黃瓜內(nèi)果皮汁液對(duì)種子萌發(fā)的影響

楊艷 莫雨杏 周祎 陳惠明 肖浪濤 王若仲

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128；2. 嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湛江524048；3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，長(zhǎng)沙 410125）

黃瓜（Cucumis sativusL.）為葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物，生長(zhǎng)周期短，一年兩種。我國(guó)主要以種植華南型黃瓜為主，但華南型黃瓜果實(shí)在高溫高濕環(huán)境下易發(fā)生胎萌（vivipary, VP），即種子在果實(shí)內(nèi)易萌發(fā)，胎萌的種子可嚴(yán)重影響制種產(chǎn)量和品質(zhì)［1-3］，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。胎萌黃瓜果實(shí)內(nèi)部汁液含量很少，未胎萌的存在大量汁液，生產(chǎn)上收瓜時(shí)常用其汁液浸泡種子防止萌發(fā)，但其抑制機(jī)制尚不清楚。因此，研究黃瓜內(nèi)果皮汁液影響種子萌發(fā)并探明其影響機(jī)制，對(duì)基于黃瓜來源的種子萌發(fā)抑制劑研發(fā)具有重要意義。

胚外部因素可影響種子氣體交換、水分吸收、胚中化學(xué)成分釋放和化學(xué)成分代謝等過程，進(jìn)而影響萌發(fā)［4-5］。種子外部的種皮和果皮可影響種子吸水、呼吸等過程［6-7］；滇重樓（Paris polyphylla Smithvar. yunnanensis（Franch.）Hand.?Mazz.）種皮可抑制種子萌發(fā)［8］；黃花蒿（Artemisia annuaL.）葉對(duì)狗尾巴草（Setaria viridis（L.）Beauv.）種子萌發(fā)具有明顯抑制作用［9］。除了這些固體因素可影響種子萌發(fā)，植物自身液體也可影響種子萌發(fā)。例如，銀杏（Ginkgo bilobaL.）外種皮汁液高濃度時(shí)可降低可溶性糖和可溶性蛋白含量，進(jìn)而抑制小麥（Triticum aestivumL.）種子萌發(fā)［10］；西洋參（Panax quinquefoliusL.）果汁可有效抑制種子萌發(fā)［11］；20-30 g/L 香蔥（Allium cepiformeG. Don）水浸提液可促進(jìn)草莓種子萌發(fā)［12］；少花龍葵（Solanum americanumMill.）果汁原液抑制小白菜（Brassica campestrisL. ssp.chinensisMakino var.communisTsen et Lee）種子萌發(fā)，稀釋20-50 倍后其抑制作用才解除［13］；西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai）汁可抑制其瓜籽萌發(fā)［14］。番茄（Solanum lycopersicumL.）、石榴（Punica granatumL.）、芒果（Mangifera indicaL.）、楊桃（Averrhoa carambolaL.）、檸檬（Citrus×limon（Linnaeus）Osbeck）、葡萄（Vitis viniferaL.）等汁液濃度高于8%時(shí)，番茄種子萌發(fā)率降低，當(dāng)濃度低于8%時(shí)，這些汁液均能顯著提高番茄種子的萌發(fā)率；而蘋果（Malus pumilaMill.）和李子（Prunus salicinaLindl.）果汁濃度高于8%則能很好地促進(jìn)番茄種子萌發(fā)［15］。顯然，這些胚外部位存在影響種子萌發(fā)的化學(xué)成分。此外，植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellins，GAs）在調(diào)控種子萌發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用［16-17］。在植物果皮、種皮、葉和汁液等部位均存在植物激素ABA 和GAs。研究表明，ABA 具有抑制種子萌發(fā)的作用［18］，ABA 合成基因NCED1和NCED2和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CsPYL2、CsPP2C2和CsSnRK2以及代謝基因CsCYP707As等均與種子萌發(fā)相關(guān)［19-20］。經(jīng)研究證實(shí)，黃瓜葉片水浸提液對(duì)其種子萌發(fā)具有抑制作用，且浸提液濃度越高抑制作用越明顯［21］。

黃瓜內(nèi)果皮汁液在種子萌發(fā)方面的功效及機(jī)制鮮有報(bào)道，且大部分研究在胚外因素影響種子萌發(fā)方面主要簡(jiǎn)單分析一些發(fā)芽速度、整齊度等指標(biāo)，較少涉及與ABA 相關(guān)基因方面的復(fù)雜分析。

本研究以難胎萌黃瓜（M?H）內(nèi)果皮汁液處理易胎萌黃瓜（C?L）種子，測(cè)定和分析種子萌發(fā)過程中相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化，探究汁液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響及其機(jī)制，同時(shí)為基于黃瓜來源的種子萌發(fā)抑制劑研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

難胎萌（M?H）和易胎萌（C?L）黃瓜品種由湖南省蔬菜研究所陳惠明研究員提供，2021 年種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室智能大棚。

取樣方法：分別采摘授粉后第40 和50 天黃瓜果實(shí)各5 個(gè)，縱向剖開果實(shí)后分別收集內(nèi)果皮汁液、種子各3 份，重復(fù)3 次取樣；汁液經(jīng)液氮處理后?80℃保存?zhèn)溆?，鮮種子去掉外部黏液質(zhì)后進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，剩余種子風(fēng)干后?4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)

1.2.1.1 汁液對(duì)種子萌發(fā)的影響 取175 g M?H 汁液4 000 r/min 離心5 min，其中50 g 上清液加蒸餾水稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的培養(yǎng)液，剩余的100 g 上清液直接培養(yǎng)C?L 種子。種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)時(shí)間分別為20 和25 h，每個(gè)處理5 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 粒種子，均置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中。

式中，S：供試種子總數(shù)；N：萌發(fā)種子總數(shù)。

1.2.1.2 汁液提取液對(duì)種子萌發(fā)的影響 20 g 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的上清液經(jīng)95%乙醇提取3 次，乙醇相浸膏再依次通過石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次后，分別得到石油醚相浸膏1.81 g、乙酸乙酯相浸膏1.49 g、正丁醇相浸膏2.15 g，余下水相浸膏10 g，最后各浸膏加蒸餾水稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的培養(yǎng)液。各培養(yǎng)液分別處理C?L 種子。種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)時(shí)間分別為16、21 和26 h，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 粒種子，均置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2 汁液化學(xué)成分分析 分別稱取C?L、M?H 黏液質(zhì)和汁液55 mg，黏液質(zhì)經(jīng)液氮研磨并冷凍干燥成白色粉末，2 個(gè)樣品分別加入5 mL 甲醇于20℃超聲提取30 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液真空濃縮干燥，100% HPLC 甲醇復(fù)溶，過0.22 μm 有機(jī)膜并于4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂冒步輦?550 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分分析。進(jìn)樣條件：正離子模式，進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相：A（0.1% Fa?H2O）、B（acetonitrile），流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣時(shí)間35min，分析條件見表1。

1.2.3 可溶性糖含量的測(cè)定 選取20 mg 新鮮種子磨碎，加入5 mL 蒸餾水并水浴60 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘?jiān)?jīng)熱水洗滌數(shù)次，離心合并上清液并定容至刻度線，取100 μL 樣品提取液，采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量［22］。

1.2.4 植物激素ABA 和GA 含量測(cè)定 采用植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的高效液相色譜法（HPLC 法）測(cè)定ABA 和GA 含量。取保存于?80℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%汁液和蒸餾水處理的種子加入液氮迅速研磨至粉末狀，編號(hào)，分別稱取粉末狀樣品200 和100 mg，重復(fù)3 次；80%甲醇4℃超聲，混勻后置于4℃浸提12 h，重復(fù)浸提一次并合并上清液，真空濃縮干燥后備用，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.5 基因表達(dá)分析 選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%汁液和蒸餾水處理的種子對(duì)ABA 合成基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、代謝基因等生化指標(biāo)進(jìn)行分析。在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載黃瓜ABA 合成基因CsNCED1（LOC1012?14535）和CsNCED2（LOC101219505）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CsPYL2（LOC101214314）、CsPP2C2，參考玉米和擬南芥基因CYP707A1、SnRK2并運(yùn)用DNAMAN的序列比對(duì)功能，在黃瓜中分析克隆到與玉米或擬南芥高度同源的基因片段序列，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)長(zhǎng)度在18-22 bp 的qPCR 擴(kuò)增引物（表2）。

表2 相關(guān)基因及qPCR 引物Table 2 Related genes and qPCR primers

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%汁液和蒸餾水處理5、10、15、20 和25 h 后的種子，利用RNA 提取試劑盒（Trans ZolTM Up Plus RNA Kit）提取其總RNA。RNA 濃度經(jīng)多功能酶標(biāo)儀（Tecan?Spark）檢測(cè)后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以黃瓜Actin為內(nèi)參基因（AB010922.1），以合成的cDNA 為模板，利用qPCR（BIO?RAD T100TMT hermal cycler） 檢測(cè)基因CsNCED1、CsNCED2、CsYP707A1、CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2的表達(dá)情況。反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)基因的表達(dá)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)體系如表3所示。

表3 反應(yīng)體系Table 3 Reaction system

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Origin 和Excel 2010軟件進(jìn)行作圖和制表。

2 結(jié)果

2.1 黃瓜胎萌性狀觀察

分別從授粉后不同時(shí)期的C?L、M?H 植株上摘取新鮮黃瓜，縱向剖開后觀察其內(nèi)部種子萌發(fā)情況。C?L 黃瓜果實(shí)授粉35 d 后胎萌情況輕，將瓜內(nèi)未萌發(fā)的種子取出后，置于無水狀態(tài)下12 h 后大量萌發(fā)（圖1?F）；C?L 黃瓜果實(shí)授粉50 d 后胎萌情況嚴(yán)重，內(nèi)果皮汁液大量減少，瓜內(nèi)種子已全部萌發(fā)，部分高達(dá)5.80 cm 長(zhǎng)的綠色幼苗突破外果皮（圖1?A-B和圖1?E）。M?H 果實(shí)種子未出現(xiàn)胎萌現(xiàn)象，在授粉50 d后其內(nèi)部仍存在大量汁液（圖1?C-D）。由此可見，難胎萌的M?H 果實(shí)內(nèi)部汁液可能存在抑制種子萌發(fā)的化學(xué)成分，因此后續(xù)將其汁液作為處理用的材料。

圖1 黃瓜果實(shí)胎萌表型Fig. 1 Viviparous phenotypes of cucumber fruits

2.2 汁液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響

為探究M?H 汁液是否抑制C?L 種子萌發(fā)，分別選取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的M?H 汁液處理C?L 種子。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%汁液在20 h 對(duì)種子的抑制率為73%，比對(duì)照高23%；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的汁液完全抑制種子萌發(fā)，抑制率一直為100%；同時(shí)種子胚根長(zhǎng)度隨著汁液質(zhì)量分?jǐn)?shù)變高而變短（圖2 和圖3）。

圖2 汁液處理的黃瓜種子萌發(fā)表型Fig. 2 Germination phenotypes of cucumber seeds treated with juice

圖3 汁液處理的黃瓜種子萌發(fā)率Fig. 3 Germination rate of cucumber seeds treated with juice

2.3 汁液提取液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響

為進(jìn)一步確證汁液中是否存在抑制種子萌發(fā)的化學(xué)成分，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為3%汁液提取液處理C?L 種子（圖4 和圖5），乙醇相、正丁醇相化學(xué)成分在種子整個(gè)萌發(fā)過程中均呈現(xiàn)抑制作用。乙醇相16、21 和26 h 抑制率分別比對(duì)照高3.34%、11.11%和12.22%；乙醇相16、21 和26 h 抑制率分別比乙酸乙酯相高17.78%、14.44% 和11.11%。正丁醇相16、21 和26 h 抑制率分別比對(duì)照高47.23%、46.67%和47.77%；正丁醇相16、21 和26 h 抑制率分別比乙酸乙酯相高61.67%、50%和46.33%。乙酸乙酯相化學(xué)成分在種子萌發(fā)16 h 呈現(xiàn)促進(jìn)作用，萌發(fā)率比對(duì)照高14.44%，21 和26 h 萌發(fā)率與對(duì)照差異不明顯。石油醚相和水相在整個(gè)萌發(fā)過程中對(duì)種子萌發(fā)影響較小?？梢姡S瓜內(nèi)果皮汁液中存在抑種子萌發(fā)的化學(xué)成分。

圖4 汁液提取液處理的黃瓜種子萌發(fā)表型Fig. 4 Germination phenotypes of cucumber seeds treated with the extracts of juice

圖5 汁液提取液處理的黃瓜種子萌發(fā)率Fig. 5 Germination rates of cucumber seeds treated with the extracts of juice

2.4 汁液化學(xué)成分分析

汁液經(jīng)UPLC?Q?TOF?MS 分析后共得到32 個(gè)化合物（圖6 和表4），主要為有機(jī)酸、氨基酸、醇類、醛類、酮類和醚類等，其中棕櫚酸、肉豆蔻酸、檸檬酸、組氨酸等均可影響種子萌發(fā)。

圖6 汁液提取液LC-Q-TOF-MS 檢測(cè)的正離子模式總離子流圖Fig. 6 Total ion chromatogram of positive ion mode detected by LC-Q-TOF-MS of juice extract

表4 汁液化學(xué)成分Table 4 Compounds of juice

2.5 汁液處理下黃瓜種子生理指標(biāo)的變化

2.5.1 可溶性糖含量的變化 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%汁液處理的干種子吸脹至10 h 可溶性糖含量下降至4.21%，比對(duì)照（蒸餾水）減少0.43%；萌發(fā)15-25 h，其可溶性糖含量比對(duì)照高但變化不大。對(duì)照種子可溶性糖含量變化明顯，種子吸脹至5 h 其可溶性糖含量減少至4.28%，10 h 較15 h 增加0.29%，15 h較10 h 減少0.87%，20 h 較15 h 增加0.1%，25 h 較20 h 減少0.29%（圖7）。可見，汁液處理的種子在萌發(fā)過程中可溶性糖代謝不活躍。

圖7 黃瓜種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量變化Fig. 7 Changes of soluble sugar contents in cucumber seeds during germination

2.5.2 ABA 和GA3含量的變化 種子萌發(fā)后2 個(gè)處理的ABA 含量均減少，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%汁液處理的種子萌發(fā)5-25 h ABA 含量均比對(duì)照（蒸餾水）高，其含量分別增加了96.39%、22.67%、73.49%、94.85%和13.59%（圖8?A）。汁液處理的種子在吸脹0-10 h，GA3含量分別比對(duì)照低12.83%和22.23%，15-25 h 時(shí)，其GA3含量分別比對(duì)照高32.27%和43.57%（圖8?B）。通過比較ABA 和GA3的含量（圖8?C），結(jié)果表明，汁液處理的種子0-20 h ABA/GA3均顯著高于對(duì)照，分別為125%、58.21%、73.14%和47.12%。說明質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%汁液處理的種子未萌發(fā)可能是由較高的ABA/GA3造成的。

圖8 黃瓜種子萌發(fā)過程中ABA 和GA3 的含量Fig. 8 ABA and GA3 contents in cucumber seeds during germination

2.6 汁液處理下黃瓜種子ABA相關(guān)基因的變化

2.6.1 ABA 合成基因表達(dá)量的變化 質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%汁液處理的黃瓜種子ABA 含量較高，但是否與其合成酶基因CsNCED1和CsNCED2存在聯(lián)系尚不清楚。種子萌發(fā)過程中CsNCED1和CsNCED2表達(dá)量總體呈下降趨勢(shì)，但在汁液和對(duì)照（蒸餾水）中存在差異。汁液處理的種子在10 和15 hCsNCED1表達(dá)量分別比對(duì)照顯著增加1.19 倍和2.65 倍（圖9?A）。汁液和對(duì)照處理的種子CsNCED2在吸脹0-5 h 表達(dá)量均減少且降到最低；5-10 h 兩個(gè)處理的CsNCED2表達(dá)量增加；15-25 h 汁液處理的CsNCED2表達(dá)量分別比對(duì)照顯著增加5.28、2.11 和4.35 倍（圖9?B）?？梢?，汁液處理的種子ABA 含量上升與CsNCED1和CsNCED2表達(dá)量增加有關(guān)。

圖9 黃瓜種子萌發(fā)過程中ABA 合成基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 9 Relative expressions of ABA synthesis genes during cucumber seed germination

2.6.2 ABA 代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)量的變化 為探究汁液如何調(diào)節(jié)ABA 代謝進(jìn)而影響黃瓜種子萌發(fā)，進(jìn)一步分析比較了在萌發(fā)過程中，汁液處理和對(duì)照（蒸餾水）處理的種子ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及代謝途徑基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，汁液處理的種子ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2和代謝基因CsYP707A1的表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且均在20 h 表達(dá)量最高。種子萌發(fā)5 h 和15-25 h 時(shí)，CsYP707A1表達(dá)量分別比對(duì)照顯著增加9.42、0.77、4.91 和2.70 倍，10 h 時(shí)較對(duì)照降低63.73%（圖10?A）；5-25 h 時(shí)，汁液處理的CsPYL2表達(dá)量分別比對(duì)照顯著增加0.79、2.68、4.78、15.98和3.86 倍（圖10?B）；10-25 h 時(shí)CsPP2C2表達(dá)量分別比對(duì)照顯著增加1.11、0.61、3.58 和1.71 倍（圖10?C）；10-25 h 時(shí)CsSnRK2表達(dá)量分別比對(duì)照顯著增加2.09、3.33、11.47 和4.02 倍（圖10?D）。結(jié)果表明，汁液可誘導(dǎo)ABA 代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)上調(diào)。

圖10 黃瓜種子萌發(fā)過程中ABA 代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 10 Relative expressions of ABA metabolism and signaling pathway genes during cucumber seed germination

3 討論

3.1 汁液處理下黃瓜種子萌發(fā)的生理差異分析

C?L 種子通過M?H 汁液處理后，其萌發(fā)率均較對(duì)照低，且抑制作用隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高而變強(qiáng)，這和肉桂酸抑制‘定豌10 號(hào)’種子萌發(fā)且抑制作用隨著其濃度上升而變強(qiáng)的結(jié)果一致［23］，也證明黃瓜內(nèi)果皮汁液可有效抑制黃瓜種子萌發(fā)?？扇苄蕴菫榉N子萌發(fā)提供主要能量，其變化趨勢(shì)可反映種子在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的活性情況［24］。當(dāng)汁液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，其處理的種子萌發(fā)率一直維持為零，可溶性糖含量在吸脹0-10 h 時(shí)均比對(duì)照低，后期變化較小，對(duì)照種子在整個(gè)萌發(fā)過程中可溶性糖含量變化較大，原因是種子吸脹前8 h 為快速吸水期，此時(shí)可溶性糖的轉(zhuǎn)化已被啟動(dòng)，蔗糖需要轉(zhuǎn)化為葡萄糖、果糖等單糖為萌發(fā)提供能量［25］，而汁液處理的種子在同時(shí)期并未出現(xiàn)相同的趨勢(shì)。此外，汁液經(jīng)不同化學(xué)試劑提取后，乙醇相、正丁醇相在種子整個(gè)萌發(fā)過程中都呈現(xiàn)抑制作用，尤其正丁醇相抑制作用最強(qiáng)，這和Barh 等［15］研究結(jié)果一致。由此可見，汁液中的一些化學(xué)成分可能阻礙可溶性糖發(fā)生轉(zhuǎn)化，使種子不能利用正常形式的單糖提供能量，從而不能順利萌發(fā)。

3.2 汁液化學(xué)成分影響種子萌發(fā)

化感物質(zhì)是指植物自身產(chǎn)生并且能夠影響周圍其他植物生長(zhǎng)發(fā)育過程的一類化學(xué)成分，其主要應(yīng)用于雜草防治和種子萌發(fā)方面?；形镔|(zhì)因化感作用所產(chǎn)生，主要為次生代謝物，汁液中存在的肉豆蔻酸、棕櫚酸、檸檬酸均為典型的化感物質(zhì)［26］，它們均對(duì)種子萌發(fā)具有抑制作用［27-28］。此外，隸屬氨基酸的組氨酸也可影響種子萌發(fā)，番茄種子在較低濃度組氨酸處理下可提高種子萌發(fā)率［29］。當(dāng)然，汁液中還存在一些其他有機(jī)酸類，例如己酸、己二酸等，它們?cè)诜N子萌發(fā)方面的功效尚待探究。種子經(jīng)汁液處理后萌發(fā)率顯著降低，這可能與肉豆蔻酸、棕櫚酸、檸檬酸等化學(xué)成分有關(guān)。

3.3 汁液處理下植物激素ABA相關(guān)基因表達(dá)分析

種子萌發(fā)過程中ABA 含量增加與其合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及分解代謝途徑基因有著密切的關(guān)系。汁液處理的黃瓜種子ABA 含量比對(duì)照高且呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，這和王慰親［30］、胡琦娟［31］和Frey 等［32］研究結(jié)果一致。NCED1和NCED2是控制ABA 生物合成的關(guān)鍵基因，這兩個(gè)基因的表達(dá)量在種子萌發(fā)過程中出現(xiàn)上升趨勢(shì)，證明黃瓜種子中ABA 含量增加與這兩個(gè)基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2表達(dá)量增加，這和干旱條件下黃瓜幼苗ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2表達(dá)上調(diào)和ABA 大量增加的結(jié)果一致［33］，這說明ABA 含量增加與這3 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)量增加有關(guān)。此外，汁液處理后ABA 代謝基因CsCYP707A1表達(dá)量增加，這與CsCYP707A1、AtCYP707A2在種子萌發(fā)過程中被外源ABA 誘導(dǎo)促使其表達(dá)上調(diào)［20,34］和擬南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）種子吸脹24 h 后CYP707A1表達(dá)量增加［35］的研究結(jié)果相似。CYP707A2主要負(fù)責(zé)種子休眠釋放和萌發(fā)過程中ABA 降解，雖然CYP707A1也參與種子中ABA 的分解代謝，然而它在打破休眠中的作用很?。?6］?；谶@些研究，本文表明汁液處理的種子CsCYP707A1表達(dá)量雖高，但其編碼的酶不足以分解汁液誘導(dǎo)增加的ABA，因此種子并未萌發(fā)。此外，ABA 合成基因CsNCED2與代謝基因CsCYP707A1和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2有著一致的表達(dá)趨勢(shì)，說明CsNCED2與這4個(gè)基因關(guān)系密切。大麥（Hordeum vulgareL.）HvNCED2在ABA 生物合成和防止采前發(fā)芽方面比HvNCED1發(fā)揮更重要的作用［36］，本研究所用材料為易胎萌黃瓜品種種子，CsNCED2可能與HvNCED2發(fā)揮相似的作用。由此可見，高濃度汁液處理種子可上調(diào)ABA 合成、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ABA 合成和抑制種子萌發(fā)。

4 結(jié)論

難胎萌黃瓜（M?H）內(nèi)果皮汁液及其乙醇和正丁醇提取液均抑制易胎萌黃瓜（C?L）種子萌發(fā)。在M?H 內(nèi)果皮汁液中鑒定到4 種影響種子萌發(fā)的化學(xué)成分：肉豆蔻酸、棕櫚酸、檸檬酸和組氨酸，它們可能促使ABA 合成基因CsNCED2及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因CsPYL2、CsPP2C2、CsSnRK2表達(dá)量增加，進(jìn)而提高ABA 含量，同時(shí)阻礙可溶性糖代謝，從而有效降低C?L 種子萌發(fā)率。