煙草脆裂病毒介導(dǎo)的人參基因沉默體系的構(gòu)建

李冉琪，李雅淑，湯淼淼，曲正義，鄭培和，侯 微*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112

2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132109

基因沉默現(xiàn)象是一種由雙鏈 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引起的基因表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象，是一種基于序列同源性的過(guò)程[1]。在真核生物中，基因沉默又稱(chēng)為RNA 干擾（RNA interference，RNAi）。這一現(xiàn)象首次發(fā)現(xiàn)于1990 年，Carolyn Napoli 等將花椰菜花葉病毒的35S 啟動(dòng)子與查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）基因的編碼序列融合，將重組的CHS基因通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入矮牽牛中，期望加深矮牽?；ǖ淖仙?，但結(jié)果卻與預(yù)期完全相反：轉(zhuǎn)入的基因未表達(dá)，且內(nèi)源CHS的表達(dá)水平也發(fā)生了下降，筆者將這種現(xiàn)象稱(chēng)為“可逆共抑制”（reversible co-suppression）[2]。對(duì)基因沉默現(xiàn)象機(jī)制的認(rèn)識(shí)來(lái)源于1998年Fire等[3]的線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）是基因沉默現(xiàn)象的高效誘發(fā)因子。Mansoor 等[4]總結(jié)了植物體內(nèi)3 種不同的RNAi 機(jī)制：（1）轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），指dsRNA 在細(xì)胞質(zhì)中引起mRNA 的切割降解；（2）microRNAs（MiRNAs）與特定mRNAs 的堿基配對(duì)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源mRNA 降解或蛋白質(zhì)翻譯停止；（3）轉(zhuǎn)錄水平基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），是由于DNA 的序列特異性甲基化導(dǎo)致的基因沉默?；虺聊倪^(guò)程通常分為3 個(gè)步驟：（1）小RNA（small RNA，RNA）的形成。sRNA 由RNase III家族的Dicer 酶通過(guò)切割dsRNA 形成，長(zhǎng)度一般為19～25 個(gè)核苷酸，序列與目標(biāo)mRNA 互補(bǔ)[5]，包括小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和Piwi 相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）[6]。（2）sRNA與RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，RISC 獲得剪切活性。部分sRNA 還可以在 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）的作用下繼續(xù)合成dsRNA 以放大沉默效果[7]。（3）具有活性的RISC 與目標(biāo)mRNA 結(jié)合，降解目標(biāo)RNA或抑制其翻譯。RISC 不僅可以介導(dǎo)PTGS，還可以介導(dǎo)TGS[8]。利用這一原理，近年來(lái)，病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)在研究植物功能基因方面得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。VIGS 技術(shù)是是一種功能基因組學(xué)工具，將目的基因的cDNA 片段通過(guò)病毒載體導(dǎo)入植株，引起同源基因mRNA 的降解或基因本身的甲基化修飾，目的基因被沉默進(jìn)而造成植株產(chǎn)生表型變化，從而達(dá)到驗(yàn)證基因功能的目的[9]。八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）是類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶，該基因被沉默后葉片因失去類(lèi)胡蘿卜素的光保護(hù)作用而通常表現(xiàn)出光漂白現(xiàn)象，表型明顯，易于觀察。因此在多種植物基因沉默體系的構(gòu)建中，PDS基因常作為沉默靶基因被選用，如擬南芥[10]、小麥[11]、辣椒[12]、高粱[13]等。在病毒載體的選擇上，煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）應(yīng)用最為廣泛，相對(duì)于其他病毒載體，其具有沉默效果持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、效率高、癥狀輕等優(yōu)點(diǎn)。通常使用農(nóng)桿菌侵染法將病毒載體導(dǎo)入植物體內(nèi)。

人參PanaxginsengC.A.Meyer 是五加科人參屬多年生草本植物，是一種名貴中藥。作為一種根類(lèi)藥用植物，人們對(duì)其的關(guān)注點(diǎn)大多在人參中的活性成分人參皂苷上，因而通過(guò)基因沉默手段研究的多是人參皂苷合成途徑中的基因，如達(dá)瑪烷合成酶（dammarenediol synthase，DDS）基因[14]、角鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SQE）基因[15-16]、β-香樹(shù)脂醇合酶（β-amyrin synthase，β-AS）基因[17-18]等，實(shí)驗(yàn)對(duì)象也均為發(fā)根農(nóng)桿菌產(chǎn)生的毛狀根。同時(shí)，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系也為工業(yè)生產(chǎn)人參皂苷提供了新途徑[19-21]。但由于目前基于組織培養(yǎng)的人參再生體系尚不成熟[22]，在毛狀根中建立的基因沉默體系并不能滿(mǎn)足對(duì)所有基因功能的研究。因此本實(shí)驗(yàn)旨在嘗試構(gòu)建人參植株中的基因沉默體系，利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化沉默載體實(shí)現(xiàn)侵染，為今后人參中基因功能的驗(yàn)證提供新的方法。

1 材料

1.1 植物材料、菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)使用4 年生人參種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所溫室，大腸桿菌DH5α 購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司，農(nóng)桿菌LBA4404 購(gòu)于北京華越洋生物科技有限公司，病毒侵染載體pTRV1 和pTRV2 購(gòu)于武漢淼靈生物科技有限公司。

1.2 試劑

EcoRI 限制性?xún)?nèi)切酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），BamHI 限制性?xún)?nèi)切酶（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），TransZolUp Plus RNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司），pEASY?-T1 Simple Cloning Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司），TIANprep Mini Plasmid Kit（北京天根生化科技有限公司），TIANgel Midi Purification Kit（北京天根生化科技有限公司），PerfectStart?Uni RT&qPCR Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 人參PDS 基因核心片段的克隆

根據(jù)課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，使用擬南芥AtPDS3基因的cDNA 序列作為參考進(jìn)行序列對(duì)比，選擇相似度高的序列作為候選基因。對(duì)基因序列進(jìn)行分析，使用NCBI 的Batch CD-search 工具預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，作為核心片段的選取依據(jù)。使用Oligo 7 Primer Analysis Software 設(shè)計(jì)引物用于克隆PgPDS核心片段，引物位于人參PDS 家族基因的共有保守序列部分。上、下游引物分別添加EcoRI 和BamHI 酶切接頭序列（表1）。以人參cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，切膠回收后進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)為目的基因片段。

表1 所用到的引物Table 1 Primers used in this study

2.2 pTRV2-pgPDS 侵染載體的構(gòu)建

使用測(cè)序正確的回收片段進(jìn)行TA 克隆，將TA克隆質(zhì)粒、pTRV2 空載質(zhì)粒使用EcoRI 與BamHI分別進(jìn)行雙酶切，切膠回收PgPDS核心片段與線(xiàn)性化的pTRV2 載體，使用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接；產(chǎn)物測(cè)序顯示連接正確，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有50 mg/L 卡那霉素的平板上涂板篩選，挑取菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒pTRV2-PgPDS，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，將pTRV1、pTRV2 以及重組質(zhì)粒pTRV2-PgPDS分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在含有50 mg/L 卡那霉素（Kan）和20 mg/L 的利福平（Rif）的平板上篩選陽(yáng)性菌落，挑取陽(yáng)性菌落于含有50 mg/L Kan 和20 mg/L Rif 的LB 液體培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)一段時(shí)間后使用對(duì)應(yīng)引物（表1）進(jìn)行菌液PCR 鑒定。

2.3 沉默體系的建立

分別取1 mL 轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌菌液加到15 mL 的LB 液體培養(yǎng)基（同樣含50 mg/L Kan 與20 mg/L Rif）中擴(kuò)大培養(yǎng)，搖床設(shè)置28 ℃、200 r/min條件。待農(nóng)桿菌搖菌至A600＝0.6 左右時(shí)，5 000 r/min離心收集菌體，使用等體積侵染液（含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES 和200 μmol/L 乙酰丁香酮）輕輕重懸菌體，使菌液A600仍為0.6 左右，暗處培養(yǎng)4～6 h。后將等體積的pTRV1 農(nóng)桿菌重懸液與pTRV2 農(nóng)桿菌重懸液混合作為陰性對(duì)照，等體積的pTRV1 農(nóng)桿菌重懸液與pTRV2-PgPDS農(nóng)桿菌重懸液混合作為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)空白對(duì)照不做處理。采用菌液注射法，在葉片背面使用無(wú)菌注射器針頭制造傷口，但不刺透葉片，之后取下針頭，用注射器吸取1 mL 重懸菌液，壓緊傷口將菌液注射進(jìn)葉片直至傷口周?chē)鷧^(qū)域呈現(xiàn)水漬狀，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，侵染后的植株置于黑暗中24 h，之后于22 ℃、光周期為光照/黑暗12 h∶12 h 的溫室培養(yǎng)。

2.4 qPCR 計(jì)算人參PgPDS 相對(duì)表達(dá)量

每株于處理前、處理后第3 周以及處理后第5周采集葉片，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，使用引物qPDS-F 和qPDS-R（表1），通過(guò) qPCR 檢測(cè)內(nèi)源 PDS 基因的表達(dá)量，選擇PgGAPDH作為內(nèi)參基因[23]，每個(gè)樣品進(jìn)行3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。為避免個(gè)體差異帶來(lái)的影響，本實(shí)驗(yàn)中未采用其他物種研究中以空白組為基準(zhǔn)計(jì)算陰性組與實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量的方法，而是將單株接種前后的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。具體操作如下：選取人參掌狀復(fù)葉上處于對(duì)稱(chēng)位置的2 片大葉片（圖1），接種前采集a1，后注射接種a2，一段時(shí)間后采集a2，計(jì)算表達(dá)量時(shí)以 a1為參比計(jì)算 a2的相對(duì)表達(dá)量。按照上述流程在每株上選取2 個(gè)掌狀復(fù)葉進(jìn)行操作，分別用于第3 周和第5 周的樣品采集以及表達(dá)量的計(jì)算。使用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析中的Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，使用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行圖表繪制。

圖1 人參掌狀復(fù)葉Fig.1 Palmate compound leaf of Panax ginseng

3 結(jié)果與分析

3.1 PgPDS 基因核心片段的克隆

根據(jù)序列比對(duì)，篩選出2 條符合要求的序列，分別命名為PgPDS1 與PgPDS2。PgPDS1 基因cDNA序列全長(zhǎng)1 746 bp，編碼581 個(gè)氨基酸（圖2-A）；PgPDS2 基因cDNA 序列全長(zhǎng)1 299 bp，編碼432 個(gè)氨基酸（圖2-B）。使用NCBI 中的Batch CD-search工具對(duì)2 條序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)（圖3），結(jié)果顯示PgPDS1 與PgPDS2 蛋白均具有典型的PDS 蛋白結(jié)構(gòu)域，表示二者都屬于PDS超基因家族。使用植物總RNA 提取試劑盒提取人參葉片RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以其為模板，使用引物PgPDS-F 與PgPDS-R（表1）擴(kuò)增PgPDS家族基因共有核心片段，克隆出的核心片段理論長(zhǎng)度為391 bp（圖4），片段大小符合預(yù)期。使用膠回收試劑盒回收目的基因片段用于后續(xù)載體構(gòu)建。

圖2 PgPDS1 (A) 與PgPDS2 (B) 蛋白序列Fig.2 PgPDS1 (A) and PgPDS2 (B) protein sequences

圖3 PgPDS1 (A) 與PgPDS2 (B) 的蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Protein conserved domains of PgPDS1 (A) and PgPDS2 (B)

圖4 PgPDS 基因核心片段擴(kuò)增Fig.4 Amplification of the PgPDS gene core fragment

3.2 pTRV2-PgPDS 侵染載體的構(gòu)建

使用雙酶切法將PgPDS基因片段整合至pTRV2 載體中（圖5），將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將3 種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，使用對(duì)應(yīng)引物（表1）進(jìn)行菌液PCR，3 種菌液（轉(zhuǎn)pTRV1、pTRV2 和pTRV2-PgPDS）擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度分別為572、176、537 bp（圖6），說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功。

圖5 pTRV2 質(zhì)粒圖譜及PgPDS 片段插入位置Fig.5 pTRV2 plasmid map and insertion location of PgPDS fragment

圖6 轉(zhuǎn)3 種質(zhì)粒的菌液陽(yáng)性克隆檢測(cè)Fig.6 Positive clone detection of bacteria liquid with 3 kinds of plasmids

3.3 pTRV2-PgPDS 侵染人參葉片的表型觀察與表達(dá)量分析

選擇完全展開(kāi)的人參葉片，使用含有pTRV2空載與pTRV2-PgPDS重組載體的農(nóng)桿菌侵染液注射侵染。在接種后3 周觀察表型，3 組均未出現(xiàn)葉片白化現(xiàn)象（圖7）；繼續(xù)觀察至第5 周時(shí)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組葉片無(wú)變化，實(shí)驗(yàn)組人參植株部分葉片中間出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，葉尖、葉緣出現(xiàn)黃化、枯萎等現(xiàn)象（圖8）。

圖7 第3 周葉片表型Fig.7 Leaf phenotype at week 3

圖8 第5 周葉片表型Fig.8 Leaf phenotype at week 5

采集接種前、接種后3 周、接種后5 周的葉片，提取RNA，通過(guò)qPCR 方法計(jì)算內(nèi)源PgPDS基因表達(dá)水平。從結(jié)果（圖9）可以看出，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組3 個(gè)時(shí)期PgPDS基因表達(dá)量變化不大，而實(shí)驗(yàn)組則呈明顯下降趨勢(shì)，3 周時(shí)PgPDS的基因的表達(dá)量是接種前的70.37%，5 周時(shí)則降至37.35%，說(shuō)明在人參植株內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)了侵染，且基因沉默載體成功發(fā)揮作用。表明了人參中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因沉默體系構(gòu)建成功。

圖9 不同組PgPDS 基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of PgPDS in different groups

4 討論

本研究通過(guò)序列對(duì)比的方式得到了2 條人參PgPDS基因，克隆家族核心保守片段后構(gòu)建病毒侵染載體，注射轉(zhuǎn)化人參葉片，抑制了人參內(nèi)源PgPDS基因的表達(dá)，表明體系構(gòu)建成功。在病毒侵染后植株表型變化方面，多數(shù)物種會(huì)表現(xiàn)出白化現(xiàn)象，且需要的時(shí)間與白化程度各不相同：如高粱葉片出現(xiàn)白化需要28 d[13]；擬南芥經(jīng)歷21 d，發(fā)生白化現(xiàn)象的部位有葉片、莖、花蕾[24]；本氏煙Nicotiana benthamiana與柑橘屬CitrusL.作物在接種后也均會(huì)發(fā)生不同程度的白化現(xiàn)象[25]。而有些植物在PDS基因被沉默后葉片并無(wú)表型變化，如茶花Camelliasp.在接種后4 周葉片未表現(xiàn)出白化表型，但qPCR 結(jié)果顯示內(nèi)源CjPDS基因得到了有效沉默[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組葉片在接種后5 周葉片上出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，葉尖、葉緣出現(xiàn)了黃化與枯萎現(xiàn)象，而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組均未出現(xiàn)。查閱資料發(fā)現(xiàn)在其余物種中沒(méi)有枯萎現(xiàn)象出現(xiàn)，初步判斷是由于葉片局部失去光保護(hù)作用后，植株處于持續(xù)光照下引起的。對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)的生長(zhǎng)觀察，葉片枯萎面積占比并未繼續(xù)增大，且植株未見(jiàn)其他異常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，這可能與沉默效果持續(xù)時(shí)間有限以及病毒在植物體內(nèi)的不均勻分布有關(guān)[27]。但此現(xiàn)象出現(xiàn)的具體原因需今后進(jìn)一步研究才能確定。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的沉默體系對(duì)內(nèi)源PgPDS基因的抑制率為62.65%，相較于文中提到的其他物種來(lái)講并不高。沉默效率與多種因素有關(guān)，首要因素就是插入片段與目的基因的同源性，沉默效率與二者的同源性呈正相關(guān)[28]。其次是片段的長(zhǎng)度以及插入方向，實(shí)驗(yàn)表明以靶基因反向互補(bǔ)序列的形式構(gòu)建載體會(huì)提高沉默效率[29]。再者是病毒載體的選擇，不同的病毒對(duì)宿主親和力不同，且工作的適宜溫度不同。另外，接種方法對(duì)侵染效率有著一定的影響。人參葉片薄，在注射接種過(guò)程中發(fā)現(xiàn)能夠進(jìn)入葉片的菌液量有限，這可能是影響沉默效率的一個(gè)重要因素，除注射接種法外，現(xiàn)有的侵染方法還有真空滲透法[30]、根部浸潤(rùn)法[31]以及萌芽真空浸潤(rùn)法（sprout vacuum-infiltration，SVI）[32]等。李文辰等[33]研究了不同接種方法對(duì)大豆不同組織基因沉默效率的影響，結(jié)果顯示注射方法對(duì)葉片沉默效率最高，注射加灌根結(jié)合方法對(duì)根部沉默效率最高。今后可以驗(yàn)證上述方法在人參基因沉默相關(guān)研究中的可行性，且可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的接種方法?？傊诤罄m(xù)的研究中若想提高沉默效率，則可以從以上幾個(gè)方面入手。

VIGS 技術(shù)作為一種反向遺傳學(xué)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便，成本低，見(jiàn)效快等優(yōu)點(diǎn)。在研究中無(wú)需進(jìn)行突變體篩選，且對(duì)人參這種尚無(wú)成熟組培體系的物種十分友好，今后可以應(yīng)用于人參抗病、抗逆基因以及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的鑒定。最新研究發(fā)現(xiàn)，TGS 與PTGS 均存在可遺傳現(xiàn)象[34-36]，因此VIGS技術(shù)還有望應(yīng)用于人參育種中。隨著人們對(duì)VIGS技術(shù)機(jī)制的研究加深，可以逐漸解決其存在的一些弊端和不足，如基因沉默不完全、沉默效率及表型不穩(wěn)定、易受病毒侵染癥狀影響等[37]，將其更好地應(yīng)用于人參功能基因組學(xué)研究中。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突