• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘松屬資源遺傳多樣性及其ITS 二級結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育信息分析

    2024-01-09 00:46:24俸明康豐日落張紹山李文兵
    中草藥 2024年1期
    關(guān)鍵詞:甘松堿基遺傳

    崔 琪 ,俸明康 ,豐日落 ,王 濤 ,張紹山 ,李 瑩 ,李文兵 ,陳 晨 *,劉 圓

    1.西南民族大學藥學院,四川 成都 610041

    2.西南民族大學青藏高原研究院,四川 成都 610225

    3.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術(shù)工程實驗室,四川 成都 610225

    4.青藏高原民族藥用資源保護與利用國家民委重點實驗室,四川 成都 610225

    甘松NardostachyschinensisBat,又名甘松香、香松,作為藥用始載于《本草拾遺》[1]。甘松以干燥根及根莖入藥,因富含甘松新酮、甘松新酮二醇、甘松香酮A、甘松香酮B、當歸香素、蒙花苷[2-3]等成分,具有理氣解郁、祛濕消腫[4]的功效,具有重要的藥用價值。另外,甘松作為藏香、香水[5]、化妝品[6]等產(chǎn)品的重要成分,亦具有重要的工業(yè)價值。甘松的市場需求增大,但其分布范圍小,生長周期長,對生長環(huán)境要求嚴苛,無差別和非系統(tǒng)性采集使其野生資源遭到嚴重破壞,野生資源日益減少,以致于被納入《瀕危動植物國際貿(mào)易公約》(CTES)附錄Ⅱ[7]。因此,為滿足甘松市場需求,可持續(xù)利用該資源,展開種質(zhì)資源收集、評價、開發(fā)、利用及新品種選育等工作至關(guān)重要。

    早期研究認為,敗醬科(Valerianaceae)甘松屬NardostachysL.植物共有3種,分別為甘松N.chinensisBet.、匙葉甘松N.jatamansiDC.和大花甘松N.grandifloraDC.,三者均分布于喜馬拉雅山區(qū)[8]。在我國主要分布的為甘松和匙葉甘松2 種,位于青海、四川、云南、西藏和甘肅等省份地區(qū)[1];大花甘松N.grandifloraDC.,多分布于印度、尼泊爾等地[9]。三者均為青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的組成部分。目前大多數(shù)研究認為,甘松、匙葉甘松、大花甘松是同種植物,統(tǒng)稱為“甘松”。由此可見,甘松屬植物如何分類,目前并未有確切依據(jù)。

    真核生物核糖體 DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(internal transcribed spacer,下簡稱ITS)作為國際公認的植物DNA 條形碼候選序列[10],序列十分保守,但在近緣種之間存在明顯差異[11],廣泛運用于中藥材真?zhèn)蝃12]、近緣種親緣性鑒定[13]、基原鑒定[14]、遺傳多樣性[15]等方面,相比其他標記手段具有進化速率快、擴增效率高、靈敏準確等有點,已成為主流的核基因分子標記之一[16-17]。本研究通過調(diào)查國內(nèi)甘松屬資源的分布,從四川、青海、甘肅、西藏的野生甘松資源分布區(qū)收集甘松屬資源20份,利用ITS DNA 條形碼序列,對青藏高原甘松屬植物資源展開遺傳多樣性研究,為甘松屬分類、資源生態(tài)適應(yīng)機制及種質(zhì)篩選等的研究提供理論指導,同時為野生甘松屬植物資源的保護選育提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    2020 年6 月于四川省阿壩藏族羌族自治州、四川省甘孜藏族自治州、青海省黃南藏族自治州、青海省果洛藏族自治州、甘肅省甘南藏族自治州、西藏自治區(qū)日喀則市采集甘松屬資源樣本20 份,移栽至西南民族大學青藏高原基地。經(jīng)西南民族大學劉圓教授鑒定,四川甘孜藏族自治州的4 份樣本為匙葉甘松N.jatamansiDC.,其余地區(qū)樣本均為甘松N.chinensisBat,鑒定結(jié)果[8]及樣本來源見表1。

    表1 甘松屬樣本采集信息Table 1 Samples information of Nardostachys

    1.2 方法

    1.2.1 試驗樣地概況 于西南民族大學青藏高原基地甘松資源圃內(nèi)(102°35′00″E,32°50′07″N)展開試驗,試驗地海拔3 490 m。2020 年年平均溫度2.9 ℃,年降水量860.8 mm,年日照時數(shù)2 212.3 h,氣候干燥寒冷。

    1.2.2 樣品DNA 的提取、PCR 擴增及測序 待植株長出新葉,分別取長勢一致的葉片,首先用無菌水洗凈,然后濾紙吸干后剪碎加液氮研磨,采用CTAB 法提取樣品DNA。提取后對樣品的DNA 進行純度與濃度的檢測。ITS1、ITS2 序列擴增所用引物及PCR 反應(yīng)條件見表2。所用PCR 反應(yīng)試劑為北京擎科生物科技有限公司所生產(chǎn)的I-5TM2×High-Fidelity Master Mix,將1.3%瓊脂糖凝膠電泳單一、清晰、明亮的擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

    表2 PCR 擴增與擴增程序Table 2 PCR amplification and amplification procedures

    經(jīng)檢測,所有樣本提取的DNA 在260、280 nm 的吸光度比值A(chǔ)260/A280在1.8~2.0,A260/A230在1.8~2.3,所有樣本DNA 純度達到檢測要求。提取的DNA 質(zhì)量濃度在34.9~90 ng/μL,且純度均達到要求,見圖1。

    圖1 ITS1 (A) 和ITS2 (B) 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplified products in ITS1 (A) and ITS2 (B) sequences

    2 數(shù)據(jù)處理

    測序結(jié)果用DNA EditSeq 軟件進行剪切、拼接和統(tǒng)計等分析,并用MEGA7.0 軟件進行多重序列比對并用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并計算遺傳距離,利用DNASP ver.5.0 軟件對 各居群的遺傳多樣性參數(shù)進行計算,并估算群體間的遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient,Gst),并將不同單倍型序列用網(wǎng)絡(luò)在線版Mfold 進行二級結(jié)構(gòu)分析。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 ITS 序列G/C 含量與長度多態(tài)性分析

    分析所有材料的ITS1 和ITS2 序列G+C 含量發(fā)現(xiàn),ITS1 G+C 含量為67.92%~68.46%,ITS2 G+C 含量為66.88%~67.09%,G+C 含量普遍較高,都在66%以上,最高達68.46%(S18)。比較各ITS1和ITS2 序列,可見其長度變化不大,ITS1 序列長度范圍為687~689 bp,僅2 bp 差異,ITS2 序列長度比較一致為468 bp。因此,從序列G+C 含量和長度多態(tài)性來看,甘松屬資源ITS1 的變異較ITS2的序列變異大,但二者種內(nèi)變異均較小,見表3。

    表3 20 個甘松屬樣本ITS1 和ITS2 序列長度及G+C 值Table 3 ITS1 and ITS2 sequences length and G + C content in 20 samples of Nardostachys

    3.2 序列特征及遺傳距離分析

    利用MEGA 軟件對20 個甘松屬樣本ITS1 和ITS2 序列進行對比分析,結(jié)果見表4。ITS1 序列比對長度為689 bp,變異位點為15 個,占該區(qū)位點的21.8%,簡約信息位點11 個,其中1 個位點發(fā)生G/C 或A/T 堿基的顛換、10 個位點發(fā)生GC/AT 堿基的轉(zhuǎn)換,簡約信息位點為變異較大的位點。如表5 所示,ITS2 序列比對長度為468 bp,變異位點為7 個,占15.0%,簡約信息位點6 個,其中1 個位點發(fā)生G/C或A/T堿基的顛換、5個位點發(fā)生GC/AT堿基的轉(zhuǎn)換。

    表4 ITS1 簡約信息位點Table 4 Parsimony informative site of ITS1

    表5 ITS2 簡約信息位點Table 5 Parsimony informative site of ITS2

    序列變異結(jié)果分析表明,ITS1 序列的變異位點較ITS2 序列變異位點多,甘松與匙葉甘松的ITS1和ITS2 序列差異較大,差異的堿基及位點的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性,即在特定的位點變異,且變異的堿基大多相同;不同產(chǎn)地的甘松之間、不同產(chǎn)地的匙葉甘松之間變異均較小。

    基于K2P 模型對實驗材料進行遺傳距離分析,結(jié)果(表6)表明,甘松種內(nèi)平均遺傳距離為0.001 7,匙葉甘松種內(nèi)平均遺傳距離為0.005 2,種間平均遺傳距離為0.005 3,種內(nèi)平均遺傳距離小于種間平均遺傳距離。

    表6 甘松屬2 種藥用植物的遺傳距離Table 6 Genetic distances among two medicinal plants in Nardostachys

    3.3 聚類與同源性分析

    構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)可看出,20 個甘松屬樣本可分為2 大類,其中各個地區(qū)的甘松(G1~G16)聚為一組,匙葉甘松(S17~S20)聚為另一組。上述結(jié)果與形態(tài)學分類中歸為2 個不同的種的分類結(jié)果一致,說明ITS 序列可用于鑒別甘松與匙葉甘松。此外,本研究所用甘松樣品可分為2 個亞類,其中第一個亞類包括14 個種質(zhì)資源,3 個來自四川、9 個來自青海、2 個來自甘肅;第2 個亞類包括2 個種質(zhì)資源均來自西藏。ITS 聚類結(jié)果與種質(zhì)的緯度空間分布具有一定的相關(guān)性??梢?,ITS 分子標記在一定程度上反映了甘松屬種質(zhì)的地理分布特點。

    圖2 基于ITS 序列構(gòu)建甘松屬樣本NJ 聚類樹Fig.2 NJ Phylogenetic trees of Nardostachys based on ITS sequences

    本研究進一步利用DNASTAR 軟件對甘松屬20 個樣品的ITS 序列間的同源性和差異性進行分析,結(jié)果如圖3 所示,物種水平上看,甘松(G1~G16)ITS 序列的同源性在99.0%~100%,差異性在0~0.8%,其中G1~G14 的ITS 序列完全一致,說明若爾蓋縣、河南蒙古自治縣、久治縣、碌曲縣和瑪曲縣幾個地區(qū)的甘松沒有因為地理變化而發(fā)生堿基上的突變,而G15、G16 與G1~G14 的同源性在99.0%~99.3%,差異性在0.7%~0.8%,說明東亞縣、吉隆縣幾個地區(qū)與其余地區(qū)的甘松相比,堿基序列有較小變化,可能是由于地理變化引起的。匙葉甘松(S17~S20)同源性在99.0%~99.8%,差異性在0.2%~1.0%,說明不同地區(qū)的匙葉甘松堿基序列有一定差異。從屬的水平看,甘松與匙葉甘松的同源性在98.5%~99.8%,差異性在0.7%~1.3%,甘松與匙葉甘松ITS 堿基序列有較小差異,表明二者親緣關(guān)系較近。

    圖3 20 個甘松屬樣本ITS 序列的同源性及差異性Fig.3 Homology and difference of ITS sequences among 20 samples of Nardostachys

    3.4 ITS 序列二級結(jié)構(gòu)分析

    在甘松屬的2 個品種的ITS 基因中,分別選擇遺傳距離最遠的2 個序列,ITS1 序列選擇甘松G01和G16、匙葉甘松S17 和S20,ITS2 序列選擇甘松G01和G16、匙葉甘松S17和S18,采用RNAfold web server 在線版繪制其二級結(jié)構(gòu),見圖4。甘松與匙葉甘松ITS1 序列二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象、莖環(huán)及內(nèi)部環(huán)的結(jié)構(gòu)均有明顯差異,而ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)差異較小,這與ITS1 和ITS2 序列的堿基變異程度不同有關(guān),結(jié)果與序列特征分析一致。

    圖4 基于ITS 序列構(gòu)建的rRNA 二級結(jié)構(gòu)Fig.4 rRNA secondary structure based on ITS sequences

    3.5 甘松與匙葉甘松遺傳多樣性比較

    利用DNAsp 軟件對甘松屬資源進行遺傳多樣性進行分析,分離點位數(shù)(number of segregating sites,S)、單倍型數(shù)量(number of haplotypes,Hh)、單倍型多樣性(haplotypes diversity,Hd)、平均核苷酸差異(average number of nucleotide differences,k)和核苷酸多樣性(nucleotide diversity,π)分別進行計算,結(jié)果如表7 所示,甘松種群分離位點數(shù)為9,共3 個單倍型,單倍型多樣性為0.242,平均核苷酸差異為1.992 和核苷酸多樣性為0.001 72;匙葉甘松分離位點數(shù)為11,共4 個單倍型,單倍型多樣性為1.000,平均核苷酸差異為6.000 和核苷酸多樣性為0.005 19。綜合遺傳多樣性水平指標也顯示,甘松的遺傳多樣性小于匙葉甘松(圖5)。

    圖5 甘松與匙葉甘松的遺傳多樣性比較Fig.5 Comparison of genetic diversity between N.chinensis and N.jatamansi

    表7 甘松與匙葉甘松的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計Table 7 Statistics of genetic diversity parameters of N.chinensis and N.jatamansi

    4 討論

    4.1 形態(tài)學

    甘松為重要的中藥材及民族藥材,基原準確是保證藥材質(zhì)量的基礎(chǔ)及關(guān)鍵。早期研究認為世界甘松屬資源分為甘松、匙葉甘松和大花甘松3 種,其中,我國產(chǎn)甘松和匙葉甘松2種,但它們現(xiàn)在被Flora of China(《中國植物志》英文版)認為是同一種[18]。因此,對我國甘松屬資源進行鑒定,認為我國甘松屬從形態(tài)學上應(yīng)為甘松和匙葉甘松2 種,二者有以下顯著差異:(1)甘松葉鞘殘基呈片狀,而匙葉甘松呈纖維狀,(2)甘松葉鈍形,呈倒披針狀,而匙葉甘松則葉尖尖形,呈長匙狀,(3)甘松果實光禿,匙葉甘松果實被毛,(4)甘松花后主軸和側(cè)軸明顯伸長,而匙葉甘松并無明顯伸長,(5)甘松花冠內(nèi)光滑無毛,匙葉甘松則密布白毛。以上結(jié)論與耿曉萍等[19]的研究結(jié)果一致。

    4.2 ITS 分子標記鑒定甘松屬資源的適用性

    ITS 序列因受到的選擇壓力小,具有較高的遺傳變異,被視為中草藥及其近緣種的鑒定、藥材真?zhèn)蔚蔫b定、物種遺傳多樣性最常用的DNA 條形碼技術(shù)[20]。緣毛紫菀Astersouliei及其近緣物種[21]、雞血藤Spatholbicaulis及其混偽品的鑒定及雷公藤屬Tripterygium的遺傳多樣性[22-23]均成功利用ITS 序列進行鑒定。在甘松屬中,金乾等[24]利用rbcL 序列和ITS2 序列均無法鑒定甘松資源。本研究將ITS2 和ITS1 結(jié)合,利用MEGA 軟件對ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明,甘松與匙葉甘松各自聚為一類,且與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致,表明ITS 可用于甘松屬資源的劃分與基原鑒定,且我國甘松屬應(yīng)分為甘松和匙葉甘松2 種。

    4.3 甘松屬資源的遺傳多樣性與地理分布

    種質(zhì)資源多樣性的核心是遺傳多樣性,資源多樣性為新品種選育提供重要基礎(chǔ)[25]。甘松種質(zhì)資源的多樣性分析研究目前主要集中在形態(tài)遺傳標記及生物化學遺傳標記,偶見分子遺傳標記研究。耿曉萍[19]對甘松的形態(tài)學進行觀測與分析,研究發(fā)現(xiàn)甘松與匙葉甘松表型差異明顯,同時利用HPLC 指紋圖譜分析甘松屬資源的化學成分,從生物化學方面對甘松資源鑒定提供依據(jù)。上文也提及金乾[24]利用rbcL 序列對甘松屬資源進行了鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)形態(tài)學鑒定與ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育分析,均能對甘松屬資源進行有效區(qū)分。

    植物的遺傳多樣性與其地理分布范圍存在著密切聯(lián)系,自然分布廣泛的物種往往具有更高的遺傳多樣性。甘松與匙葉甘松分布位置分析發(fā)現(xiàn),二者分布在喜馬拉雅山脈至橫斷山脈區(qū)域?青藏高原東南邊緣地帶。該地區(qū)是我國特有植物種類最豐富的地區(qū),同時也是現(xiàn)代北溫帶和高山植物區(qū)系的重要分化和起源中心,具有植物種類多樣化的特點[26]。地理譜系研究的兩種高原植物分布演化模式均表明,青藏高原植物群體在冰期后向邊緣演化。甘松屬植物分布演化可能遵循此規(guī)律從而多分布在青藏高原的東南邊緣地區(qū),分布面狹窄。本研究發(fā)現(xiàn)甘松屬資源遺傳多樣性較其他物種低,這可能是造成其分布面狹窄的原因之一。同時,本研究發(fā)現(xiàn),甘松遺傳多樣性低于匙葉甘松,但走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)甘松自然分布范圍卻大于匙葉甘松。甘松在四川、青海、甘肅、西藏多個地區(qū)均有分布,而匙葉甘松僅在四川省甘孜藏族自治州、云南省有分布。分析原因,可能是由于氣候類型不同引起的。在長期的演化過程中,基因和氣候之間形成了穩(wěn)定的相互作用關(guān)系。氣候變化必然影響植物的遺傳物質(zhì),從而導致植物的遺傳多樣性發(fā)生改變。甘松分布區(qū)主要為高原高山氣候,其遺傳物質(zhì)相對穩(wěn)定。而匙葉甘松分布區(qū)既有高原高山氣候還受亞熱帶季風氣候影響,使得其為適應(yīng)環(huán)境發(fā)生遺傳變異[27]。馬麗娟等[28]研究發(fā)現(xiàn),東北野生杏遺傳多樣性受氣候環(huán)境影響發(fā)生遺傳變異。李明等[29]研究發(fā)現(xiàn)不同氣候環(huán)境顯著影響油松PinustabulaeformisCarr.居群的遺傳多樣性。在后續(xù)工作中,本課題組將繼續(xù)走訪調(diào)查甘松屬資源分布區(qū),進一步研究驗證該推論。

    本研究結(jié)合形態(tài)學特征分析,利用ITS 條形碼技術(shù),研究了中國主要野生甘松分布區(qū)甘松屬資源的遺傳多樣性,并對其分類進行分析,結(jié)果表明青藏高原分布區(qū)采集的甘松屬植物資源分為甘松和匙葉甘松2 種,為甘松屬資源的分類提供分子層面的支撐。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    甘松堿基遺傳
    非遺傳承
    應(yīng)用思維進階構(gòu)建模型 例談培養(yǎng)學生創(chuàng)造性思維
    中國科學家創(chuàng)建出新型糖基化酶堿基編輯器
    還有什么會遺傳?
    還有什么會遺傳
    還有什么會遺傳?
    生命“字母表”迎來4名新成員
    科學24小時(2019年5期)2019-06-11 08:39:38
    生命“字母表”迎來4名新成員
    中藥甘松化學成分與藥理作用的研究進展
    基于總量統(tǒng)計矩法綜合評價不同產(chǎn)地甘松揮發(fā)油成分
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:50
    中文字幕人妻丝袜制服| 成人二区视频| 日日啪夜夜撸| av黄色大香蕉| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 国产男人的电影天堂91| 蜜臀久久99精品久久宅男| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲美女黄色视频免费看| 一级片'在线观看视频| 国产精品久久久久久av不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清在线视频一区二区三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久人人爽人人片av| 久久精品国产自在天天线| 久久久精品免费免费高清| 香蕉精品网在线| 午夜激情福利司机影院| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 中文字幕免费在线视频6| 老女人水多毛片| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品人妻久久久影院| 精品久久国产蜜桃| 少妇 在线观看| 亚洲精品色激情综合| 各种免费的搞黄视频| 22中文网久久字幕| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产成人精品久久久久久| 亚洲怡红院男人天堂| 国产综合精华液| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产午夜精品一二区理论片| 日本免费在线观看一区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 街头女战士在线观看网站| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 丰满少妇做爰视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜福利,免费看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产亚洲91精品色在线| 下体分泌物呈黄色| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品乱久久久久久| 搡老乐熟女国产| 久久久久久久久大av| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲综合精品二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 少妇熟女欧美另类| h视频一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 天美传媒精品一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 激情五月婷婷亚洲| 七月丁香在线播放| 七月丁香在线播放| 少妇人妻久久综合中文| 黑人高潮一二区| 精品久久久久久电影网| 亚洲欧洲国产日韩| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 午夜91福利影院| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲av成人精品一区久久| 丝瓜视频免费看黄片| 性色av一级| 国产一级毛片在线| 伦理电影大哥的女人| 国产一区二区在线观看日韩| 午夜免费鲁丝| a 毛片基地| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产有黄有色有爽视频| 中文天堂在线官网| 三级国产精品欧美在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 午夜久久久在线观看| a 毛片基地| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩在线观看h| 国产精品女同一区二区软件| 最近手机中文字幕大全| 七月丁香在线播放| 岛国毛片在线播放| 晚上一个人看的免费电影| 丝袜脚勾引网站| 99热6这里只有精品| 麻豆乱淫一区二区| 人人妻人人看人人澡| 久久热精品热| 黄色怎么调成土黄色| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲精品视频女| 成人国产av品久久久| 免费看日本二区| 一本久久精品| 又爽又黄a免费视频| 少妇高潮的动态图| av在线观看视频网站免费| 亚洲天堂av无毛| 久久久久国产网址| 国产在线一区二区三区精| 香蕉精品网在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产69精品久久久久777片| 高清在线视频一区二区三区| 精品一品国产午夜福利视频| 99久国产av精品国产电影| 少妇的逼好多水| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日本色播在线视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲欧洲国产日韩| 黄色怎么调成土黄色| 最后的刺客免费高清国语| 成人影院久久| 亚洲天堂av无毛| 久久久亚洲精品成人影院| 美女主播在线视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲综合色惰| 大片免费播放器 马上看| 国产精品久久久久久久久免| 中文在线观看免费www的网站| 国产成人a∨麻豆精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 午夜福利视频精品| 久久青草综合色| 国产 精品1| 熟女av电影| 五月伊人婷婷丁香| 日韩欧美精品免费久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 热re99久久国产66热| 国产成人91sexporn| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 2018国产大陆天天弄谢| 久久午夜福利片| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品第二区| 久久青草综合色| 亚洲,欧美,日韩| 国产爽快片一区二区三区| 人妻系列 视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产在线一区二区三区精| av在线老鸭窝| av有码第一页| 国产亚洲5aaaaa淫片| 边亲边吃奶的免费视频| 九草在线视频观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 五月开心婷婷网| 边亲边吃奶的免费视频| 日本av手机在线免费观看| 国产视频内射| 日本欧美视频一区| 亚洲国产日韩一区二区| 国产av精品麻豆| 大话2 男鬼变身卡| 精品久久久久久久久亚洲| 99热网站在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品久久久久久精品古装| 中文字幕久久专区| 国产探花极品一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| 精品久久国产蜜桃| 亚洲综合精品二区| 国产乱来视频区| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜福利视频精品| 国产美女午夜福利| 精品视频人人做人人爽| 色94色欧美一区二区| 亚洲美女视频黄频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产伦理片在线播放av一区| 精品久久久久久电影网| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美丝袜亚洲另类| 国产成人精品一,二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 熟妇人妻不卡中文字幕| 97在线人人人人妻| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 人妻一区二区av| 22中文网久久字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩制服骚丝袜av| 我的女老师完整版在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 涩涩av久久男人的天堂| 久久鲁丝午夜福利片| 久久久久视频综合| 大香蕉97超碰在线| 日韩电影二区| .国产精品久久| 街头女战士在线观看网站| 9色porny在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 卡戴珊不雅视频在线播放| 热re99久久国产66热| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 如何舔出高潮| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日韩人妻高清精品专区| 国产极品天堂在线| 日韩三级伦理在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲成人一二三区av| 亚洲欧美日韩东京热| 最新的欧美精品一区二区| 七月丁香在线播放| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久久网色| 新久久久久国产一级毛片| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲av福利一区| 香蕉精品网在线| 日韩欧美 国产精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久精品免费免费高清| 一区二区av电影网| 国产亚洲一区二区精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 美女中出高潮动态图| 国产一区二区在线观看日韩| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品国产露脸久久av麻豆| 青青草视频在线视频观看| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲欧美精品专区久久| 久久青草综合色| 国产精品久久久久久久久免| 国产欧美日韩精品一区二区| 人人妻人人看人人澡| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲精品乱久久久久久| av国产精品久久久久影院| 欧美丝袜亚洲另类| 男女啪啪激烈高潮av片| 女性被躁到高潮视频| 亚洲中文av在线| 丰满乱子伦码专区| 男人添女人高潮全过程视频| 国产成人免费观看mmmm| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 午夜激情福利司机影院| 少妇的逼水好多| 高清午夜精品一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲图色成人| 永久免费av网站大全| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产亚洲欧美精品永久| 一本久久精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久a久久爽久久v久久| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 久久久午夜欧美精品| 在线观看国产h片| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲性久久影院| 精品熟女少妇av免费看| 日本wwww免费看| 一级毛片电影观看| 国产片特级美女逼逼视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品熟女少妇av免费看| 丰满少妇做爰视频| 色94色欧美一区二区| 精品久久国产蜜桃| 热re99久久精品国产66热6| 国产探花极品一区二区| 中文天堂在线官网| 亚洲国产av新网站| av天堂久久9| 春色校园在线视频观看| 高清欧美精品videossex| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲精品一二三| 看非洲黑人一级黄片| 99久久精品国产国产毛片| 日本欧美视频一区| 亚洲av中文av极速乱| 校园人妻丝袜中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 人妻系列 视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 一级毛片 在线播放| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99热这里只有是精品50| 边亲边吃奶的免费视频| 99九九在线精品视频 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 免费大片18禁| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜久久久在线观看| 日本91视频免费播放| 精华霜和精华液先用哪个| 国产乱来视频区| 在线观看av片永久免费下载| 欧美精品亚洲一区二区| 久久热精品热| 人妻少妇偷人精品九色| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 伦理电影免费视频| 91精品国产九色| 国产在线视频一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲自偷自拍三级| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日韩伦理黄色片| 国产高清有码在线观看视频| 乱人伦中国视频| 国产熟女欧美一区二区| videossex国产| 国产欧美亚洲国产| 国产免费视频播放在线视频| 五月开心婷婷网| 最近中文字幕高清免费大全6| a级片在线免费高清观看视频| 色哟哟·www| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产永久视频网站| 简卡轻食公司| 22中文网久久字幕| 久久精品夜色国产| av网站免费在线观看视频| 日韩亚洲欧美综合| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲电影在线观看av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产色爽女视频免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产亚洲最大av| a 毛片基地| 夜夜爽夜夜爽视频| 男女边摸边吃奶| 免费av中文字幕在线| 晚上一个人看的免费电影| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久久国产一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲性久久影院| 国产成人精品婷婷| 亚洲丝袜综合中文字幕| 成人特级av手机在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 少妇的逼水好多| 欧美少妇被猛烈插入视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 美女国产视频在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 制服丝袜香蕉在线| 九色成人免费人妻av| 99久国产av精品国产电影| 久久久久久久国产电影| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产在线免费精品| 在线观看三级黄色| 亚洲精品一区蜜桃| 成人国产av品久久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人国产av品久久久| 亚洲三级黄色毛片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 天堂俺去俺来也www色官网| 尾随美女入室| 国产精品国产三级专区第一集| 91久久精品国产一区二区成人| 日本91视频免费播放| av在线观看视频网站免费| 精品久久久精品久久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99九九线精品视频在线观看视频| av线在线观看网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产亚洲最大av| 日韩 亚洲 欧美在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 一级毛片我不卡| 青春草视频在线免费观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 三级国产精品片| 国产一区二区三区av在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费黄频网站在线观看国产| 一级a做视频免费观看| 国产精品国产av在线观看| 9色porny在线观看| 尾随美女入室| 国产成人精品婷婷| 久久精品国产a三级三级三级| 日日啪夜夜撸| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 观看免费一级毛片| 伊人亚洲综合成人网| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲电影在线观看av| 青青草视频在线视频观看| 精品亚洲成国产av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 热99国产精品久久久久久7| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲四区av| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费观看的影片在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 22中文网久久字幕| 亚洲精品456在线播放app| 搡女人真爽免费视频火全软件| videos熟女内射| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜福利,免费看| 黄色毛片三级朝国网站 | 性色avwww在线观看| 男女免费视频国产| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产乱人偷精品视频| 777米奇影视久久| 久久久欧美国产精品| 精品少妇久久久久久888优播| √禁漫天堂资源中文www| 色视频在线一区二区三区| 国产在线男女| 国产亚洲欧美精品永久| 成人美女网站在线观看视频| 七月丁香在线播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 午夜av观看不卡| 51国产日韩欧美| 熟女电影av网| av一本久久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩制服骚丝袜av| 三上悠亚av全集在线观看 | 午夜老司机福利剧场| 在线播放无遮挡| 国产精品人妻久久久影院| 99热这里只有精品一区| 日本午夜av视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一级片'在线观看视频| 熟女av电影| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 大香蕉97超碰在线| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲不卡免费看| 在线观看三级黄色| 亚洲,欧美,日韩| 99九九在线精品视频 | 免费看日本二区| 久久久久久伊人网av| 午夜免费观看性视频| 人人澡人人妻人| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品一区www在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 18禁动态无遮挡网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产精品999| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品国产av蜜桃| xxx大片免费视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 99久久综合免费| av网站免费在线观看视频| 久热久热在线精品观看| 中国三级夫妇交换| 亚洲欧美成人精品一区二区| 热re99久久国产66热| 91久久精品电影网| 成人二区视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 人妻一区二区av| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲真实伦在线观看| 内地一区二区视频在线| 国国产精品蜜臀av免费| 人人妻人人看人人澡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精品一二三| 亚洲综合色惰| 免费看日本二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 丝袜脚勾引网站| 伊人亚洲综合成人网| 美女cb高潮喷水在线观看| 免费看光身美女| 亚洲国产精品一区三区| 另类亚洲欧美激情| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美最新免费一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 嫩草影院入口| 亚洲成人av在线免费| av国产久精品久网站免费入址| 欧美人与善性xxx| av一本久久久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一区二区三区精品91| 精品人妻熟女av久视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产在线免费精品| 男女国产视频网站| 久热这里只有精品99| 激情五月婷婷亚洲| 在线播放无遮挡| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久久久久久久久免费av| 久久精品夜色国产| 久久久久久久久大av| 亚洲国产精品999| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美日韩在线观看h| 精品久久久噜噜| 我要看日韩黄色一级片| 日本黄色日本黄色录像| 91精品伊人久久大香线蕉| 波野结衣二区三区在线| 午夜91福利影院| 女性生殖器流出的白浆| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产在线免费精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 麻豆成人av视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 18禁在线无遮挡免费观看视频| av有码第一页| 亚洲国产最新在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品熟女久久久久浪| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产伦在线观看视频一区| 五月天丁香电影| 成人国产麻豆网| 久久狼人影院| 亚洲国产精品一区三区| 国产在线免费精品| 久久午夜福利片| av福利片在线观看| 国产精品久久久久成人av| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲四区av| 国产成人精品久久久久久| 简卡轻食公司| 日日啪夜夜撸| 热re99久久精品国产66热6| 免费观看a级毛片全部| 香蕉精品网在线| 美女国产视频在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品久久久久久久久av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站 | 国产亚洲一区二区精品| 国产亚洲欧美精品永久| 免费av不卡在线播放| 99热全是精品| 亚洲av成人精品一二三区| 黄色欧美视频在线观看|