貝萊斯芽孢桿菌ZHX-7 的分離鑒定及抑菌促生效果

李瑩 宋新穎 何康 郭志青 于靜 張霞

（山東省花生研究所，青島 266100）

花生（Arachis hypogaea）在全球100 多個(gè)國家都有種植，中國、印度、尼日利亞花生產(chǎn)量位居前3 位［1］。花生為人們提供珍貴的食用油和蛋白質(zhì)，是我國北方地區(qū)最主要的油料作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)不可或缺的位置［2］。然而，隨著種植模式和氣候的變化，在花生的整個(gè)生育期，花生真菌病害嚴(yán)重威脅花生的產(chǎn)量與品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)20%以上［3］。花生白絹?。⊿clerotium rolfsii）［4］和花生基腐?。‵usarium neocosmosporiellum）［5］為花生土傳性真菌病害，花生網(wǎng)斑?。≒homa arachidicola）［6］和花生輪斑?。ˋlternaria alternata）［7］為花生葉部病害。目前花生病害的防治主要依賴化學(xué)藥劑——?dú)⒕鷦?，但其大量使用?yán)重影響人類健康和土壤微生物系統(tǒng)的平衡［8］。拮抗微生物作為生防菌劑具有更好的環(huán)境友好性和可持續(xù)性［9］，因此高效拮抗生防菌的篩選與應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn)。

目前，在促進(jìn)花生生長和防治花生病害方面的生防菌主要為真菌和細(xì)菌，例如聯(lián)合接種緩生根瘤菌和木霉菌促進(jìn)了花生生長并增加了產(chǎn)量［10］。黏質(zhì)沙雷氏菌SerEW01 能夠抑制鐮刀菌菌絲的生長和孢子萌發(fā)，以及伏馬毒素的積累［11］。在可控條件和大田條件下，哈茨木霉CT306 和枯草芽孢桿菌CT104均能促進(jìn)花生生長和提高花生抗病性［12］。與真菌相比，生防細(xì)菌具有易培養(yǎng)、繁殖快等優(yōu)勢(shì)，因而在生防微生物中更受青睞。

從植物的根或根際分離的微生物能更好地適應(yīng)該作物，并可能更好地控制病害［13］。本研究從連作花生田中分離到一株生防菌株ZHX?7，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA、gyrB序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，測(cè)試其對(duì)4 種花生病原真菌的拮抗效果，并初步分析其拮抗因子，旨在為花生病害的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 花生冠腐病菌（Aspergillus niger）、白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、基腐病菌（Fusarium neocosmosporiellum）、網(wǎng)斑病菌（Phoma arachidicola）和輪斑病菌（Alternaria alternata），均由本研究室分離保存。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）ZHX?7 菌株由本研究室分離并保存在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.20374。

1.1.2 供試花生品種 本試驗(yàn)所用花生品種為花育33 號(hào)，由本單位培育保存。

1.1.3 供試土樣 山東萊西花生連作田的病、健株根際土壤樣品。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基（蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶）的配制參考董國菊［14］的方法。

1.2 方法

1.2.1 菌株ZHX?7 的分離與純化 生防菌株的分離參照張霞等［1］的方法。取萊西花生連作田的病、健株根際土壤樣品，加入無菌水中，充分振蕩混勻，靜置后對(duì)上清液進(jìn)行10 倍系列稀釋法，設(shè)置4 個(gè)濃度（10-2、10-3、10-4、10-5），每個(gè)濃度吸取150 μL分別涂于LB 平板上，3 次重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上出現(xiàn)細(xì)菌菌落時(shí)，噴施花生冠腐病菌孢子懸浮液。培養(yǎng)2 d 后，選取周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈的單菌落，在LB 平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。通過平板對(duì)峙試驗(yàn)［15］測(cè)定候選生防菌對(duì)冠腐病菌的拮抗效果，最終挑選了一株抑菌圈最大的菌株，命名為ZHX?7。

1.2.2 菌株ZHX?7 鑒定 觀察ZHX?7 在LB 平板上生長的菌落形態(tài)特征。采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取ZHX?7 基因組DNA，以此為模板進(jìn)行16S rDNA（27F: 5'?AGAGTTTGAT?CMTGGCTCAG?3', 1495R: 5'?TACGGYTACCTTGT?TACGACTT?3'）和gyrB（UP1SF: 5'?GAAGTCATCAT?GACCGTTCTGC?3', UP2SR: 5'?AGCAGGGTACGGAT?GTGCGAGCC?3'）序列的PCR 擴(kuò)增。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)PCR 產(chǎn)物測(cè)序，獲得的序列通過GenBank 進(jìn)行Blast 序列相似性分析，利用MEGA7.0 軟件基于16S rDNA 和gyrB序列構(gòu)建ZHX?7 的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株ZHX?7 菌懸液對(duì)4 種花生病原菌菌絲生長的抑制作用 參照張霞等［1］的方法。菌懸液的制備：挑取菌株ZHX?7 的單菌落于20 mL 液體LB中，28℃,150 r/min 振蕩培養(yǎng)14 h，5 000 r/min 離心10 min，棄上清，用無菌水重懸，獲得OD600為0.2的菌懸液。平板對(duì)峙試驗(yàn)：選取新活化長勢(shì)好的病原菌，打孔器打取直徑為5 mm 的菌餅，在PDA 平板中央放置該病原菌的菌餅，其兩側(cè)約22 mm 處各加菌株ZHX?7 的菌懸液10 μL，以等量無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)6 次，25℃恒溫培養(yǎng)。測(cè)量菌落直徑，采用菌絲生長速率法［16］計(jì)算抑菌率。

1.2.4 菌株ZHX?7 無菌發(fā)酵液對(duì)4 種花生病原菌菌絲生長的抑制作用 參照1.2.3 的方法搖菌 48 h，離心收集上清液，用0.22 μm 濾膜過濾得到無菌發(fā)酵液。將無菌發(fā)酵液以稀釋10 倍的比例與加熱冷卻至約50℃的PDA 培養(yǎng)基混合倒平板，在平板中央放置上述病原菌的菌餅，對(duì)照組則添加等量LB 培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)6 次，25℃培養(yǎng)，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.5 菌株ZHX?7 揮發(fā)性氣體對(duì)4 種花生病原菌菌絲生長的抑制作用 采用雙皿對(duì)扣法測(cè)定揮發(fā)性氣體的抑菌活性［17］。參照1.2.3 的方法制備菌株ZHX?7 的菌懸液，用牙簽于LB 培養(yǎng)基上劃線，PDA培養(yǎng)基中央放置病原菌的菌餅，每個(gè)處理重復(fù)6 次，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.6 次級(jí)代謝產(chǎn)物胞外酶的產(chǎn)生情況 在選擇性培養(yǎng)基（蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶）的平板中央分別滴加10 μL ZHX?7 菌懸液，28℃培養(yǎng)，觀察有無透明圈，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.2.7 菌株ZHX?7 有菌發(fā)酵液對(duì)花生生長和抗病性的影響 參照1.2.4 獲得有菌發(fā)酵液，選取培養(yǎng)20 d，大小一致的健康花生苗，用ZHX?7 的有菌發(fā)酵液灌根，每盆10 mL 原液，以等量LB 培養(yǎng)基作為對(duì)照，均稀釋至60 mL。對(duì)照和處理各12 盆，每盆3 株，重復(fù)3 次。繼續(xù)培養(yǎng)2 周后，對(duì)照和處理分別一分為二，一份取樣，測(cè)定植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量（105℃殺青30 min，75℃ 烘干至恒重）；另一份接種花生白絹病菌，每株花生接種10 粒布滿白絹病菌的燕麥粒，侵染2 周后取樣，統(tǒng)計(jì)花生的病情指數(shù)、死亡率?；ㄉ∏橹笖?shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)：無病斑；1 級(jí)：僅莖上有病斑，根系健康；2 級(jí)：莖和根系產(chǎn)生病斑，地上部正常；3 級(jí)：地上部出現(xiàn)萎蔫癥狀，主要表現(xiàn)為側(cè)枝萎蔫或枯死；4 級(jí)：主莖出現(xiàn)萎蔫或枯死的癥狀。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用Microsoft Office PowerPoint 作圖，并用新復(fù)極差法（Duncan’s 法）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑）/對(duì)照菌落增長直徑×100%

病情指數(shù)=∑（各級(jí)級(jí)值×各級(jí)病株數(shù)）/（最高級(jí)數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100

死亡率（%）=死亡株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 ZHX?7的分離與鑒定

通過平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選到9 株對(duì)花生冠腐病菌具有明顯拮抗作用的生防菌株，選取抑菌圈大的1株菌株（ZHX?7）（圖1?A）進(jìn)行后續(xù)研究。在LB平板上，ZHX?7 菌體呈淡黃色，菌落不透明，邊緣不整齊（圖1?B），初步確定該菌株屬于芽孢桿菌屬。

圖1 ZHX-7 對(duì)冠腐病菌的拮抗效果（A）及其菌落形態(tài)（B）Fig. 1 Antagonistic effect of ZHX-7 against A. niger（A）and its colony morphology（B）

通過PCR 擴(kuò)增獲得ZHX?7 的16S rDNA 和gyrB基因片段，經(jīng)測(cè)序、拼接得到兩個(gè)基因序列的有效長度分別為1 394 和1 079 bp，序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫（MZ474622、MZ484688） 進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，并基于16S rDNA 和gyrB基因序列用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）顯示，ZHX?7 與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensisSCGB 1聚在同一分支。綜上所述，根據(jù)菌株ZHX?7 的形態(tài)特征和16S rDNA、gyrB基因序列分析，將ZHX?7鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。

圖2 基于16S rDNA 和gyrB 序列的ZHX-7 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of ZXH-7 based on 16S rDNA and gyrB sequences

2.2 菌株ZHX?7菌懸液對(duì)4種花生病原真菌菌絲生長的影響

通過ZHX?7 菌懸液對(duì)花生白絹病菌、基腐病菌、網(wǎng)斑病菌和輪斑病菌的平板對(duì)峙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株ZHX?7 對(duì)這4 種花生病原真菌菌絲的生長均具有顯著的拮抗效果（圖3?A, B），抑菌率分別為64.40%、70.37%、77.43%和65.32%（圖3?C）。

圖3 ZHX-7 菌懸液對(duì)4 種病原真菌拮抗活性的測(cè)定Fig. 3 Determination of antagonistic activity of ZHX-7 bacterial suspension against four pathogens

2.3 菌株ZHX?7發(fā)酵液對(duì)4種花生病原真菌菌絲生長的影響

根據(jù)對(duì)4 種花生病原真菌在菌株ZHX?7 的無菌發(fā)酵液以稀釋10 倍的PDA 培養(yǎng)基上的生長情況統(tǒng)計(jì)分析，同對(duì)照相比，菌株ZHX?7 的無菌發(fā)酵液極顯著的抑制了花生4 種病原真菌菌絲的生長（圖4?A, B），表現(xiàn)為對(duì)花生白絹病菌、基腐病菌、網(wǎng)斑病菌和輪斑病菌菌絲的生長抑菌率分別為67.81%、52.16%、23.52%和69.93%（圖4?C）。

圖4 ZHX-7 無菌發(fā)酵液對(duì)4 種病原真菌生長的影響Fig. 4 Effects of ZHX-7 fermentation broth on the growth of four pathogens

2.4 菌株ZHX?7揮發(fā)性氣體對(duì)4種花生病原真菌菌絲生長的影響

菌株ZHX?7 揮發(fā)性氣體對(duì)4 種病原真菌菌絲生長具有不同程度的抑制作用（圖5?A, B），對(duì)花生白絹病菌和網(wǎng)斑病菌的抑制效果最為明顯，抑制率分別達(dá)到86.82%和81.70%，對(duì)花生基腐病菌和輪斑病菌的抑菌率分別為35.40%和44.19%（圖5?C）。

圖5 ZHX-7 揮發(fā)性氣體對(duì)4 種病原真菌的抑菌作用Fig. 5 Inhibitory effects of ZHX-7 volatiles against four pathogens

2.5 菌株ZHX?7胞外酶的產(chǎn)生情況

通過選擇性培養(yǎng)基測(cè)定了ZHX?7 胞外酶的活性，結(jié)果（圖6）顯示，ZHX?7 在蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶3 種選擇性培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生明顯且很大的透明圈，說明該菌株能夠分泌蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶，具備分解蛋白質(zhì)，纖維素和淀粉的能力。

圖6 菌株ZHX-7 次級(jí)代謝產(chǎn)物胞外酶的情況Fig. 6 Detection of ZHX-7 secondary metabolite extracellular enzyme activity

2.6 菌株ZHX?7菌懸液對(duì)花生生長和白絹病抗性的影響

通過促生試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株ZHX?7有菌發(fā)酵液處理的花生鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別增加31.24%、26.47%，表明菌株ZHX?7 的有菌發(fā)酵液能夠明顯促進(jìn)花育33 號(hào)植株的生長。此外，經(jīng)菌株ZHX?7 的有菌發(fā)酵液處理后，接種花生白絹病菌的病情指數(shù)顯著降低，死亡率降低67.65%，防效達(dá)到51.76%，表明菌株ZHX?7 的有菌發(fā)酵液能夠顯著提高花生對(duì)白絹病的抗性（表1）。

表1 ZHX-7 對(duì)花生生長及白絹病的防治效果Table1 Control effect of ZHX-7 on peanut growth and peanut Sclerotium blight

3 討論

由于人們對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的毒性及其對(duì)環(huán)境影響的關(guān)注，抗藥病原體的發(fā)展，農(nóng)藥禁令的不斷增加以及新農(nóng)藥登記數(shù)量的減少，嚴(yán)重影響化學(xué)防治在病害防治中的應(yīng)用，而生物防治作為替代品，已被普遍認(rèn)可，成為有害生物綜合治理的重要工具［18］。芽孢桿菌以其生長速度快、繁殖力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)以及抑菌活性廣等優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于防治植物病害［19-20］。近年來國內(nèi)外對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的研究越來越多，貝萊斯芽孢桿菌不僅對(duì)病原真菌白絹病菌［21］、黃曲霉［22］等具有拮抗活性，也能有效抑制黃瓜花葉病毒［23］以及番茄青枯病菌［24］等。

菌株ZHX?7 的菌懸液、發(fā)酵液和揮發(fā)性氣體對(duì)花生白絹病菌、基腐病菌、網(wǎng)斑病菌和輪斑病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中菌懸液的抑菌效果，網(wǎng)斑病菌 > 基腐病菌 > 輪斑病菌 > 白絹病菌；發(fā)酵液的抑菌效果，輪斑病菌 > 白絹病菌 > 基腐病菌 > 網(wǎng)斑病菌；揮發(fā)性氣體的抑菌效果，白絹病菌 > 網(wǎng)斑病菌 > 輪斑病菌 > 基腐病菌。可見菌懸液、發(fā)酵液和揮發(fā)性氣體對(duì)同一病原菌的抑菌效果存在差異，對(duì)不同病原菌的抑菌效果也沒有規(guī)律可循，但多途徑產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)提升了菌株ZHX?7 的綜合抑菌能力。ZHX?7 對(duì)白絹病菌的抑制效果優(yōu)于短小芽孢桿菌LX11［25］和暹羅芽孢桿菌ZHX?10［1］，對(duì)網(wǎng)斑病菌的抑菌效果要優(yōu)于菌株BP?1［26］。這表明，菌株ZHX?7 抗菌譜廣、抗菌途徑多樣、綜合抑菌能力強(qiáng)，是一株極具生防潛力的有益細(xì)菌。

貝萊斯芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，能夠產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，例如嗜鐵素、酶、揮發(fā)性有機(jī)化合物和脂肽［27-28］。ZHX?7 能夠產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶，纖維素酶是多數(shù)生防菌株的重要拮抗因子。研究表明生防菌綠色木霉（Trichoderma viride）產(chǎn)生的纖維素酶，對(duì)抑制瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）的菌絲生長具有重要作用［29］。真菌細(xì)胞壁10%的組成成分為蛋白質(zhì)及糖蛋白，蛋白酶可以降解細(xì)胞壁，使菌絲變形等，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物可能通過破壞病原菌的細(xì)胞壁來抑制病原菌的生長。通過初步測(cè)定拮抗因子，分析菌株ZHX?7 的生防機(jī)制，但主要拮抗物質(zhì)及生防機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

對(duì)于菌株ZHX?7 促生作用的研究發(fā)現(xiàn)，其作用后花生鮮重和干重均優(yōu)于對(duì)照組，表明ZHX?7 可以促進(jìn)植物的吸收，具有較好的促生作用，該促生效果與貝萊斯芽孢桿菌LDO2［22］類似，推測(cè)ZHX?7 基因組中可能存在一系列與植物生長促進(jìn)相關(guān)的基因或基因簇，包括鐵載體的合成、促進(jìn)生長的揮發(fā)性有機(jī)化合物和促進(jìn)生長激素的產(chǎn)生以及營養(yǎng)利用等。此外，菌株ZHX?7 有菌發(fā)酵液對(duì)白絹病的防治效果達(dá)51.76%，與貝萊斯芽孢桿菌LHSB1［21］類似。這一防治效果一方面是菌株ZHX?7 抑制白絹病菌的生長，另一方面可能是ZHX?7 激活植物體內(nèi)的防御酶活性，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，該推測(cè)還需進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證。

生防菌株ZHX?7 的篩選鑒定與應(yīng)用，為生物菌肥和生物農(nóng)藥的研發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)的資源。后期可進(jìn)一步對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并分離鑒定發(fā)酵液途徑和揮發(fā)性氣體途徑中抑菌活性產(chǎn)物的主要成分，以及探究貝萊斯芽孢桿菌ZHX?7 是否激活植物體內(nèi)的防御酶活性，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)植物抗病能力。

4 結(jié)論

本研究從花生連作田中分離得到1 株生防菌株ZHX?7，鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌。ZHX?7 對(duì)花生白絹病菌、基腐病菌、網(wǎng)斑病菌和輪斑病菌具有極顯著的拮抗活性，能夠產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶等，此外還能促進(jìn)花生生長，增強(qiáng)花生對(duì)白絹病的抗性。