非天然氨基酸的應(yīng)用及生物合成策略

李海寧 張紅兵 耿革霞 李冉 賈振華

（1. 河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050062；2. 河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；3. 河北省藥品職業(yè)化檢查員總隊，石家莊 050000）

蛋白質(zhì)在細胞的生理過程中發(fā)揮著重要的作用，它們可以催化生物反應(yīng)，調(diào)節(jié)基因表達和免疫反應(yīng)，提供結(jié)構(gòu)框架，調(diào)節(jié)運輸系統(tǒng)等［1］。蛋白質(zhì)通常由20 種天然氨基酸組成的，這些氨基酸具有不同的功能基團。然而，20 種天然氨基酸的功能基團數(shù)量和種類有限，不能滿足化學(xué)、生物科學(xué)研究和應(yīng)用中對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的多樣化需求。非天然氨基酸（unnatural amino acids，UAAs）由于其獨特的功能基團和化學(xué)性質(zhì)常被插入蛋白質(zhì)中用來賦予蛋白質(zhì)更高的活性和穩(wěn)定性、作為蛋白質(zhì)探針探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、合成抗菌藥物等。如Curnew 等［2］利用特定的正交系統(tǒng)將熒光性UAAs 插入丙型肝炎病毒的核心蛋白中，在不影響蛋白活性的情況下，實現(xiàn)蛋白的可視化。Salehi 等［3］設(shè)計合成了一種含有二苯丙氨酸的細胞穿透性多肽DipR5 可以與抗癌藥物如阿霉素、喜樹堿和姜黃素等結(jié)合使用，從而達到抗癌抗腫瘤目的。由于UAAs 廣闊的應(yīng)用前景，研究人員不斷嘗試開發(fā)和改進UAAs 的合成技術(shù)。目前UAAs 主要通過化學(xué)合成法生產(chǎn)，但化學(xué)合成存在污染嚴重、反應(yīng)步驟復(fù)雜、生產(chǎn)成本高和對映體選擇性差等缺點，限制了UAAs 的規(guī)模化生產(chǎn)。近年來，隨著生物技術(shù)的不斷變革和對環(huán)境的保護意識的增強，生物合成以其綠色高效、反應(yīng)條件溫和、成本低、產(chǎn)率高等諸多優(yōu)點得到廣泛關(guān)注。同時，隨著代謝工程和合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，微生物細胞工廠為UAAs 的生物合成及規(guī)?；a(chǎn)提供了有效策略。

本文主要介紹了UAAs 在蛋白質(zhì)中的應(yīng)用領(lǐng)域，通過它們在蛋白質(zhì)探針、酶工程、多肽藥物和其他領(lǐng)域成功應(yīng)用的實例展示了UAAs 的生物合成和應(yīng)用價值，同時論述了基于代謝工程的UAAs 的生物合成策略，最后展望了在合成生物技術(shù)時代UAAs生物合成與應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展前景。

1 非天然氨基酸的應(yīng)用

1.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能探針

蛋白質(zhì)是生命活動存在的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與運輸、催化、調(diào)節(jié)等多種生命過程。定位蛋白質(zhì)在體內(nèi)分布，探究未知蛋白質(zhì)之間的相互作用以及研究蛋白質(zhì)的序列與結(jié)構(gòu)功能關(guān)系等對揭示生命活動至關(guān)重要。

核磁共振（NMR）是一種常用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法。它可以獲得蛋白質(zhì)高分辨率結(jié)構(gòu)，也可以廣泛用于研究蛋白質(zhì)在離體和細胞內(nèi)構(gòu)象和相互作用機制。但是，對于大分子量蛋白質(zhì)，NMR 面臨著信號峰過多、信號峰展寬、分辨率較低等問題，這些問題會影響構(gòu)象信息的獲取。為了解決這些問題，一種有效的方法是利用UAAs 進行定點標記，該方法可以顯著減少信號數(shù)目，提高NMR 信號強度，降低數(shù)據(jù)采集和分析難度［4］。其中，含氟UAAs 是比較理想的NMR 觀測對象，因為自然界中氟原子和氫原子具有相似的共價半徑、強烈的NMR 信號、無背景信號干擾，并且對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較小［5］。通過在蛋白質(zhì)的關(guān)鍵位點引入含氟原子UAAs，并觀測其在蛋白質(zhì)中的NMR 信號，可以獲取蛋白質(zhì)在相關(guān)生命活動中的構(gòu)象變化信息［4］。例如，將（2S,4S）?5?氟亮氨酸摻入乳桿菌的二氫葉酸（DHFR）中，這是第一個將含氟脂肪族氨基酸用作19F NMR 探針的例子，為含氟UAAs 作為NMR 探針分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能開辟了新視角。另一個常用的含氟UAAs 是三氟甲基苯丙氨酸（tfmF），它能夠被特異性引入到蛋白質(zhì)的特定位點，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的位點特異性動態(tài)分析。Shi 等［6］應(yīng)用19F 標記的tfmF 實現(xiàn)蛋白質(zhì)的定點同位素標記，并結(jié)合NMR 方法研究了水溶性蛋白vinexinSH3 結(jié)構(gòu)域和膜蛋白DAGK 的定點標記和動力學(xué)分析。同時還運用了19F tfmF 實現(xiàn)了大腸桿菌酪氨酸激酶的原位NMR 分析。

除了NMR 標記，熒光標記也是一種常見的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能探針。熒光標記也有助于探究生物大分子在細胞環(huán)境中的動態(tài)過程，實現(xiàn)細胞內(nèi)生理過程的可視化。一些帶有特殊官能團的UAAs 可以在不影響蛋白質(zhì)性質(zhì)的前提下標記蛋白質(zhì)，為研究蛋白質(zhì)的功能、構(gòu)象變化及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位開辟了一條有效的途徑。例如，通過引入熒光非天然氨基酸和融合發(fā)光蛋白，可以設(shè)計合成新型發(fā)光蛋白質(zhì)探針。Yamaguchi 等［7］將熒光素酶作為Bret 供體，融合到麥芽糖結(jié)合蛋白的C 末端，并將BODIPY558 氨基苯丙氨酸插入到麥芽糖結(jié)合蛋白的結(jié)合位點附近的Tyr210 位點，作為Bret 受體。當加入麥芽糖后，熒光素酶和BODIPY558 的發(fā)射強度比提高了4.0 倍。這種通過融合發(fā)光蛋白和熒光非天然氨基酸合成的新型BRET/FRET 蛋白質(zhì)探針，可以作為特定配體的生物成像和診斷檢測的有價值的工具。另一種有用的UAAs 是光交聯(lián)型非天然氨基酸，它們能夠與鄰近的氨基酸殘基產(chǎn)生反應(yīng)，實現(xiàn)光的交聯(lián)反應(yīng)。這種交聯(lián)反應(yīng)可用來觀測動態(tài)變化的蛋白質(zhì)相互作用和設(shè)計功能蛋白質(zhì)，有助于生物過程的研究和可控的藥物設(shè)計［8］。Chin 等［9］將光交聯(lián)非天然氨基酸對苯甲酰基?L?苯丙氨酸（pBpa）插入蛋白質(zhì)中，在紫外光激發(fā)下，pBpa 的二苯甲酮基團會與附近的C?H 鍵發(fā)生交聯(lián)，從而可以確定該氨基酸附近相互作用的伴侶蛋白信息。

1.2 提高酶催化活性和穩(wěn)定性

酶是一種有效的生物催化劑，能夠以高效率和選擇性促進化學(xué)反應(yīng)，近幾十年來在制藥、食品加工、生物燃料生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多，需求也隨之增長［1］。然而，天然酶作為生物催化劑的一個主要挑戰(zhàn)在于難以在惡劣條件下保持酶的穩(wěn)定性和最佳活性，因此在酶工程中，提高酶活性、立體選擇性、穩(wěn)定性、底物范圍和開發(fā)獨特功能是主要的目標。傳統(tǒng)上，酶工程主要由理性設(shè)計、定向進化和半理性設(shè)計三種策略來改善酶催化性能和穩(wěn)定性，雖然取得了一定進展，但這種方法也僅僅局限于20 個天然氨基酸的使用。利用遺傳密碼擴展技術(shù)，將UAAs 以位點特異性或殘基特異性的方式插入蛋白質(zhì)中，突破了20 個天然氨基酸的限制，可以有效改善酶的性能，提高酶活性和穩(wěn)定性［10］。

UAAs 在酶工程中的應(yīng)用有兩個方面引人矚目，一是對酶催化活性的提升，UAAs 可以通過改變蛋白質(zhì)的立體構(gòu)象、電子分布、親疏水性等因素，影響酶活性中心的形成和底物結(jié)合能力，從而提升酶活性。例如，磷酸三酯酶（PTE）可有效水解農(nóng)藥中的有機磷，為了突破其催化效率，Ugwumba 等［11］用L?（7?羥基香豆素?4?基）乙基甘氨酸替換PTE中的Tyr309，發(fā)現(xiàn)PTE 的催化效率提高了8-11倍。這是因為L?（7?羥基香豆素?4?基）乙基甘氨酸與產(chǎn)物側(cè)鏈都帶有負電荷，形成了較強的靜電斥力。另一個常用于提升酶活性的UAAs 是對甲酰苯丙氨酸（pBzF4）。Li 等［12］在2018 年的研究中，用PBzF4 取代大腸桿菌高絲氨酸O?琥珀?；D(zhuǎn)移酶中的Phe21，使Km顯著增加。轉(zhuǎn)氨酶（TAMs）是有機合成中最有前途的手性氨基化合物的生物催化劑之一，將對苯甲酰苯丙氨酸（pBzF4）引入（R）?TAM活性中心的Phe88 殘基處，可以顯著提高酶活性［13］。二是對酶穩(wěn)定性的增強，UAAs 可以通過增強蛋白質(zhì)內(nèi)部或外部的相互作用力，提高蛋白質(zhì)對溫度、pH、有機溶劑等因素的抵抗能力，從而增強酶穩(wěn)定性。例如，鹵化非天然氨基酸，特別是氟化非天然氨基酸，除被用作蛋白質(zhì)探針外，還經(jīng)常被用于插入蛋白質(zhì)中增強酶的催化活性和穩(wěn)定性。這是因為鹵原子可以形成鹵鍵，從而增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和溶劑穩(wěn)定性。谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）是一種解毒酶，它能將一分子谷胱甘肽與化合物偶聯(lián)，促進其降解［10］。Parson 等［14］將大鼠GST 的4 個色氨酸殘基全部替換為5?氟色氨酸，結(jié)果表明，與未發(fā)生改變的GST 相比，Kcat增加了4 倍，Kcat/Km增加了兩倍。將3?氯酪氨酸和3?溴酪氨酸分別插入GST 中，結(jié)果顯示含有3?氯酪氨酸的GST 具有更高的熱穩(wěn)定性。將對氟苯丙氨酸插入PTE 中，通過實驗發(fā)現(xiàn)插入對氟苯丙氨酸的PTE 表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性，并且在65℃時仍具有顯著的活性。同樣地，將含氟非天然氨基酸如4?氟苯丙氨酸、5?氟色氨酸、3?氟酪氨酸對來自南極洲假絲酵母脂肪酶的芳香族殘基進行特異性氟化，結(jié)果表明該脂肪酶的活性周期也得到了延長。此外，將UAAs 引入金屬酶中金屬螯合的關(guān)鍵配體位置，也可以顯著改變催化性能。例如，N-δ-甲基組氨酸被結(jié)合到幾種金屬酶中，以增強其活性。N-δ-甲基組氨酸作為肌紅蛋白（Mb）中血紅素的近端配體，可以導(dǎo)致血紅素氧化還原電位和活性顯著增加［15］。同樣地，將N-δ-甲基組氨酸加入到修飾的抗壞血酸過氧化物酶中，也可以顯著提高抗壞血酸過氧化物酶的催化活性。

UAAs 已在酶工程中得到廣泛應(yīng)用，但其發(fā)展仍受到眾多因素限制，如大量UAAs 的合成路線復(fù)雜且成本高等，因此需要進一步尋找和發(fā)展更高效的創(chuàng)新方法，使UAAs 得到更廣泛應(yīng)用，創(chuàng)造出更多更穩(wěn)定、更活躍、更具有化學(xué)功能的酶。

1.3 抗體藥物偶聯(lián)物（antibody?drug conjugates,ADC）

抗體是體內(nèi)獲得性免疫應(yīng)答的重要組成部分，對抗原具有優(yōu)異的識別特異性和親和力［16］?？贵w藥物偶聯(lián)物是一種將抗體與其他毒性小分子或者治療性藥物通過一定方式連接到一起的復(fù)合物。該藥物的原理是利用抗體部分特異性結(jié)合靶細胞表位的抗原，將高活性細胞毒藥物運送到靶細胞內(nèi)，釋放細胞毒藥物，阻止細胞分裂，達到殺死腫瘤細胞的目的，如圖1 所示。該產(chǎn)品可有效提高藥物的靶向性，實現(xiàn)向腫瘤等病灶組織精確遞藥，降低藥物毒副作用，因此近幾年備受青睞，成為研究熱點。UAAs 因其獨特的正交偶聯(lián)性、部位特異性和低毒性被廣泛應(yīng)用于ADC 生產(chǎn)，并產(chǎn)生較好的治療效果。插入蛋白質(zhì)抗體中的UAAs 通常為乙酰苯丙氨酸、疊氮基甲基?L?苯基丙氨酸和疊氮賴氨酸。UAAs 帶有的酮基、疊氮基官能團可與藥物連接子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而獲得藥抗比均一的ADC。Ambrx 公司的ARX788 是首個利用UAAs 開發(fā)的抗體藥物偶聯(lián)物，目前已處于臨床研究階段［17］。Kularatne 等［18］利用一種非天然氨基酸對乙酰苯丙氨酸（PAcF）定點修飾抗CXCR4免疫球蛋白G，并通過穩(wěn)定的肟鍵將其與金黃色葡萄糖素偶聯(lián)，制備了一種抗CXCR4?Auristatin 抗體-藥物結(jié)合物，該ADC 能夠選擇性地消除過表達CXCR4 受體的腫瘤細胞，且無明顯毒性，有望用于治療多種轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤。Zimmerman 等［19］建立了一個無細胞蛋白表達系統(tǒng)，通過定點插入優(yōu)化的對疊氮甲基?L?苯丙氨酸（PAMF）來生產(chǎn)抗體藥物結(jié)合物，并利用疊氮-炔環(huán)加成無銅點擊化學(xué)，證明了PAMF 的定點結(jié)合修飾能夠增強藥物與腫瘤特異性的結(jié)合，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。梁學(xué)軍等［20］將非天然氨基酸pAF 引入抗人類表皮生長因子受體2（HER2）單克隆抗體分子中，并與毒性分子特異反應(yīng)，制得抗HER2?ADC。該ADC 在細胞體外和動物體內(nèi)實驗中對HER2 高表達的腫瘤細胞具有明顯的抑制效果。目前，基于UAAs 偶聯(lián)構(gòu)建的ADC 數(shù)量占臨床試驗ADCs 的4%［21］。因此，我們相信基于UAAs 偶聯(lián)構(gòu)建的ADC 會有廣闊的發(fā)展前景。

圖1 抗體藥物偶聯(lián)物及其作用原理Fig. 1 Antibody-drug conjugates and principle of action

1.4 抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）

AMP 是一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。它們通常具有強堿性、熱穩(wěn)定性和廣譜抗菌等特點。由于抗生素的濫用，細菌的抗藥性不斷增強，因此AMP 對細菌的強力殺滅作用，特別是對某些耐藥性病原菌的殺滅作用，引起了人們的關(guān)注。然而，抗菌肽在動植物體內(nèi)含量極低，從動植物體內(nèi)分離提取困難、耗時、成本高等問題一直是抗菌肽實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)并投入使用的最大障礙。因此，開展AMP基因工程研究具有重要意義。

AMP 是典型的陽離子和兩親性多肽。陽離子型抗菌肽通過與細胞膜上帶負電荷的成分相互作用，增加了細胞膜的通透性，破壞其穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細胞膜溶解，釋放細胞內(nèi)容物，從而實現(xiàn)抗菌或其他抗性功能［22］。非天然氨基酸聚L?賴氨酸（PLLs）在生理條件下可生物降解并帶正電荷，已被用作抗菌劑，并且已被證明具有良好的抗菌活性。例如Pan 等［23］通過制備側(cè)鏈上含有不同亞甲基數(shù)量的PLLs 同系物（如聚 L?鳥氨酸（PLOs）、PLLs、聚 L-α,ζ 二氨基庚酸（PLHs））的星型多肽來調(diào)節(jié)抗菌劑的兩親性，從而實現(xiàn)最佳抗菌活性。他們隨后利用銅綠假單胞菌對星狀多肽進行了抑菌活性測試發(fā)現(xiàn)，非天然氨基酸聚 L?鳥氨酸對銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用,并對由銅綠假單胞菌引起的小鼠皮膚燒傷創(chuàng)面感染具有良好的抗菌和創(chuàng)面愈合作用。因此非天然氨基酸聚 L?鳥氨酸可作為抗菌肽，用于治療生物被膜的相關(guān)感染。D’Souza 等［24］將抗菌肽 BuCATHL4B中的3 條色氨酸（Trp）側(cè)鏈用非天然氨基酸 β-1?azulenyl?L?丙氨酸替換后發(fā)現(xiàn)，該抗菌肽不僅保持了抗菌和殺菌活性，而且還提高了與人細胞的相容性和抗蛋白酶降解的穩(wěn)定性。Salehi 等［3］還設(shè)計合成了一類含有非天然氨基酸二苯丙氨酸的細胞穿透性多肽（CPPs）DipR5，它具有攜帶多種分子的能力，是一種多功能藥物傳遞系統(tǒng)，可以與抗癌藥物如阿霉素、喜樹堿和姜黃素等結(jié)合使用，從而起到抗腫瘤抗癌的作用。

這表明，UAAs 可以作為設(shè)計和開發(fā)新型功能多肽的有用工具。其獨特的光譜特性，以及對細胞相容性和蛋白酶抗性的顯著改善，使其可以應(yīng)用于多種基礎(chǔ)和治療系統(tǒng)。隨著合成生物學(xué)和人工智能等新型交叉學(xué)科的快速發(fā)展，不僅為AMP 的設(shè)計合成提供了全新的技術(shù)平臺，也擴展了AMP 的醫(yī)藥應(yīng)用前景。

1.5 其他應(yīng)用

非天然氨基酸除應(yīng)用于蛋白質(zhì)探針、酶工程、抗體藥物偶聯(lián)物等之外，還作為手性砌塊應(yīng)用于藥物前體、病毒疫苗、生物傳感器等諸多領(lǐng)域。本課題組研究的D?苯甘氨酸已大量用于半合成青霉素和半合成頭孢菌素等，在重要β-內(nèi)酰胺抗生素的合成中，它們已成為抗生素臨床用藥的主力軍。近年來，多肽在智能納米材料開發(fā)中取得了一定的進展，從生物材料、生物傳感器到藥物輸送系統(tǒng)等。例如，在二肽中加入高丙氨酸或去甲丙氨酸創(chuàng)造了具有新晶體結(jié)構(gòu)的微孔有機材料，用作藥物載體和溫室氣體的吸收劑。UAAs 插入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中還可作為電化學(xué)生物傳感器，左旋多巴L?DOPA 是苯丙氨酸的類似物，含有兒茶酚部分參與可逆的雙電子氧化還原過程，因此適合作為電化學(xué)標記。通過葡萄糖/半乳糖結(jié)合蛋白（GBP）來說明檢測原理，當葡萄糖結(jié)合后，GBP 發(fā)生了顯著的構(gòu)象變化，表現(xiàn)為L?DOPA的電化學(xué)性質(zhì)的變化。Zeynaloo 等［25］將電活性GBP固定在金納米顆粒修飾的聚合咖啡酸絲網(wǎng)印刷碳電極（GBP?LDOPA/AuNP/PCA/SPCE）上，用于直接測量血糖水平，并使用電化學(xué)活性UAAs 作為標記進行驗證。由此產(chǎn)生的無試劑GBP 生物傳感器表現(xiàn)出高度的選擇性以及對葡萄糖在微摩爾范圍內(nèi)的靈敏的親和力，為新的生物傳感方法奠定了基礎(chǔ)。

將UAAs 插入蛋白質(zhì)中，用于新型疫苗的開發(fā)也是UAAs 一種極有價值的應(yīng)用。機體在受到病毒感染以及發(fā)生炎癥時會通過氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)自身某些蛋白質(zhì)中的Tyr 殘基發(fā)生翻譯后修飾形成硝基酪氨酸和磺基酪氨酸。研究人員發(fā)現(xiàn)硝基和磺基在體內(nèi)具有較強免疫原性，因此一些含硝基或者磺基的UAAs， 包括p?nito?L?phenylalanine（pNO2F）、3?nitro?L?Tyrosine（3?NO2Y）、p?sulfo?L?phenylalanine（pSO3F）被認為可應(yīng)用于治療性蛋白疫苗的開發(fā)［26］。例如，將腫瘤壞死因子（TNF-α）中的Lys 和Tyr 定點突變成pNO2phe 后，打破了動物自身免疫耐受，產(chǎn)生了高效價抗體，被認為是一種有潛力的治療性蛋白疫苗。除用作治療性蛋白疫苗外，UAAs 還可用于減毒活疫苗的研發(fā)。通過在病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因中引入提前終止密碼子構(gòu)建的突變病毒，在添加UAAs 的情況下該基因仍能完整表達從而完成病毒的復(fù)制和傳代，但該病毒在正常細胞中因復(fù)制關(guān)鍵基因不能完整表達而無法復(fù)制傳代，因而是一種復(fù)制缺陷型病毒。該病毒用作疫苗時既具有減毒活疫苗免疫效果還有安全性高的優(yōu)點，因而是一種較為理想的活病毒疫苗［27］。具有部分UAAs 的應(yīng)用如表1所示。

表1 非天然氨基酸的應(yīng)用Table 1 Applications of unnatural amino acids

2 非天然氨基酸的生物合成

UAAs 具有巨大的應(yīng)用潛力，因此其合成方式備受關(guān)注。目前，其合成方法主要有化學(xué)法和生物法兩大類?；瘜W(xué)法作為傳統(tǒng)的合成方法，存在反應(yīng)條件嚴苛、反應(yīng)步驟復(fù)雜、原料成本高等問題。相比之下，生物法具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、對映體選擇性高等優(yōu)點，更具吸引力。隨著對代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，通過優(yōu)化微生物工程菌整個代謝網(wǎng)絡(luò)，提高其性能和穩(wěn)定性，利用進化代謝和全局調(diào)控提高其生產(chǎn)能力，將其轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)可用的工程菌是當前生物合成技術(shù)研究熱點［33］。

2.1 靜態(tài)調(diào)控優(yōu)化策略

代謝工程的目標是通過改變和調(diào)控宿主體內(nèi)的關(guān)鍵代謝途徑或引入新的代謝途徑來提高目標產(chǎn)品的產(chǎn)量等［36］。當前已有研究在大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等底盤生物中成功構(gòu)建UAAs 的生物合成途徑［37］。如4?羥基異亮氨酸（4?HIL）是有效預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病及肥胖癥的理想潛在藥物［38］，其生物合成是以L?異亮氨酸和α-酮戊二酸為前體，由L?異亮氨酸雙加氧酶（L?isoleucine dioxygenase，IDO）催化而成。然而在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌等底盤細胞中均不含IDO，因此應(yīng)首先在菌株中表達外源IDO構(gòu)建4?HIL 合成途徑。Shi 等［39］在L?異亮氨酸產(chǎn)生菌C. glutamicum中異源表達IDO 基因，并引入4?HIL合成途徑，在不添加L?異亮氨酸和α-酮戊二酸的情況下實現(xiàn)了從葡萄糖中從頭合成4?HIL，并通過改善底物供應(yīng)和IDO 活性增強4?HIL 的合成效率，使4?HIL 產(chǎn)量提高到0.069 47 mol/L。Umutumwa 等［40］克隆了來自蘇云金芽孢桿菌的IDO，實現(xiàn)了其在E.coliBL21（DE3）中的異源表達，然后通過對酶的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)條件進行優(yōu)化，反應(yīng)32 h 后4?HIL 產(chǎn)量達0.077 3 mol/L。

合理調(diào)控關(guān)鍵節(jié)點處的代謝分配是提高目標產(chǎn)物生物合成產(chǎn)量的關(guān)鍵。5?氨基乙酰丙酸（5?ALA）是一種多功能植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，可促進植物生長和提高作物產(chǎn)量，在醫(yī)藥領(lǐng)域，可以用于癌癥診斷和治療［41］。5?ALA 的C5合成途徑是以L?谷氨酸為前體合成的。研究表明，谷氨酰tRNA 還原酶（GluTR，由hemA基因編碼）和谷氨酰?1?半醛氨基轉(zhuǎn)移酶（GSA?AM，由hemL基因編碼）是5?ALA C5合成途徑的關(guān)鍵酶［42］。通過對5?ALA 代謝通路的關(guān)鍵酶基因進行調(diào)控，可有效提高5?ALA 的產(chǎn)量。Kang等［43］將來自鼠傷寒沙門氏菌的hemA基因的N 端編碼Thr?2 和Leu?3 氨基酸之間插入兩個編碼賴氨酸的密碼子，進一步在E. coli中過表達突變型基因，5?ALA的產(chǎn)量提高到0.18 g/L。另外，魏敏華等［44］在研究影響5?ALA 的關(guān)鍵因素時發(fā)現(xiàn)，敲除編碼L?谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因阻斷胞內(nèi)L?谷氨酸的外排，同時將5?ALA 合成關(guān)鍵酶GluTR 和GSA?AM 按比例組裝至DNA 腳手架上，以減小中間代謝產(chǎn)物的傳遞空間，可使5?ALA 產(chǎn)量提高35.3%。

此外，還有許多代謝工程策略可以用來提高UAAs 的合成效率和產(chǎn)量，如阻斷產(chǎn)物分解代謝、敲除競爭性旁路、解除轉(zhuǎn)錄和反饋抑制以及調(diào)節(jié)輔因子供應(yīng)和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運等。例如，L?2?氨基丁酸（L?ABA）可通過蘇氨酸脫氨酶催化L?蘇氨酸生成α-酮丁酸（2?KB），再經(jīng)亮氨酸脫氫酶催化而制得。通過定點突變高絲氨酸脫氫酶基因和蘇氨酸脫氫酶基因，可有效解除L?蘇氨酸和L?異亮氨酸的反饋抑制，保證L?蘇氨酸的充足供應(yīng)，從而提高L?ABA 的產(chǎn)量［45］。其他常見UAAs，如L?高絲氨酸、鳥氨酸、反式?4?羥基脯氨酸、5?羥基色氨酸等也已通過運用上述代謝工程策略使生產(chǎn)效率和產(chǎn)量成功得到提高，其合成途徑如圖2 所示。

圖2 非天然氨基酸的生物合成途徑Fig. 2 Biosynthetic pathway of UAAs

2.2 動態(tài)調(diào)控優(yōu)化策略

動態(tài)調(diào)控作為合成生物學(xué)的一項重要生物技術(shù)具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢和細胞經(jīng)濟性［33］。傳統(tǒng)的靜態(tài)調(diào)控通過對產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵基因過表達或旁路競爭途徑相關(guān)基因進行敲除，使代謝流精準高效的流向產(chǎn)物合成途徑。這種調(diào)控策略雖然在一定程度上可以提高產(chǎn)物產(chǎn)量，但同時可能會抑制細胞內(nèi)代謝活動，影響細胞正常生長［46］。此外，異源途徑的引入也會給細胞帶來負擔和毒性，降低產(chǎn)物合成速率和得率。因此需要更先進的調(diào)控策略，在保證細胞正常生長的前提下，優(yōu)化目標產(chǎn)物的生產(chǎn)速率和得率。

動態(tài)調(diào)控策略是指通過感知細胞內(nèi)外各種信號，動態(tài)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或基因的表達水平，從而實現(xiàn)對代謝流的精確控制，從而獲得最佳的目標產(chǎn)品合成效率。根據(jù)不同的調(diào)控策略特點，動態(tài)調(diào)控可分為代謝物響應(yīng)、群體感應(yīng)響應(yīng)、環(huán)境響應(yīng)和蛋白質(zhì)水平調(diào)控四種類型［47］。近年來，在UAAs 的生物合成中已成功應(yīng)用了這些策略。代謝物響應(yīng)的核糖開關(guān)可以感知細胞內(nèi)外某些代謝物或產(chǎn)物的濃度變化，來調(diào)節(jié)相關(guān)基因或蛋白質(zhì)的表達水平。這種策略可以實現(xiàn)對代謝流量的實時反饋和自適應(yīng)調(diào)節(jié)，具有反應(yīng)時間快，對細胞負擔小及靈活性高的特點［48］。例如，來文梅等［49］為提高4?HIL 的產(chǎn)量，將Lys?OFF核糖開關(guān)整合到Lys 合成途徑的關(guān)鍵基因dapA序列上游，動態(tài)弱化Lys 的合成，使Lys 的產(chǎn)量降低46.7%。同時利用Ile 激活型傳感器Lrp?PbrnFEN 動態(tài)激活4?HIL 合成途徑中ido基因的表達。最后，利用強啟動子PbrnFE7 動態(tài)控制增強α-酮戊二酸和O2供應(yīng)途徑中關(guān)鍵基因odhI 和vgb的表達，通過這種多層次的動態(tài)調(diào)控，使4?HIL 產(chǎn)量高達0.166 mol/L。Zhou 等［50］在巴氏梭菌中設(shè)計改造了一種高效的甘氨酸抑制型核糖開關(guān)，并將其整合到5?ALA C4合成途徑中，使其能夠感知前體甘氨酸濃度來動態(tài)調(diào)控5?ALA 脫水酶的表達，從而實現(xiàn)了5?ALA 的產(chǎn)量提升。

群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS）是細菌用于監(jiān)控自身群體密度的環(huán)境信號感受系統(tǒng)。這種策略可以通過感知細胞群體密度的變化，來調(diào)節(jié)相關(guān)基因或蛋白質(zhì)的表達水平，具有信號傳遞迅速、調(diào)控效果高和穩(wěn)定性高等特點。隨著合成生物學(xué)的大力發(fā)展，QS 的應(yīng)用研究在動態(tài)調(diào)控領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。Gu 等［51］利用具有激活和抑制雙重調(diào)控功能的Eas?QS 系統(tǒng)，構(gòu)建了一種雙功能動態(tài)調(diào)控開關(guān)，并將其用于動態(tài)調(diào)控5?ALA 的生物合成，實現(xiàn)了前期菌體快速生長，后期快速積累產(chǎn)物。最終，使5?ALA 的產(chǎn)量比靜態(tài)調(diào)控提高12 倍。

總之，動態(tài)調(diào)控在UAAs 的合成中具有顯著優(yōu)勢，能實現(xiàn)對代謝流量的精確控制和優(yōu)化分配。目前，動態(tài)調(diào)控還存在一些挑戰(zhàn)和局限性，如調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性、生物元件的匱乏等。隨著合成生物學(xué)的不斷進步，相信動態(tài)調(diào)控將在UAAs 的生物合成中發(fā)揮更大的作用。4?HIL 和5?ALA 的動態(tài)調(diào)控如圖3 所示。

圖3 4-HIL 和5-ALA 的動態(tài)調(diào)控Fig. 3 Dynamic regulation of 4-HIL and 5-ALA

2.3 發(fā)酵優(yōu)化策略

在生物生產(chǎn)中，微生物的發(fā)酵策略是影響產(chǎn)品產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的重要因素之一［30］。順式?4?羥基-脯氨酸（CHOP）和反式?4?羥基-脯氨酸（THOP）是兩種具有很高藥用價值的手性結(jié)構(gòu)UAAs，近年來，其生物合成受到廣泛關(guān)注。張博文等［52］和李強等［53］分別構(gòu)建了CHOP 和THOP 的細胞工廠，并對其進行了發(fā)酵優(yōu)化，實現(xiàn)了UAAs 的高效生產(chǎn)。張博文等［52］進行發(fā)酵優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，在2.5 g/L 的底物濃度下，CHOP 產(chǎn)量達到最大值，隨后開始下降。為了避免底物濃度過高抑制細胞活性，他們后期采用分批補料的方式使底物濃度在合適的范圍內(nèi)，通過這種發(fā)酵策略，在最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵60 h 后，CHOP 產(chǎn)量達到120 mg/L，較發(fā)酵優(yōu)化前得到明顯提升。李強等［53］為了評估THOP 細胞工廠的生產(chǎn)性能，也采用了分批補料的方式，在5 L 發(fā)酵罐中進行發(fā)酵實驗時發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間延長，細胞生物量逐步增加，最終OD600達到70，在進行葡萄糖分批補料發(fā)酵40 h 后，THOP 產(chǎn)量達到48.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率和平均生產(chǎn)強度分別達到21.6%和1.22 g/（L·h）,為THOP 的發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論支持。部分常見的UAAs 的生物合成策略如表2 所示。

表2 非天然氨基酸的生物合成Table 2 Biosynthesis of UAAs

3 總結(jié)與展望

UAAs 是一類在醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、材料等眾多領(lǐng)域具有重要價值和廣闊前景的化合物。尤其在合成蛋白質(zhì)中，它們打破了20 種天然氨基酸的限制，賦予了蛋白質(zhì)更穩(wěn)定的性能和更廣闊的應(yīng)用。UAAs在酶改造、蛋白質(zhì)藥物、生物傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用效果令人驚嘆。然而，UAAs 的合成仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。目前，UAAs 的生產(chǎn)方式主要依賴化學(xué)法，這種方法不僅污染嚴重且導(dǎo)致UAAs 的價格昂貴。隨著生物技術(shù)的突破和合成生物學(xué)的發(fā)展，UAAs 的生物合成已取得了顯著的進展。通過對代謝工程靜態(tài)和動態(tài)調(diào)控策略深入研究以及核糖開關(guān)、群體感應(yīng)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子-啟動子等技術(shù)手段的應(yīng)用，使UAAs 的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量得到大幅提升。

但總體來說，當前動態(tài)調(diào)控技術(shù)仍然存在一些不足和局限性，如動態(tài)調(diào)控元件種類少、響應(yīng)范圍有限、底物譜和響應(yīng)閾值窄等。因此利用動態(tài)調(diào)控策略合成UAAs 還需要繼續(xù)深入研究和優(yōu)化。此外，目前僅有少數(shù)UAAs 的代謝途徑得到解析和利用，因此需要借助合成生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等學(xué)科進行深入研究來進一步挖掘更多UAAs 的代謝途徑和關(guān)鍵酶。除此之外，將UAAs 位點特異性插入到蛋白質(zhì)中的遺傳密碼擴展技術(shù)也有待發(fā)展和突破，此技術(shù)仍存在密碼子和相互正交RS/tRNA 對匱乏和插入UAAs 種類限制等挑戰(zhàn)。目前，國內(nèi)UAAs 的市場需求還很大，應(yīng)充分挖掘和利用UAAs的生物合成途徑及其在蛋白質(zhì)中的應(yīng)用潛力。我們相信，隨著合成生物學(xué)、生物化學(xué)和理性設(shè)計等技術(shù)手段的不斷完善和創(chuàng)新，高效綠色的UAAs 生物合成路線將會得到廣泛應(yīng)用，同時計算模擬輔助遺傳密碼擴展技術(shù)也會不斷成熟和優(yōu)化，將UAAs 更多地應(yīng)用到蛋白質(zhì)及多肽藥物中。