• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    煙草脆裂病毒介導(dǎo)的人參基因沉默體系的構(gòu)建

    2024-01-09 00:46:22李冉琪李雅淑湯淼淼曲正義鄭培和
    中草藥 2024年1期
    關(guān)鍵詞:菌液侵染表型

    李冉琪,李雅淑,湯淼淼,曲正義,鄭培和,侯 微*

    1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130112

    2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林 吉林 132109

    基因沉默現(xiàn)象是一種由雙鏈 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引起的基因表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象,是一種基于序列同源性的過(guò)程[1]。在真核生物中,基因沉默又稱(chēng)為RNA 干擾(RNA interference,RNAi)。這一現(xiàn)象首次發(fā)現(xiàn)于1990 年,Carolyn Napoli 等將花椰菜花葉病毒的35S 啟動(dòng)子與查耳酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的編碼序列融合,將重組的CHS基因通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入矮牽牛中,期望加深矮牽?;ǖ淖仙?,但結(jié)果卻與預(yù)期完全相反:轉(zhuǎn)入的基因未表達(dá),且內(nèi)源CHS的表達(dá)水平也發(fā)生了下降,筆者將這種現(xiàn)象稱(chēng)為“可逆共抑制”(reversible co-suppression)[2]。對(duì)基因沉默現(xiàn)象機(jī)制的認(rèn)識(shí)來(lái)源于1998年Fire等[3]的線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)是基因沉默現(xiàn)象的高效誘發(fā)因子。Mansoor 等[4]總結(jié)了植物體內(nèi)3 種不同的RNAi 機(jī)制:(1)轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),指dsRNA 在細(xì)胞質(zhì)中引起mRNA 的切割降解;(2)microRNAs(MiRNAs)與特定mRNAs 的堿基配對(duì)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá),導(dǎo)致內(nèi)源mRNA 降解或蛋白質(zhì)翻譯停止;(3)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS),是由于DNA 的序列特異性甲基化導(dǎo)致的基因沉默?;虺聊倪^(guò)程通常分為3 個(gè)步驟:(1)小RNA(small RNA,RNA)的形成。sRNA 由RNase III家族的Dicer 酶通過(guò)切割dsRNA 形成,長(zhǎng)度一般為19~25 個(gè)核苷酸,序列與目標(biāo)mRNA 互補(bǔ)[5],包括小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和Piwi 相互作用RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA)[6]。(2)sRNA與RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合,RISC 獲得剪切活性。部分sRNA 還可以在 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的作用下繼續(xù)合成dsRNA 以放大沉默效果[7]。(3)具有活性的RISC 與目標(biāo)mRNA 結(jié)合,降解目標(biāo)RNA或抑制其翻譯。RISC 不僅可以介導(dǎo)PTGS,還可以介導(dǎo)TGS[8]。利用這一原理,近年來(lái),病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技術(shù)在研究植物功能基因方面得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。VIGS 技術(shù)是是一種功能基因組學(xué)工具,將目的基因的cDNA 片段通過(guò)病毒載體導(dǎo)入植株,引起同源基因mRNA 的降解或基因本身的甲基化修飾,目的基因被沉默進(jìn)而造成植株產(chǎn)生表型變化,從而達(dá)到驗(yàn)證基因功能的目的[9]。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)是類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶,該基因被沉默后葉片因失去類(lèi)胡蘿卜素的光保護(hù)作用而通常表現(xiàn)出光漂白現(xiàn)象,表型明顯,易于觀察。因此在多種植物基因沉默體系的構(gòu)建中,PDS基因常作為沉默靶基因被選用,如擬南芥[10]、小麥[11]、辣椒[12]、高粱[13]等。在病毒載體的選擇上,煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)應(yīng)用最為廣泛,相對(duì)于其他病毒載體,其具有沉默效果持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、效率高、癥狀輕等優(yōu)點(diǎn)。通常使用農(nóng)桿菌侵染法將病毒載體導(dǎo)入植物體內(nèi)。

    人參PanaxginsengC.A.Meyer 是五加科人參屬多年生草本植物,是一種名貴中藥。作為一種根類(lèi)藥用植物,人們對(duì)其的關(guān)注點(diǎn)大多在人參中的活性成分人參皂苷上,因而通過(guò)基因沉默手段研究的多是人參皂苷合成途徑中的基因,如達(dá)瑪烷合成酶(dammarenediol synthase,DDS)基因[14]、角鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase,SQE)基因[15-16]、β-香樹(shù)脂醇合酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因[17-18]等,實(shí)驗(yàn)對(duì)象也均為發(fā)根農(nóng)桿菌產(chǎn)生的毛狀根。同時(shí),發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系也為工業(yè)生產(chǎn)人參皂苷提供了新途徑[19-21]。但由于目前基于組織培養(yǎng)的人參再生體系尚不成熟[22],在毛狀根中建立的基因沉默體系并不能滿(mǎn)足對(duì)所有基因功能的研究。因此本實(shí)驗(yàn)旨在嘗試構(gòu)建人參植株中的基因沉默體系,利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化沉默載體實(shí)現(xiàn)侵染,為今后人參中基因功能的驗(yàn)證提供新的方法。

    1 材料

    1.1 植物材料、菌株與質(zhì)粒

    實(shí)驗(yàn)使用4 年生人參種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所溫室,大腸桿菌DH5α 購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司,農(nóng)桿菌LBA4404 購(gòu)于北京華越洋生物科技有限公司,病毒侵染載體pTRV1 和pTRV2 購(gòu)于武漢淼靈生物科技有限公司。

    1.2 試劑

    EcoRI 限制性?xún)?nèi)切酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),BamHI 限制性?xún)?nèi)切酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),TransZolUp Plus RNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司),pEASY?-T1 Simple Cloning Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司),TIANprep Mini Plasmid Kit(北京天根生化科技有限公司),TIANgel Midi Purification Kit(北京天根生化科技有限公司),PerfectStart?Uni RT&qPCR Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

    2 方法

    2.1 人參PDS 基因核心片段的克隆

    根據(jù)課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果,使用擬南芥AtPDS3基因的cDNA 序列作為參考進(jìn)行序列對(duì)比,選擇相似度高的序列作為候選基因。對(duì)基因序列進(jìn)行分析,使用NCBI 的Batch CD-search 工具預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域,作為核心片段的選取依據(jù)。使用Oligo 7 Primer Analysis Software 設(shè)計(jì)引物用于克隆PgPDS核心片段,引物位于人參PDS 家族基因的共有保守序列部分。上、下游引物分別添加EcoRI 和BamHI 酶切接頭序列(表1)。以人參cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增,切膠回收后進(jìn)行測(cè)序,確認(rèn)為目的基因片段。

    表1 所用到的引物Table 1 Primers used in this study

    2.2 pTRV2-pgPDS 侵染載體的構(gòu)建

    使用測(cè)序正確的回收片段進(jìn)行TA 克隆,將TA克隆質(zhì)粒、pTRV2 空載質(zhì)粒使用EcoRI 與BamHI分別進(jìn)行雙酶切,切膠回收PgPDS核心片段與線(xiàn)性化的pTRV2 載體,使用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接;產(chǎn)物測(cè)序顯示連接正確,熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,在含有50 mg/L 卡那霉素的平板上涂板篩選,挑取菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒pTRV2-PgPDS,根據(jù)說(shuō)明書(shū),將pTRV1、pTRV2 以及重組質(zhì)粒pTRV2-PgPDS分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,在含有50 mg/L 卡那霉素(Kan)和20 mg/L 的利福平(Rif)的平板上篩選陽(yáng)性菌落,挑取陽(yáng)性菌落于含有50 mg/L Kan 和20 mg/L Rif 的LB 液體培養(yǎng)基中,活化培養(yǎng)一段時(shí)間后使用對(duì)應(yīng)引物(表1)進(jìn)行菌液PCR 鑒定。

    2.3 沉默體系的建立

    分別取1 mL 轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌菌液加到15 mL 的LB 液體培養(yǎng)基(同樣含50 mg/L Kan 與20 mg/L Rif)中擴(kuò)大培養(yǎng),搖床設(shè)置28 ℃、200 r/min條件。待農(nóng)桿菌搖菌至A600=0.6 左右時(shí),5 000 r/min離心收集菌體,使用等體積侵染液(含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES 和200 μmol/L 乙酰丁香酮)輕輕重懸菌體,使菌液A600仍為0.6 左右,暗處培養(yǎng)4~6 h。后將等體積的pTRV1 農(nóng)桿菌重懸液與pTRV2 農(nóng)桿菌重懸液混合作為陰性對(duì)照,等體積的pTRV1 農(nóng)桿菌重懸液與pTRV2-PgPDS農(nóng)桿菌重懸液混合作為實(shí)驗(yàn)組,另設(shè)空白對(duì)照不做處理。采用菌液注射法,在葉片背面使用無(wú)菌注射器針頭制造傷口,但不刺透葉片,之后取下針頭,用注射器吸取1 mL 重懸菌液,壓緊傷口將菌液注射進(jìn)葉片直至傷口周?chē)鷧^(qū)域呈現(xiàn)水漬狀,每組設(shè)3 個(gè)重復(fù),侵染后的植株置于黑暗中24 h,之后于22 ℃、光周期為光照/黑暗12 h∶12 h 的溫室培養(yǎng)。

    2.4 qPCR 計(jì)算人參PgPDS 相對(duì)表達(dá)量

    每株于處理前、處理后第3 周以及處理后第5周采集葉片,提取總RNA,以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,使用引物qPDS-F 和qPDS-R(表1),通過(guò) qPCR 檢測(cè)內(nèi)源 PDS 基因的表達(dá)量,選擇PgGAPDH作為內(nèi)參基因[23],每個(gè)樣品進(jìn)行3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。為避免個(gè)體差異帶來(lái)的影響,本實(shí)驗(yàn)中未采用其他物種研究中以空白組為基準(zhǔn)計(jì)算陰性組與實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量的方法,而是將單株接種前后的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。具體操作如下:選取人參掌狀復(fù)葉上處于對(duì)稱(chēng)位置的2 片大葉片(圖1),接種前采集a1,后注射接種a2,一段時(shí)間后采集a2,計(jì)算表達(dá)量時(shí)以 a1為參比計(jì)算 a2的相對(duì)表達(dá)量。按照上述流程在每株上選取2 個(gè)掌狀復(fù)葉進(jìn)行操作,分別用于第3 周和第5 周的樣品采集以及表達(dá)量的計(jì)算。使用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析中的Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,使用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行圖表繪制。

    圖1 人參掌狀復(fù)葉Fig.1 Palmate compound leaf of Panax ginseng

    3 結(jié)果與分析

    3.1 PgPDS 基因核心片段的克隆

    根據(jù)序列比對(duì),篩選出2 條符合要求的序列,分別命名為PgPDS1 與PgPDS2。PgPDS1 基因cDNA序列全長(zhǎng)1 746 bp,編碼581 個(gè)氨基酸(圖2-A);PgPDS2 基因cDNA 序列全長(zhǎng)1 299 bp,編碼432 個(gè)氨基酸(圖2-B)。使用NCBI 中的Batch CD-search工具對(duì)2 條序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(圖3),結(jié)果顯示PgPDS1 與PgPDS2 蛋白均具有典型的PDS 蛋白結(jié)構(gòu)域,表示二者都屬于PDS超基因家族。使用植物總RNA 提取試劑盒提取人參葉片RNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以其為模板,使用引物PgPDS-F 與PgPDS-R(表1)擴(kuò)增PgPDS家族基因共有核心片段,克隆出的核心片段理論長(zhǎng)度為391 bp(圖4),片段大小符合預(yù)期。使用膠回收試劑盒回收目的基因片段用于后續(xù)載體構(gòu)建。

    圖2 PgPDS1 (A) 與PgPDS2 (B) 蛋白序列Fig.2 PgPDS1 (A) and PgPDS2 (B) protein sequences

    圖3 PgPDS1 (A) 與PgPDS2 (B) 的蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Protein conserved domains of PgPDS1 (A) and PgPDS2 (B)

    圖4 PgPDS 基因核心片段擴(kuò)增Fig.4 Amplification of the PgPDS gene core fragment

    3.2 pTRV2-PgPDS 侵染載體的構(gòu)建

    使用雙酶切法將PgPDS基因片段整合至pTRV2 載體中(圖5),將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,將3 種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,使用對(duì)應(yīng)引物(表1)進(jìn)行菌液PCR,3 種菌液(轉(zhuǎn)pTRV1、pTRV2 和pTRV2-PgPDS)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度分別為572、176、537 bp(圖6),說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功。

    圖5 pTRV2 質(zhì)粒圖譜及PgPDS 片段插入位置Fig.5 pTRV2 plasmid map and insertion location of PgPDS fragment

    圖6 轉(zhuǎn)3 種質(zhì)粒的菌液陽(yáng)性克隆檢測(cè)Fig.6 Positive clone detection of bacteria liquid with 3 kinds of plasmids

    3.3 pTRV2-PgPDS 侵染人參葉片的表型觀察與表達(dá)量分析

    選擇完全展開(kāi)的人參葉片,使用含有pTRV2空載與pTRV2-PgPDS重組載體的農(nóng)桿菌侵染液注射侵染。在接種后3 周觀察表型,3 組均未出現(xiàn)葉片白化現(xiàn)象(圖7);繼續(xù)觀察至第5 周時(shí),空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組葉片無(wú)變化,實(shí)驗(yàn)組人參植株部分葉片中間出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn),葉尖、葉緣出現(xiàn)黃化、枯萎等現(xiàn)象(圖8)。

    圖7 第3 周葉片表型Fig.7 Leaf phenotype at week 3

    圖8 第5 周葉片表型Fig.8 Leaf phenotype at week 5

    采集接種前、接種后3 周、接種后5 周的葉片,提取RNA,通過(guò)qPCR 方法計(jì)算內(nèi)源PgPDS基因表達(dá)水平。從結(jié)果(圖9)可以看出,空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組3 個(gè)時(shí)期PgPDS基因表達(dá)量變化不大,而實(shí)驗(yàn)組則呈明顯下降趨勢(shì),3 周時(shí)PgPDS的基因的表達(dá)量是接種前的70.37%,5 周時(shí)則降至37.35%,說(shuō)明在人參植株內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)了侵染,且基因沉默載體成功發(fā)揮作用。表明了人參中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因沉默體系構(gòu)建成功。

    圖9 不同組PgPDS 基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of PgPDS in different groups

    4 討論

    本研究通過(guò)序列對(duì)比的方式得到了2 條人參PgPDS基因,克隆家族核心保守片段后構(gòu)建病毒侵染載體,注射轉(zhuǎn)化人參葉片,抑制了人參內(nèi)源PgPDS基因的表達(dá),表明體系構(gòu)建成功。在病毒侵染后植株表型變化方面,多數(shù)物種會(huì)表現(xiàn)出白化現(xiàn)象,且需要的時(shí)間與白化程度各不相同:如高粱葉片出現(xiàn)白化需要28 d[13];擬南芥經(jīng)歷21 d,發(fā)生白化現(xiàn)象的部位有葉片、莖、花蕾[24];本氏煙Nicotiana benthamiana與柑橘屬CitrusL.作物在接種后也均會(huì)發(fā)生不同程度的白化現(xiàn)象[25]。而有些植物在PDS基因被沉默后葉片并無(wú)表型變化,如茶花Camelliasp.在接種后4 周葉片未表現(xiàn)出白化表型,但qPCR 結(jié)果顯示內(nèi)源CjPDS基因得到了有效沉默[26]。在本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組葉片在接種后5 周葉片上出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn),葉尖、葉緣出現(xiàn)了黃化與枯萎現(xiàn)象,而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組均未出現(xiàn)。查閱資料發(fā)現(xiàn)在其余物種中沒(méi)有枯萎現(xiàn)象出現(xiàn),初步判斷是由于葉片局部失去光保護(hù)作用后,植株處于持續(xù)光照下引起的。對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)的生長(zhǎng)觀察,葉片枯萎面積占比并未繼續(xù)增大,且植株未見(jiàn)其他異常,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,這可能與沉默效果持續(xù)時(shí)間有限以及病毒在植物體內(nèi)的不均勻分布有關(guān)[27]。但此現(xiàn)象出現(xiàn)的具體原因需今后進(jìn)一步研究才能確定。

    本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的沉默體系對(duì)內(nèi)源PgPDS基因的抑制率為62.65%,相較于文中提到的其他物種來(lái)講并不高。沉默效率與多種因素有關(guān),首要因素就是插入片段與目的基因的同源性,沉默效率與二者的同源性呈正相關(guān)[28]。其次是片段的長(zhǎng)度以及插入方向,實(shí)驗(yàn)表明以靶基因反向互補(bǔ)序列的形式構(gòu)建載體會(huì)提高沉默效率[29]。再者是病毒載體的選擇,不同的病毒對(duì)宿主親和力不同,且工作的適宜溫度不同。另外,接種方法對(duì)侵染效率有著一定的影響。人參葉片薄,在注射接種過(guò)程中發(fā)現(xiàn)能夠進(jìn)入葉片的菌液量有限,這可能是影響沉默效率的一個(gè)重要因素,除注射接種法外,現(xiàn)有的侵染方法還有真空滲透法[30]、根部浸潤(rùn)法[31]以及萌芽真空浸潤(rùn)法(sprout vacuum-infiltration,SVI)[32]等。李文辰等[33]研究了不同接種方法對(duì)大豆不同組織基因沉默效率的影響,結(jié)果顯示注射方法對(duì)葉片沉默效率最高,注射加灌根結(jié)合方法對(duì)根部沉默效率最高。今后可以驗(yàn)證上述方法在人參基因沉默相關(guān)研究中的可行性,且可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的接種方法??傊诤罄m(xù)的研究中若想提高沉默效率,則可以從以上幾個(gè)方面入手。

    VIGS 技術(shù)作為一種反向遺傳學(xué)技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便,成本低,見(jiàn)效快等優(yōu)點(diǎn)。在研究中無(wú)需進(jìn)行突變體篩選,且對(duì)人參這種尚無(wú)成熟組培體系的物種十分友好,今后可以應(yīng)用于人參抗病、抗逆基因以及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的鑒定。最新研究發(fā)現(xiàn),TGS 與PTGS 均存在可遺傳現(xiàn)象[34-36],因此VIGS技術(shù)還有望應(yīng)用于人參育種中。隨著人們對(duì)VIGS技術(shù)機(jī)制的研究加深,可以逐漸解決其存在的一些弊端和不足,如基因沉默不完全、沉默效率及表型不穩(wěn)定、易受病毒侵染癥狀影響等[37],將其更好地應(yīng)用于人參功能基因組學(xué)研究中。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    菌液侵染表型
    揭示水霉菌繁殖和侵染過(guò)程
    多糖微生物菌液對(duì)油菜吸收養(yǎng)分和土壤氮磷淋失的影響
    Bonfire Night
    鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中通過(guò)吸光度值測(cè)定菌液濃度的方法研究
    建蘭、寒蘭花表型分析
    蕓薹根腫菌侵染過(guò)程及影響因子研究
    甘藍(lán)根腫病菌休眠孢子的生物學(xué)特性及侵染寄主的顯微觀察
    復(fù)合微生物菌液對(duì)黃瓜生長(zhǎng)和抗病蟲(chóng)性效應(yīng)研究
    上海蔬菜(2015年2期)2015-12-26 05:03:40
    GABABR2基因遺傳變異與肥胖及代謝相關(guān)表型的關(guān)系
    慢性乙型肝炎患者HBV基因表型與血清學(xué)測(cè)定的臨床意義
    国产精品美女特级片免费视频播放器| 国内精品宾馆在线| 久久国内精品自在自线图片| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲无线观看免费| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品女同一区二区软件| 秋霞在线观看毛片| 国产成人一区二区在线| 只有这里有精品99| 国产成人91sexporn| 国产黄片视频在线免费观看| 特大巨黑吊av在线直播| 女人久久www免费人成看片| 久久99蜜桃精品久久| 一边亲一边摸免费视频| 97热精品久久久久久| 国产人妻一区二区三区在| 久久99蜜桃精品久久| 国产高潮美女av| 日本免费在线观看一区| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美精品一区二区大全| 人妻夜夜爽99麻豆av| 91久久精品电影网| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 婷婷六月久久综合丁香| 一区二区三区四区激情视频| 欧美成人午夜免费资源| 国产黄片美女视频| 日韩伦理黄色片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜激情福利司机影院| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 久久午夜福利片| 久久久久久久国产电影| 不卡视频在线观看欧美| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 一二三四中文在线观看免费高清| 色视频www国产| 看黄色毛片网站| 在线天堂最新版资源| 精品久久久久久电影网| 在线 av 中文字幕| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜福利在线在线| 亚洲最大成人av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 午夜福利在线在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美日韩综合久久久久久| 日本wwww免费看| 午夜福利视频精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产精品人妻久久久影院| 国产在视频线精品| 夜夜爽夜夜爽视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 搡老乐熟女国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产伦精品一区二区三区四那| 两个人的视频大全免费| 色综合站精品国产| 国产精品久久久久久久久免| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩欧美精品v在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产一级毛片在线| 内射极品少妇av片p| 五月伊人婷婷丁香| 性插视频无遮挡在线免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品午夜福利在线看| 国产精品熟女久久久久浪| 免费观看精品视频网站| 国产永久视频网站| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲精品456在线播放app| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 午夜精品在线福利| 国产伦理片在线播放av一区| 街头女战士在线观看网站| 国产高清国产精品国产三级 | 国产片特级美女逼逼视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 99久久精品国产国产毛片| 精品久久久噜噜| av网站免费在线观看视频 | 天堂网av新在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 老师上课跳d突然被开到最大视频| h日本视频在线播放| 日韩精品有码人妻一区| 久久97久久精品| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美xxⅹ黑人| 成人漫画全彩无遮挡| 免费看日本二区| 免费无遮挡裸体视频| 国产成人91sexporn| 亚洲四区av| 国产在线男女| 亚洲欧美日韩无卡精品| 丝袜美腿在线中文| 日本一本二区三区精品| 日韩一本色道免费dvd| 欧美性感艳星| 天堂影院成人在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 青春草视频在线免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品蜜桃在线观看| av在线蜜桃| 一级毛片电影观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产av码专区亚洲av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99久久精品一区二区三区| 国产极品天堂在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品久久久久久电影网| 午夜精品在线福利| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲精品色激情综合| 免费黄色在线免费观看| 亚洲色图av天堂| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产在线男女| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费观看的影片在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 日日啪夜夜撸| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产又色又爽无遮挡免| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产毛片a区久久久久| 国产 亚洲一区二区三区 | 99久国产av精品国产电影| 少妇的逼水好多| 精品人妻视频免费看| 一级毛片我不卡| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精品av视频在线免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费av毛片视频| 乱系列少妇在线播放| 亚洲性久久影院| 亚洲国产av新网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 秋霞伦理黄片| freevideosex欧美| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美另类一区| 亚洲国产精品国产精品| 久久久午夜欧美精品| 天美传媒精品一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 大片免费播放器 马上看| 欧美97在线视频| 午夜福利在线在线| 午夜精品在线福利| 亚洲在久久综合| 亚洲精品乱久久久久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 老司机影院毛片| 2018国产大陆天天弄谢| 内地一区二区视频在线| 久久久亚洲精品成人影院| 成人午夜高清在线视频| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品,欧美精品| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产欧美日韩精品一区二区| 美女大奶头视频| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩精品有码人妻一区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产精品伦人一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产成人精品一,二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国内精品美女久久久久久| 天美传媒精品一区二区| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 三级毛片av免费| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产欧美在线一区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲精品视频女| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中文字幕久久专区| av在线蜜桃| 日韩av免费高清视频| 国产在视频线精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久色成人| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 亚洲av成人精品一二三区| 欧美激情在线99| 午夜精品国产一区二区电影 | av在线老鸭窝| 寂寞人妻少妇视频99o| 一级a做视频免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美成人a在线观看| 97超碰精品成人国产| 国产精品一及| 91精品国产九色| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲国产最新在线播放| 在线播放无遮挡| 国产精品无大码| 亚洲av一区综合| 女人被狂操c到高潮| 中国美白少妇内射xxxbb| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久6这里有精品| 99久国产av精品| 99re6热这里在线精品视频| 日本与韩国留学比较| 中国国产av一级| 国产精品国产三级国产专区5o| kizo精华| 神马国产精品三级电影在线观看| av一本久久久久| 嫩草影院入口| 在线观看美女被高潮喷水网站| 91久久精品国产一区二区成人| 国产69精品久久久久777片| 国产午夜精品论理片| 国产黄频视频在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩制服骚丝袜av| 成年人午夜在线观看视频 | 亚洲自拍偷在线| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品1区2区在线观看.| 国产视频首页在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 三级国产精品片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 免费观看精品视频网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 如何舔出高潮| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产淫片久久久久久久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 高清在线视频一区二区三区| 26uuu在线亚洲综合色| 国产成人aa在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 日本一本二区三区精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲av不卡在线观看| 国产极品天堂在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产午夜福利久久久久久| 男女视频在线观看网站免费| 不卡视频在线观看欧美| 观看美女的网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品三级大全| 中文字幕久久专区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99热这里只有是精品50| 美女黄网站色视频| 国产精品蜜桃在线观看| av免费观看日本| 久久久久性生活片| 中文字幕av成人在线电影| 日本欧美国产在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲欧美日韩东京热| 激情五月婷婷亚洲| 国产午夜精品一二区理论片| 丰满乱子伦码专区| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲综合色惰| 日日啪夜夜爽| 亚洲伊人久久精品综合| 韩国高清视频一区二区三区| 国产极品天堂在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久99久视频精品免费| 精品国产露脸久久av麻豆 | 麻豆成人av视频| 91久久精品国产一区二区三区| 夜夜爽夜夜爽视频| 午夜激情久久久久久久| av在线老鸭窝| 五月玫瑰六月丁香| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲国产av新网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲成人一二三区av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 插逼视频在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 永久网站在线| 毛片女人毛片| 永久网站在线| 大香蕉97超碰在线| 欧美xxⅹ黑人| 国产又色又爽无遮挡免| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 18禁动态无遮挡网站| 久久99精品国语久久久| 免费在线观看成人毛片| 成人毛片60女人毛片免费| 插阴视频在线观看视频| 国产精品久久久久久久电影| 日本一二三区视频观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 成年av动漫网址| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 男人爽女人下面视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 免费观看性生交大片5| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品乱久久久久久| 秋霞在线观看毛片| 精品国产露脸久久av麻豆 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产视频首页在线观看| 午夜免费观看性视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 伊人久久国产一区二区| 亚洲综合色惰| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产 一区精品| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲国产精品专区欧美| 美女高潮的动态| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久久久国产a免费观看| 晚上一个人看的免费电影| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久综合国产亚洲精品| 男女那种视频在线观看| 国产三级在线视频| 日本欧美国产在线视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 日本三级黄在线观看| 中文天堂在线官网| 亚洲精品影视一区二区三区av| 99久久精品一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 美女高潮的动态| 全区人妻精品视频| 天美传媒精品一区二区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产成人免费观看mmmm| 丝袜喷水一区| 黑人高潮一二区| 黄色欧美视频在线观看| 97在线视频观看| 成人亚洲精品av一区二区| 国产不卡一卡二| av线在线观看网站| 日韩制服骚丝袜av| 真实男女啪啪啪动态图| 一级片'在线观看视频| 丝袜喷水一区| 久久久久久国产a免费观看| 99久久精品一区二区三区| 久久久久久久午夜电影| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 男女国产视频网站| 尾随美女入室| 搡老妇女老女人老熟妇| 三级经典国产精品| 日本免费a在线| 高清视频免费观看一区二区 | 亚洲电影在线观看av| 毛片女人毛片| 中文字幕av成人在线电影| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | av线在线观看网站| 亚州av有码| 午夜免费观看性视频| 精品一区在线观看国产| 日韩国内少妇激情av| 免费观看精品视频网站| 男女边吃奶边做爰视频| 国产伦在线观看视频一区| 国产高清有码在线观看视频| av天堂中文字幕网| 99久国产av精品国产电影| 午夜福利网站1000一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 国产真实伦视频高清在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 日本午夜av视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品久久久久久电影网| 成人一区二区视频在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美成人a在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 秋霞在线观看毛片| 黄片wwwwww| videos熟女内射| 黑人高潮一二区| 午夜视频国产福利| 观看美女的网站| .国产精品久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 我的老师免费观看完整版| 麻豆成人午夜福利视频| 三级国产精品欧美在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲自拍偷在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产成人免费观看mmmm| 欧美潮喷喷水| 69人妻影院| 黄色配什么色好看| 午夜福利视频1000在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 三级国产精品片| 看非洲黑人一级黄片| 中文字幕制服av| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产单亲对白刺激| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产麻豆成人av免费视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 免费看av在线观看网站| 深夜a级毛片| 极品教师在线视频| 午夜福利在线在线| 亚洲人与动物交配视频| 最近中文字幕2019免费版| 禁无遮挡网站| 国产av码专区亚洲av| 一本久久精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99视频精品全部免费 在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 18+在线观看网站| 日韩强制内射视频| 可以在线观看毛片的网站| 97超视频在线观看视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 能在线免费看毛片的网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美人与善性xxx| 国产精品三级大全| 免费观看精品视频网站| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人a区在线观看| 色吧在线观看| 午夜久久久久精精品| 99热网站在线观看| 国产91av在线免费观看| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品伦人一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜日本视频在线| 青春草国产在线视频| 男人舔奶头视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 中文天堂在线官网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产免费福利视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久韩国三级中文字幕| 看十八女毛片水多多多| 日韩av在线大香蕉| 亚洲成色77777| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美最新免费一区二区三区| 最后的刺客免费高清国语| 日本免费在线观看一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 国内精品美女久久久久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 又大又黄又爽视频免费| 中文字幕亚洲精品专区| 久久99热这里只有精品18| 直男gayav资源| 久久久久久久久久黄片| av在线老鸭窝| 欧美精品国产亚洲| 国产成人精品一,二区| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 中文字幕亚洲精品专区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日日啪夜夜爽| 少妇的逼好多水| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文字幕av在线有码专区| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久久久久久成人| 国产黄色小视频在线观看| 高清视频免费观看一区二区 | 特级一级黄色大片| 青青草视频在线视频观看| 一个人看视频在线观看www免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品.久久久| 六月丁香七月| 国产av码专区亚洲av| 久久久色成人| 午夜福利高清视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产精品一二三区在线看| 久久国产乱子免费精品| 晚上一个人看的免费电影| 99久久精品热视频| 老女人水多毛片| 亚洲av福利一区| 国产伦精品一区二区三区四那| 深爱激情五月婷婷| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久草成人影院| 天堂√8在线中文| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av免费在线观看| 午夜视频国产福利| 在线观看美女被高潮喷水网站| 一个人看的www免费观看视频| 精品久久久精品久久久| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品第二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产91av在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品一区在线观看国产| 欧美日本视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久久久久久久人人人人人人| 美女cb高潮喷水在线观看| av网站免费在线观看视频 | 国产成人一区二区在线| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜老司机福利剧场| 男的添女的下面高潮视频| 三级国产精品片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人综合一区亚洲| 久久久精品欧美日韩精品| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品456在线播放app| 亚州av有码| 亚洲色图av天堂| 美女高潮的动态| 我的女老师完整版在线观看| av专区在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黄色日韩在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 |