株血清型為H4、O4: H45、O9: H4、O26: H30，從云南分離得到101 株豬源大腸桿菌中優(yōu)勢(shì)血清型為O4［28］，國(guó)內(nèi)山東地區(qū)檢測(cè)出血清型O9［29］，本研究檢測(cè)菌株的血清型有一定的多樣性。此外，本研究檢測(cè)到3 個(gè)菌株屬于ST10 克隆復(fù)合群，新發(fā)現(xiàn)一種ST 型。山東360 株豬源大腸桿菌中，優(yōu)勢(shì)的復(fù)合群為ST10 克隆復(fù)合群［30］。表明ST10 克隆復(fù)合群可能是豬源大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)ST 型。

大腸桿菌攜帶的毒力因子是決定其致病性的關(guān)鍵因素［31］。在感染初期，黏附素可介導(dǎo)細(xì)菌定植于宿主的腸道上皮細(xì)胞［32］，不同致病性大腸桿菌的菌毛類型不同。本研究的強(qiáng)毒菌株與弱毒菌株相比擁有更多的黏附系統(tǒng)基因，強(qiáng)毒菌株擁有毒素相關(guān)的菌毛黏附素和一些毒性較強(qiáng)的非菌毛黏附素，以協(xié)助大腸桿菌入侵宿主細(xì)胞［33］，如CFA/I 菌毛基因僅在P211 基因組中存在。

細(xì)菌的鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)能幫助細(xì)菌從宿主獲取鐵元素，本研究檢測(cè)的6 株大腸桿菌中，均含有鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的腸桿菌素基因，鐵載體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)僅在P211 基因組中存在，血紅素吸收系統(tǒng)僅從S10670 中檢測(cè)到。構(gòu)建血紅素吸收系統(tǒng)基因chuT基因缺失突變株，證明細(xì)菌的致病性不受chuT基因的影響［34］。推測(cè)鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能不是大腸桿菌毒力的決定性因素。

致病性大腸桿菌的外毒素主要包括志賀毒素（Stx）和腸毒素等。本實(shí)驗(yàn)室前期從貴州本地豬場(chǎng)的患病仔豬中分離到志賀樣毒素和腸毒素基因［35-36］。本研究中僅在S10670 基因組中檢測(cè)到志賀樣毒素基因，E24190 中含有耐熱腸毒素、不耐熱腸毒素基因以及腸聚集黏附性耐熱毒素east1基因。此外，細(xì)菌釋放的溶血素（hly）可進(jìn)入宿主的血液循環(huán)，在靶細(xì)胞膜上形成孔道，使大部分哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞和免疫細(xì)胞破裂［37］，本研究?jī)H從菌株S10670 基因組中檢測(cè)到溶血素基因hlyA，中等毒菌株和弱毒菌株中都沒(méi)有檢測(cè)到溶血素基因。大腸桿菌通過(guò)志賀樣毒素、溶血素等改變宿主腸道的完整性，進(jìn)而引發(fā)炎癥等，最終導(dǎo)致豬的腹瀉［38］。本研究結(jié)果提示強(qiáng)毒力菌株可能通過(guò)多種毒素的綜合作用，破壞宿主的腸道屏障致病。弱毒菌株含有的毒素基因較少，致病力較弱。

細(xì)菌利用不同的分泌系統(tǒng)可以將蛋白運(yùn)送到細(xì)菌外。迄今從革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了6 種分泌系統(tǒng)（即I-VI 型）［39］。T1SS 主要運(yùn)輸抗生素和毒素等小分子［40］，與ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白非常相似［41］，溶血素和自分泌黏附素均屬于T1SS，自分泌黏附素是由aatPABCD基因簇編碼的外膜蛋白，能促進(jìn)致病性大腸桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，破壞宿主的自我保護(hù)屏障［42］。從107 株鴨源致病性大腸桿菌中，檢測(cè)出28.94%的菌株含有aatA基因［43］。本研究中這兩種T1SS 基因只存在于強(qiáng)毒菌株中。T2SS 不僅具有豐富的蛋白酶分泌活性，還能介導(dǎo)多種毒素向細(xì)菌外傳遞［44］。本研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒菌株中的T2SS 基因數(shù)量多，弱毒菌株的T2SS 基因較少。T3SS 可以將細(xì)菌的物質(zhì)注入宿主細(xì)胞內(nèi)，干擾宿主的免疫功能。大腸桿菌有兩種T3SS，分為ETT1 和ETT2，ETT1 由LEE毒力島編碼，擁有LEE 毒力島的致病性大腸桿菌可損傷動(dòng)物的腸黏膜細(xì)胞。ETT2 在腸致病性大腸桿菌的侵襲、胞內(nèi)存活和毒力等方面發(fā)揮重要作用［45］，如ETT2 結(jié)構(gòu)基因epaPQR簇參與致病性大腸桿菌的鞭毛形成并調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)菌的定殖能力［46］。本研究從強(qiáng)毒菌株S10670 基因組中檢測(cè)到幾乎全部的T3SS 基因，中等毒菌株P(guān)211 和弱毒菌株P(guān)32 中的ETT2 基因減少，其余菌株中未發(fā)現(xiàn)T3SS 基因。大腸桿菌的T5SS 是一個(gè)自主轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，主要由膜外功能區(qū)和跨膜區(qū)、信號(hào)肽及自分泌重復(fù)序列3 部分組成［47］，主要與黏附和生物被膜的形成有關(guān)。本研究中所有菌株都檢測(cè)到T5SS 的ehaB基因，但基因ehaA僅在S10670 基因組中分布。T6SS 與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)，25%的革蘭氏陰性菌擁有T6SS 基因，其中大多數(shù)為致病菌［48］。本研究中只有菌株S10670 和P555 檢測(cè)到豐富的T6SS 基因20 個(gè)和19 個(gè)，菌株E24190、P32 中的T6SS 基因較少，僅有6 個(gè)和3 個(gè)。

4 結(jié)論

豬源致病性大腸桿菌基因組長(zhǎng)度呈多態(tài)性，強(qiáng)毒菌株的基因組長(zhǎng)度、CDS 和編碼基因的數(shù)量高于弱毒菌株，并且擁有更多的毒力因子基因，尤其毒素基因；且強(qiáng)毒菌株的毒力因子基因具有較多的高影響變異。結(jié)果表明，豬源致病性大腸桿菌毒力的強(qiáng)弱與菌株之間毒力因子基因的數(shù)量和基因結(jié)構(gòu)相關(guān)。