• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于蟾蜍分泌腺轉(zhuǎn)錄組對(duì)蟾蜍二烯酸內(nèi)酯合成途徑關(guān)鍵基因的挖掘

    2024-01-09 00:46:10張靈迂王普慶周羅靜高繼海侯飛俠
    中草藥 2024年1期
    關(guān)鍵詞:烯醇蟾蜍差異基因

    張靈迂,王普慶,周羅靜,高繼海,侯飛俠

    成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611137

    蟾酥是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufobufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider 皮膚腺體的干燥分泌物。蟾蜍皮膚存在2種外分泌腺:一種是黏液腺又稱腺泡腺[1-2],負(fù)責(zé)產(chǎn)生黏多糖和黏蛋白多糖,黏多糖自發(fā)的分泌能使皮膚保持濕潤(rùn);另一種是漿液腺又稱為合胞腺[1],腺中充滿肽類、胍衍生物、生物胺、甾體以及生物堿等內(nèi)含物[3],其中甾體類物質(zhì)蟾蜍二烯酸內(nèi)酯(bufadienolides,BDs)是蟾蜍抵御天敵的主要毒性物質(zhì),也是蟾酥主要的藥效成分[4]。BDs 在細(xì)胞中作為一種Na+,K+-ATP 酶抑制劑[5],可增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度,破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),并誘導(dǎo)不同類型的細(xì)胞凋亡,是重要的抗癌藥物[6-7]。目前BDs 的主要獲取途徑是從蟾酥中提取,此方法依靠野生蟾蜍為主要原材料,勢(shì)必會(huì)造成野生蟾蜍的衰退甚至滅絕。微生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)合成是替代從野生蟾蜍提取BDs的重要手段,但目前關(guān)于BDs 生物合成途徑的研究較少,導(dǎo)致現(xiàn)階段對(duì)其合成的分子機(jī)制仍不清楚。

    目前BDs 合成途徑研究顯示,膽固醇是該類化合物的前體物質(zhì)[8],涉及的基因家族包括CYP450、UGTs、ATS 等;涉及的關(guān)鍵酶有SRD5β、3β-HSD和CYP11A1 等,研究人員從蟾蜍耳后腺中克隆了3β-羥基類固醇脫氫酶(3βHSD)和類固醇5β-還原酶(5βSRD)[9-10],并推測(cè)這2 種酶是將BDs 母核A/B 環(huán)轉(zhuǎn)化為順式構(gòu)型的關(guān)鍵酶,其中3βHSD 是類固醇生成組織中孕酮、雌激素和雄激素生物合成的重要步驟,可分別催化孕烯醇酮和脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化為孕酮和雄烯二酮;5βSRD 催化孕酮為孕烯醇酮,可以將孕酮還原為5β-二氫孕酮;CYP11A1 在工程酵母試驗(yàn)中被鑒定為切割膽固醇側(cè)鏈的酶[11]。這些結(jié)果推動(dòng)了BDs 類化合物合成途徑的研究進(jìn)展,但到目前為止,人們對(duì)其合成途徑中諸多中間體轉(zhuǎn)化所涉及的基因和酶的了解仍處于初級(jí)階段,還需進(jìn)一步挖掘和研究。

    1 材料

    中華大蟾蜍樣品捕獲于課題組自養(yǎng)2 年齡材料,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)侯飛俠副教授鑒定為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor。

    2 方法

    2.1 樣品采集和前處理

    樣品經(jīng)無(wú)菌水洗凈,乙醚麻醉后剪取皮膚,挑取背部疣粒和耳后腺體,置于磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline,PBS)溶液中洗凈,放入盛有OCT 包埋劑的包埋盒中,立即放入液氮速凍后置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?,?shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

    2.2 蟾蜍腺體切片制備和顯微觀察

    冷凍組織置Thermo 冷凍切片機(jī)中切片,切片厚度10~15 μm。采用連續(xù)切片法,選取厚薄均勻、完整的切片,用75%~90%梯度酒精洗脫固定后染色。染色方法如下:蘇木素染色2~3 min,蒸餾水洗去浮色,分化液3 min,伊紅染色3 s,蒸餾水洗去浮色,梯度乙醇(90%~75%)洗脫,風(fēng)干,光學(xué)顯微鏡下觀察。

    2.3 激光顯微切割捕獲分泌腺

    冷凍切片在無(wú)酶水中洗去包埋劑,浸泡在無(wú)水乙醇:冰乙酸(19∶1)溶液中固定2~3 min,使用LeicaDFC7000T 激光捕獲顯微切割儀器進(jìn)行目標(biāo)材料捕獲。實(shí)驗(yàn)前調(diào)試焦距和激光強(qiáng)度等參數(shù),選擇合適的繪圖工具分別切下耳后腺中漿液腺(CE)、背部疣粒中粘液腺(CN)和漿液腺(CK)3 種分泌腺,每種分泌腺細(xì)胞數(shù)量不少于5 000 個(gè)。使用含細(xì)胞裂解液的無(wú)酶PCR 管收集捕獲的細(xì)胞,瞬時(shí)離心,?80 ℃冷凍后用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

    2.4 轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)和測(cè)序

    采用DNBSEQ Low Input Smart-Seq Eukaryotic mRNA library 方法對(duì)捕獲的分泌腺細(xì)胞進(jìn)行建庫(kù),利用DNBSEQ 和PE100 方法測(cè)序。通過(guò)SOAPnuke軟件清除原始數(shù)據(jù)里包含接頭,未知堿基(N 含量大于5%)以及低質(zhì)量的reads,獲得Clean reads。

    2.5 生物信息學(xué)分析

    2.5.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的質(zhì)控、比對(duì)和定量分析 利用FastQC、Fastp 軟件對(duì)Clean reads 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估及剪切、過(guò)濾接頭和低質(zhì)量序列,得到高質(zhì)量clean data。使用STAR-2.6.1b[17]軟件將轉(zhuǎn)錄本比對(duì)在參考基因組中(ASM1485885v1),計(jì)算每個(gè)樣品的比對(duì)率。用featureCounts(1.6.0)[18]計(jì)算定量獲得表達(dá)矩陣。用R 軟件包DESeq2 根據(jù)原始表達(dá)矩陣構(gòu)建dds 矩陣,計(jì)算差異表達(dá)基因及對(duì)樣品做主成分分析,使用偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)來(lái)校正多次檢測(cè)的P值(FDR≤0.05),并使用表達(dá)水平差異的倍數(shù)的雙對(duì)倍數(shù)(log2FC)來(lái)確定基因表達(dá)的顯著性差異(log2FC≥2)。

    2.5.2 差異基因的功能富集分析 注釋序列用蛋白序列(GCF-014858855.1-ASM1485885v1- protein.faa)在eggnog-mapper[eggNOG-mapper (embl.de)]網(wǎng)站中注釋,作為GO 富集的背景基因集,使用clusterProfiler(4.4.4)R 包[19]進(jìn)行GO 富集分析。同時(shí)將蛋白序列上傳到KAAS [KAAS-KEGG Automatic Annotation Server(genome.jp)] 數(shù)據(jù)庫(kù)中,用單向最佳命中率(single-directional best-hit,SBH)方法,以非洲爪蟾Xenopuslaevis、熱帶爪蟾Xenopustropicalis、南非爪蟾Nanoranaparkeri和人Homosapiens作參考物種,預(yù)測(cè)功能并建立KEGG 背景基因集,使用clusterProfiler(4.4.4)R 包進(jìn)行KEGG 富集分析。

    太極虎遇到了同樣的厄運(yùn),長(zhǎng)劍總是在他身上不要命的地方淺淺的,一觸即收。太極虎不再是太極虎,而是一只病貓。他全身上下像篩子一樣冒著鮮血,人也因失血過(guò)多而恍忽,長(zhǎng)劍在求生的直覺(jué)支持下做著毫無(wú)目標(biāo)的胡亂揮動(dòng)。

    2.5.3 蟾酥藥效成分合成相關(guān)基因的蛋白互作分析和表達(dá)量分析 根據(jù)差異基因的GO 和KEGG 富集分析結(jié)果,結(jié)合PubMed 文獻(xiàn)庫(kù)檢索挑選出與甾體激素合成、類固醇合成代謝膽汁酸合成等相關(guān)功能和通路的基因,并在STRING[STRING: functional protein association networks (string-db.org)]網(wǎng)站中,以非洲爪蟾為參考背景建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò),并用Cytoscape(3.7.1)[20]繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

    選取上述分析后存在互作關(guān)系的基因,關(guān)聯(lián)到樣品表達(dá)量矩陣中,使用微生信網(wǎng)站(https://bioinformatics.com.cn/plot_basic_ballon_plot_0 48)的小工具繪制表達(dá)量氣泡圖。

    2.6 熒光定量PCR 驗(yàn)證

    選取轉(zhuǎn)錄組中識(shí)別的9 個(gè)參與BDs 合成相關(guān)差異表達(dá)基因,進(jìn)行熒光定量PCR(qRT-RCR)驗(yàn)證。以測(cè)序?qū)嶒?yàn)同批次樣品的cDNA 為模板,使用GAPDH為內(nèi)參基因,利用CDS 序列和Primer 5 軟件設(shè)計(jì)qRT-RCR 特異性引物。采用SsoFastTMEva Green Su-peremix(Bio-Rad,USA)進(jìn)行定量表達(dá)檢測(cè),采用2?ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 中華大蟾蜍分泌腺顯微觀察

    中華大蟾蜍背部疣粒的分布呈現(xiàn)從脊椎向兩側(cè)外延逐漸減少的趨勢(shì)(圖1-a)。耳后腺顯微切片觀察發(fā)現(xiàn)其中的漿液腺形態(tài)呈橢圓形,幾乎充滿真皮層,腺體呈一字型緊密分布,兩側(cè)的漿液腺形態(tài)較小,中間的較大(圖1-b),其外圍分布大量的分泌細(xì)胞(圖1-c)。背部疣粒切片可觀察到疣粒中央散在分布有2~4 個(gè)較大的圓形漿液腺(圖1-d),表皮下方分布2~6 個(gè)圓形的粘液腺(圖1-e)。

    圖1 中華大蟾蜍形態(tài)及分泌腺顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Morphology and secretory gland microstructure of Bufo bufo gargarizans

    3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與比對(duì)結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)測(cè)得9 個(gè)樣品共計(jì)clean reads 63.01 Gb,平均GC 含量44.45%,平均Q2096.85%,與參考基因組(ASM1485885v1)的平均比對(duì)率為74.87%(表1)。背景基因集注釋了26 064 條GO terms,24 823 KEGG通路,注釋和比對(duì)質(zhì)量較好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    表1 中華大蟾蜍分泌腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及比對(duì)數(shù)據(jù)Table 1 Transcriptome sequencing and comparison data of secretory gland of Bufo bufo gargarizans

    3.3 差異基因表達(dá)分析及富集結(jié)果

    3.3.1 差異基因表達(dá)基因分析 主成分分析顯示各生物學(xué)重復(fù)的樣本聚集,可得知每組樣本之間具有特異性,表明了數(shù)據(jù)的可靠性(圖2-a)。3 種分泌腺中共檢測(cè)到4 550 個(gè)差異基因(DEGs),其中樣品CE較CK 上調(diào)62 個(gè)基因,下調(diào)254 個(gè)基因(圖2-b);CE 較CN 上調(diào)1 062 個(gè)基因,下調(diào)713 個(gè)基因(圖2-c);CK 較CN 上調(diào)1 744 個(gè)基因,下調(diào)712 個(gè)基因(圖2-d);CE 和CK 共有上調(diào)基因880 個(gè)。

    圖2 樣品間差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)及主成分分析圖Fig.2 Number statistics and principal component analysis of differentially expressed genes among samples

    3.3.2 差異基因富集分析 將差異基因進(jìn)行KEGG和GO 富集分析以深入了解差異基因的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示,樣品CK 和CE 共有316 個(gè)DEGs,其中CK 較CE 上調(diào)DEGs 254 個(gè)(P<0.05,log2FC≥2),GO 富集主要涉及含吡啶化合物的代謝(GO:0072524)、脂肪酸分解代謝(GO:0009062)、羧酸分解代謝(GO:0046395)和過(guò)氧化物酶體(GO:0005777);KEGG 通路主要富集在甾類激素生物合成(ko00140)、過(guò)氧酶體(ko04146)、原代脂肪酸代謝(ko00120)和花生四烯酸途徑(ko00590)等途徑。CK 較CE 下調(diào)62 個(gè)DEGs(P<0.05,log2FC≥2),GO 富集功能主要在含吡啶化合物的代謝過(guò)程(GO:0072524)、雌二醇-17β-脫氫酶活性(GO:0004303)、有機(jī)酸分解代謝過(guò)程(GO:0016054)、羧酸分解代謝過(guò)程(GO:0046395)和甲基轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0008168)等;在KEGG富集主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(ko00280)、甾類激素生物合成(ko00140)、類固醇生物合成(ko00100)等。

    樣品CE 和CN 共存在1 775 個(gè)DEGs,其中CE 較CN 上調(diào)1062 個(gè)DEGs(P<0.05,log2FC≥2),GO 富集主要涉及類固醇的生物合成( GO:0006694 )、類固醇代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)(GO:0019218)、花生四烯酸的分泌(GO:0050482)和泛素樣蛋白連接酶活性(GO:0061659)等;KEGG富集涉及通路有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(ko00260)、脂肪酸降解(ko00071)和乙醛酸和二羧酸代謝(ko00630)等。CE 較CN 下調(diào)713 個(gè)DEGs(P<0.05,log2FC≥2),GO 功能富集主要涉及粘液層(GO:0070701)、蛋白-O-糖基化(GO:0006493)、細(xì)胞對(duì)凝集素的反應(yīng)(GO:1990858)和先天免疫反應(yīng)激活細(xì)胞表面受體信號(hào)通路(GO:00022200)等;KEGG 富集主要涉及礦物質(zhì)的吸收(ko04978)、甲狀腺激素信號(hào)通路(ko04919)、細(xì)胞粘結(jié)(ko04510)和JAK-STAT 信號(hào)通路和軸突導(dǎo)向(ko04360)等。

    樣品CK 與CN 共有2 457 個(gè)DEGs,其中CK較CN 上調(diào)1 744 個(gè)DEGs((P<0.05,log2FC≥2),GO 富集主要涉及在有機(jī)酸分解代謝過(guò)程(GO:0016054)、類固醇生物合成的過(guò)程(GO:0006694)、17-00 甾酮還原酶活性(GO:0072555)和c21 甾體激素生物合成過(guò)程(GO:0006700)等;KEGG 富集主要涉及過(guò)氧酶體通路(ko04146)、甾類激素生物合成(ko00140)、P40 細(xì)胞色素對(duì)外源的代謝作用(ko00980)和氨基苯甲酸酯降解(ko00627)等。CK 較CN 下調(diào)712 個(gè)DEGs(P<0.05,log2FC≥2),GO 功能富集主要有蛋白質(zhì)糖基化(GO:0006486)、刺激C 型凝集素受體信號(hào)通路(GO:0002223)、外源凝集素響應(yīng)答(GO:1990858)和體液免疫應(yīng)答(GO:0006959)等;KEGG 主要富集在ECM-受體交互通路、細(xì)胞粘附(ko04510)和中性粒細(xì)胞外陷阱形成(ko04613)等通路。

    3.4 蟾酥藥效成分生物合成基因的篩選

    BDs 生物合成途徑很可能是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[20],目前研究的途徑主要有兩種,一是通過(guò)甲羥戊酸→膽固醇→孕烯醇酮→孕酮→強(qiáng)心甾類[21],二是膽固醇通過(guò)膽汁酸合成途徑合成蟾毒內(nèi)酯類化合物[4],結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),在樣品CE、CK 上調(diào)差異基因的功能富集結(jié)果中檢索出包括類固醇、睪酮、雌二醇、前列腺素、雄甾酮、花生四烯酸、石膽酸、膽汁酸在內(nèi)的28 種物質(zhì)的代謝、合成及運(yùn)輸?shù)裙δ埽l(fā)現(xiàn)94 個(gè)基因參與調(diào)控,見表2。

    表2 蟾酥藥效成分合成相關(guān)功能基因展示Table 2 Display of functional genes related to synthesis of drug constituents of bufonis venenum

    3.4.1 相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 為進(jìn)一步探究上述基因之間的關(guān)系(圖3),利用近緣物種非洲爪蟾X.laevis作參考數(shù)據(jù)集,將上述基因在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中計(jì)算,結(jié)果顯示94 個(gè)基因中有34 個(gè)基因存在互作關(guān)系,如圖4 所示,主網(wǎng)絡(luò)富集的KEGG途徑是初級(jí)膽汁酸生物合成(XLA00120);纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降(XLA00280)、丙氨酸代謝(XLA00640)及脂肪酸生物合成(XLA01040)等。其中的HUB 蛋白有:?;?CoA 氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1, acox1)、甾醇載體蛋白2(sterol carrier protein 2,scp2)、酰基輔酶A 硫代酯酶8(acyl-CoA thioesterase 8,acot8)及羥基類固醇 17-β 脫氫酶 4 型(hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 4,Hsd17b4.L)等。進(jìn)一步根據(jù)STING 網(wǎng)站計(jì)算的KEGG 途徑,發(fā)現(xiàn)基因AMACR、HSD17B4、SCP2和ACOT8參與調(diào)控初級(jí)膽汁酸合成(圖5),基因LOC122926609參與調(diào)控石膽酸結(jié)合,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),推測(cè)BDs 合成途徑之一是通過(guò)膽汁酸初級(jí)合成過(guò)程,石膽酸可能是該途徑中BDs 類化合物的重要前體。

    圖3 蟾酥藥效成分合成相關(guān)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Interaction network diagram of gene proteins related to synthesis of effective component of Bufonis venenum

    圖4 BDs 合成相關(guān)基因與表達(dá)量關(guān)聯(lián)分析氣泡圖Fig.4 Bubble map of BDs synthesis-related genes correlated with expression levels

    圖5 BDs 生物合成途徑推測(cè)Fig.5 Predicted map of BDs biosynthetic pathway

    3.4.2 相關(guān)基因的表達(dá)量分析 為探求“2.4”項(xiàng)中的基因在樣品CE 組、CK 組和CN 組的表達(dá)情況,將上述存在互作關(guān)系的基因和參與石膽酸結(jié)合的基因LOC122926609均關(guān)聯(lián)到表達(dá)量矩陣中。分析結(jié)果顯示,大部分基因在CE 組和CK 組的表達(dá)量大于在CN組;通過(guò)與表達(dá)量數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)及前面的蛋白互作分析,可以側(cè)面驗(yàn)證這些基因可能是BDs 下游合成途徑(膽汁酸合成途徑)的關(guān)鍵基因。據(jù)前文描述,發(fā)現(xiàn)基因AMACR、HSD17B4、SCP2和ACOT8參與調(diào)控初級(jí)膽汁酸合成,將該途徑調(diào)出,并將上述基因表達(dá)氣泡附上,如圖5 所示,推測(cè)該途徑是BDs 下游合成途徑,上述4 個(gè)基因是調(diào)控該途徑的關(guān)鍵基因。

    3.5 熒光定量PCR 驗(yàn)證

    本研究為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,從34 個(gè)基因中選取9 個(gè)與BDs 合成相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證。分析目的基因在9 個(gè)組別中的表達(dá)差異,與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。結(jié)果顯示這9 個(gè)基因的基因表達(dá)量差異與測(cè)序結(jié)果具有一致性,結(jié)果見圖6。

    圖6 差異基因qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.6 qRT-PCR verification of differential genes

    4 討論

    4.1 激光捕獲顯微切割技術(shù)在中藥有效成分分子機(jī)制研究中的應(yīng)用

    激光捕獲顯微切割在腫瘤細(xì)胞的分離、病理組織的分離及大腦細(xì)胞的分離等方面技術(shù)非常成熟[22-23],通常與其他技術(shù)如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等聯(lián)合[24-27],在空間角度分析樣品間的功能及成分分析上提供技術(shù)支撐[28]。但此技術(shù)在中藥中應(yīng)用極少,而中藥材恰恰具有不同部位不同功效的特殊性,LCM 技術(shù)的應(yīng)用可把藥用部位的研究精準(zhǔn)到細(xì)胞類群上,推進(jìn)藥用動(dòng)植物的表觀與其基因間的聯(lián)系。蟾蜍皮膚腺體作為蟾酥分泌合成的重要組織,目前的研究?jī)H停留在組織水平上,造成組織內(nèi)細(xì)胞功能平均化。

    有報(bào)道解析了蟾蜍3 個(gè)部位(耳后腺、背部皮膚、腹部皮膚)的基因表達(dá)譜[29],并闡述了耳后腺及背部皮膚富集了毒素成分相關(guān)的功能和通路。本研究從中華大蟾蜍耳后腺和背部皮膚腺體中分離出漿液腺和粘液腺,發(fā)現(xiàn)漿液腺整體上調(diào)差異基因的富集除基礎(chǔ)的代謝外,主要有甾體激素的合成、膽固醇代謝、膽汁酸合成等;另外,在“2.4”項(xiàng)中發(fā)現(xiàn)存在互作關(guān)系的 34 個(gè)基因除個(gè)別基因LOC122926609、VEGFA等在CE 中表達(dá)量高于CK外,其余大部分基因在CE 和CK 中表達(dá)相當(dāng),推測(cè)背側(cè)漿液腺和耳后腺漿液腺都具有合成BDs 類成分的潛力。

    4.2 BDs 類化合物合成途徑關(guān)鍵基因推測(cè)

    BDs 類成分廣泛用于各種癌癥,在肝癌、胰腺癌和乳腺癌等多種癌細(xì)胞治療具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用[30-33],是癌癥治療的潛在藥物,該化合物是一類甾體強(qiáng)心苷,在C-17 位與六元不飽和內(nèi)酯環(huán)(α-吡喃酮環(huán))相連[4]。目前對(duì)這類成分的研究,主要還是藥理及化學(xué)合成方向,生物合成的研究較少。但早在1998 年,研究者就對(duì)動(dòng)植物中合成的BDs類成分的情況作出統(tǒng)計(jì),在植物中,主要由景天科、風(fēng)信子科、鳶尾科、楝樹科、毛茛科及檀香科植物合成;動(dòng)物則主要存在于蟾蜍、螢火蟲、頸槽蛇屬及某些哺乳動(dòng)物中[34],不過(guò)后續(xù)更加具體的工作進(jìn)展緩慢。近幾年開始興起對(duì)該類化合物的合成途徑關(guān)鍵基因的驗(yàn)證,如驗(yàn)證基因酶SRD5β 和3βHSD在孕烯醇酮-孕酮-二氫孕酮轉(zhuǎn)化等[9-10]。除此之外,對(duì)BDs 合成路線的推測(cè)的研究也有一定的進(jìn)展,一是參考洋地黃苷(五元內(nèi)酯環(huán))的合成途徑:甲羥戊酸→膽固醇→孕烯醇酮→孕酮→強(qiáng)心甾類,該途徑的特點(diǎn)是膽固醇到孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化過(guò)程中,膽固醇側(cè)鏈斷開,后由丙二酰輔酶A 提供?;纬晌逶獌?nèi)酯環(huán)[21];二是膽固醇經(jīng)膽汁酸初步合成途徑合成石膽酸,以石膽酸為中間體經(jīng)系列反應(yīng)合成BDs[11]。

    在本研究中對(duì)BDs 合成路線的推導(dǎo),更偏向于初級(jí)膽汁酸途徑。本課題組在CE、CK 樣品上調(diào)的差異基因的富集分析中發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因參與調(diào)控膽汁酸合成,且基因AMACR、HSD17B4、ACOT8及SCP2存在較強(qiáng)的互作關(guān)系,并在CE 和CK 中表達(dá)趨勢(shì)一致,且并未發(fā)現(xiàn)有基因參與調(diào)控孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化。除此之外,查閱文獻(xiàn)得知,同時(shí)給蟾蜍和紅海蔥接種孕烯醇酮-20-14C,孕烯醇酮是紅海蔥中BDs 的良好前體,但在蟾蜍中并不能得到此結(jié)果,推測(cè)孕烯醇酮不是蟾蜍體內(nèi)合成BDs 的重要中間體[35];另外有研究從蟾蜍毒液分離出7-α 羥基膽固醇和7-β 羥基膽固醇[35],這2 種化合物是膽汁酸生物合成的重要中間體,該結(jié)果表明蟾蜍BDs 類化合物的合成經(jīng)由膽固醇-膽汁酸鹽途徑[36],由此,推測(cè)BDs 生物合成經(jīng)由膽汁酸初級(jí)合成途徑合成石膽酸,再經(jīng)系列反應(yīng)合成BDS 類成分母核?;駻MACR、HSD17B4、ACOT8和SCP2及LOC122926609該途徑的關(guān)鍵基因,作者已開展對(duì)上述基因功能的驗(yàn)證,以期能探索 BDs 類成分的生物合成路線。

    BDs 是一類重要的抗癌化合物,研究其生物合成途徑是開發(fā)相關(guān)臨床藥物的重要基礎(chǔ),而其合成途徑關(guān)鍵基因的挖掘是推進(jìn)該途徑的重要研究歷程。本研究從微觀的腺體細(xì)胞著手,探究中華大蟾蜍兩種不同功能的外分泌腺差異基因的表達(dá),通過(guò)生物信息學(xué)等手段推測(cè)出BDs 下游合成途徑的關(guān)鍵基因,旨在探究BDs 生物合成的分子機(jī)制。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    烯醇蟾蜍差異基因
    ICR鼠肝和腎毒性損傷生物標(biāo)志物的篩選
    高效液相色譜法測(cè)定小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇
    蟾蜍是誰(shuí)?
    遠(yuǎn)行的蟾蜍 外一篇
    基于RNA 測(cè)序研究人參二醇對(duì)大鼠心血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)的影響 (正文見第26 頁(yè))
    兩種氯前列烯醇誘導(dǎo)母豬同期分娩的研究
    蟾蜍記
    蟾蜍記.上
    脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的制備與鑒定
    SSH技術(shù)在絲狀真菌功能基因篩選中的應(yīng)用
    麻豆国产97在线/欧美 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久草成人影院| 亚洲 欧美一区二区三区| 在线观看66精品国产| 男女午夜视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 很黄的视频免费| 观看免费一级毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 亚洲最大成人中文| 在线观看一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美极品一区二区三区四区| 国产免费男女视频| 欧美在线黄色| 18禁美女被吸乳视频| 成年免费大片在线观看| 超碰成人久久| avwww免费| а√天堂www在线а√下载| 日本一区二区免费在线视频| 久久精品国产综合久久久| 精品电影一区二区在线| 欧美性猛交黑人性爽| 99精品久久久久人妻精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜两性在线视频| 美女黄网站色视频| 午夜福利视频1000在线观看| 免费观看精品视频网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩三级视频一区二区三区| 99在线视频只有这里精品首页| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产一区二区三区视频了| 亚洲成人国产一区在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 天堂影院成人在线观看| 国产一区二区三区视频了| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美日韩福利视频一区二区| netflix在线观看网站| 亚洲全国av大片| 亚洲中文av在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 免费看日本二区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美午夜高清在线| 91成年电影在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| tocl精华| 欧美国产日韩亚洲一区| 中文字幕高清在线视频| 级片在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日本成人三级电影网站| 美女大奶头视频| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲九九香蕉| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线看三级毛片| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 色综合亚洲欧美另类图片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲国产精品成人综合色| 黄色片一级片一级黄色片| 黄色a级毛片大全视频| 欧美精品亚洲一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 美女大奶头视频| 91成年电影在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美黑人巨大hd| 99在线视频只有这里精品首页| 制服人妻中文乱码| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 黑人操中国人逼视频| 在线观看66精品国产| 成人国产一区最新在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 中文字幕熟女人妻在线| 成在线人永久免费视频| 亚洲五月天丁香| 国产成人精品无人区| 可以在线观看的亚洲视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产激情欧美一区二区| 欧美日韩精品网址| 少妇粗大呻吟视频| 国产一区二区在线观看日韩 | 午夜精品一区二区三区免费看| 日日爽夜夜爽网站| 国产爱豆传媒在线观看 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 99re在线观看精品视频| 欧美乱妇无乱码| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精华国产精华精| 日韩欧美 国产精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 性欧美人与动物交配| 岛国在线观看网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲成人久久爱视频| 国产精品 欧美亚洲| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美另类亚洲清纯唯美| www日本在线高清视频| 老汉色∧v一级毛片| 成人国产一区最新在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 日本一二三区视频观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一本精品99久久精品77| 91在线观看av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品一区二区三区四区久久| 桃色一区二区三区在线观看| 日本成人三级电影网站| 亚洲av电影在线进入| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久精品综合一区二区三区| 91av网站免费观看| tocl精华| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色老头精品视频在线观看| 熟女电影av网| 午夜福利欧美成人| 久久中文字幕一级| 国产成人aa在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 小说图片视频综合网站| 久久亚洲精品不卡| 一个人免费在线观看电影 | 1024手机看黄色片| 久久国产精品人妻蜜桃| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美在线黄色| 男女视频在线观看网站免费 | 国产精品av久久久久免费| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久性视频一级片| 国产熟女xx| 日本免费一区二区三区高清不卡| 精品人妻1区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 看免费av毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 黄色女人牲交| 亚洲黑人精品在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产男靠女视频免费网站| 久久久国产精品麻豆| av福利片在线| 国产探花在线观看一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 男女床上黄色一级片免费看| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产主播在线观看一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品高清国产在线一区| 免费在线观看完整版高清| 久久这里只有精品19| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲九九香蕉| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美色视频一区免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 黄色视频不卡| 正在播放国产对白刺激| 日韩欧美精品v在线| 又大又爽又粗| 无限看片的www在线观看| 国产精品一及| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产男靠女视频免费网站| 俺也久久电影网| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲熟妇熟女久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99国产精品一区二区三区| 亚洲av成人av| 伦理电影免费视频| 美女大奶头视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一级黄色大片毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品,欧美在线| 成年免费大片在线观看| 嫩草影视91久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 成人一区二区视频在线观看| 宅男免费午夜| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品电影一区二区在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 手机成人av网站| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| tocl精华| 亚洲中文字幕日韩| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲最大成人中文| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲成av人片免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| av中文乱码字幕在线| or卡值多少钱| 日日爽夜夜爽网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 制服人妻中文乱码| 午夜福利欧美成人| 精品久久蜜臀av无| 国产av在哪里看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 曰老女人黄片| 国产亚洲精品久久久久5区| 可以在线观看毛片的网站| www日本黄色视频网| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久久久久精品吃奶| 一本大道久久a久久精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产在线观看jvid| 国产麻豆成人av免费视频| 91在线观看av| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美在线一区亚洲| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美中文日本在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲人成电影免费在线| 不卡一级毛片| 制服诱惑二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩高清综合在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 中文字幕熟女人妻在线| 中文字幕高清在线视频| 久久精品影院6| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品久久久久久精品电影| 中出人妻视频一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 麻豆国产av国片精品| 一级黄色大片毛片| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲午夜理论影院| 国产精品爽爽va在线观看网站| 怎么达到女性高潮| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲av成人精品一区久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日韩有码中文字幕| 看黄色毛片网站| 日本成人三级电影网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 99久久精品热视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产亚洲精品久久久久5区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 看黄色毛片网站| 亚洲真实伦在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 免费在线观看成人毛片| 一二三四在线观看免费中文在| 久久香蕉国产精品| 欧美中文综合在线视频| 欧美中文综合在线视频| 久久精品人妻少妇| cao死你这个sao货| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品在线观看二区| av视频在线观看入口| 日韩欧美在线二视频| 日韩免费av在线播放| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产v大片淫在线免费观看| √禁漫天堂资源中文www| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91av网站免费观看| 国产久久久一区二区三区| 日本黄大片高清| 日本 av在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 搞女人的毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精华国产精华精| 制服人妻中文乱码| 精品国产乱子伦一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| www日本黄色视频网| 国产精华一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 村上凉子中文字幕在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 人人妻人人看人人澡| 国产精品久久久av美女十八| a在线观看视频网站| 亚洲成av人片在线播放无| 久久亚洲精品不卡| 日本一区二区免费在线视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久久久人人人人人| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲av成人一区二区三| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产亚洲欧美98| 身体一侧抽搐| 久久亚洲真实| 一区二区三区国产精品乱码| 婷婷六月久久综合丁香| 免费在线观看成人毛片| 全区人妻精品视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 最新美女视频免费是黄的| 色在线成人网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国内精品一区二区在线观看| 久久久久久久午夜电影| 日本在线视频免费播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久久九九精品影院| 国产熟女xx| 婷婷六月久久综合丁香| 国产黄色小视频在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜福利在线观看吧| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美成人午夜精品| 久久久精品欧美日韩精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品久久久久久,| 制服诱惑二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久久久久久免费视频了| 少妇粗大呻吟视频| 最近最新免费中文字幕在线| 国产亚洲精品一区二区www| 深夜精品福利| 婷婷丁香在线五月| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精华国产精华精| 中文资源天堂在线| 天堂动漫精品| 校园春色视频在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一本久久中文字幕| 欧美性长视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| 97碰自拍视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产成人啪精品午夜网站| a级毛片a级免费在线| 一进一出抽搐动态| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 免费在线观看完整版高清| 久久久久国产一级毛片高清牌| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 禁无遮挡网站| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| av有码第一页| 欧美大码av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 看黄色毛片网站| 88av欧美| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲专区中文字幕在线| 麻豆av在线久日| 少妇熟女aⅴ在线视频| a级毛片a级免费在线| 日韩欧美国产在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品成人免费网站| 日韩国内少妇激情av| 久久精品综合一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 在线观看午夜福利视频| 一本大道久久a久久精品| 日韩三级视频一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲乱码一区二区免费版| 一级作爱视频免费观看| av福利片在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| www.精华液| 午夜福利18| 久99久视频精品免费| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲人成网站高清观看| 一级a爱片免费观看的视频| 无人区码免费观看不卡| 午夜两性在线视频| 成人午夜高清在线视频| 成人精品一区二区免费| 日韩欧美三级三区| 女人被狂操c到高潮| 男人舔女人的私密视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久伊人香网站| 久久人人精品亚洲av| 在线观看日韩欧美| 午夜两性在线视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91在线观看av| 国产一区二区激情短视频| 久久伊人香网站| av在线播放免费不卡| 亚洲人与动物交配视频| 精品国产亚洲在线| 亚洲国产精品成人综合色| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久亚洲真实| 韩国av一区二区三区四区| 黄片小视频在线播放| 成人18禁在线播放| av在线播放免费不卡| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩免费av在线播放| 久久九九热精品免费| 日本成人三级电影网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美成狂野欧美在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品一区二区三区四区久久| 成人18禁在线播放| 欧美在线黄色| e午夜精品久久久久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人精品无人区| 欧美日本视频| videosex国产| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 中出人妻视频一区二区| 午夜福利18| 性欧美人与动物交配| 免费看a级黄色片| 很黄的视频免费| 国产一区二区三区视频了| 91国产中文字幕| 国产黄片美女视频| cao死你这个sao货| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产1区2区3区精品| 99在线人妻在线中文字幕| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 1024香蕉在线观看| 亚洲第一电影网av| 亚洲美女视频黄频| √禁漫天堂资源中文www| 一区福利在线观看| 校园春色视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 久久这里只有精品19| 老熟妇仑乱视频hdxx| 青草久久国产| 一区二区三区激情视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美zozozo另类| 亚洲一区中文字幕在线| 精品免费久久久久久久清纯| 日本熟妇午夜| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产亚洲精品一区二区www| videosex国产| 久久热在线av| 欧美黄色片欧美黄色片| 正在播放国产对白刺激| 他把我摸到了高潮在线观看| 正在播放国产对白刺激| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美午夜高清在线| 天堂影院成人在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 正在播放国产对白刺激| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜久久久久精精品| 国产私拍福利视频在线观看| 日本一本二区三区精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 一本精品99久久精品77| 男女床上黄色一级片免费看| 淫妇啪啪啪对白视频| 天堂动漫精品| 一级毛片高清免费大全| 国产精品九九99| 亚洲国产欧美网| 免费观看人在逋| 亚洲专区字幕在线| 欧美zozozo另类| 岛国在线观看网站| 日本 欧美在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产视频一区二区在线看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产一区二区三区视频了| 操出白浆在线播放| 国产av在哪里看| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲片人在线观看| 99热这里只有是精品50| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲一区二区三区不卡视频| 69av精品久久久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美成狂野欧美在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 男女床上黄色一级片免费看| 高清在线国产一区| 亚洲av成人av| 黑人操中国人逼视频| 大型av网站在线播放| 精品福利观看| 久久午夜亚洲精品久久| 97碰自拍视频| 欧美中文日本在线观看视频| 久久这里只有精品中国| 最近最新中文字幕大全电影3| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产成人精品无人区| 熟女电影av网| 久久久国产成人免费| 欧美又色又爽又黄视频| 首页视频小说图片口味搜索| 日本 av在线| 国内精品久久久久精免费| or卡值多少钱| 一本大道久久a久久精品| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成人久久性| 亚洲欧美激情综合另类| 美女大奶头视频| 在线播放国产精品三级| 十八禁网站免费在线| 91在线观看av| 老鸭窝网址在线观看| 国产99白浆流出| 精品无人区乱码1区二区| 精品久久久久久,| 久久久久精品国产欧美久久久| 波多野结衣高清作品| 91在线观看av| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色 视频免费看| 中文字幕精品亚洲无线码一区|