中草藥囊泡研究與應(yīng)用專家共識(shí)（2023 年版）

中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)細(xì)胞外囊泡研究與應(yīng)用專業(yè)委員會(huì)中草藥囊泡研究與應(yīng)用專家委員會(huì)，中草藥囊泡廣東省工程研究中心，廣東省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中草藥囊泡研究與應(yīng)用專業(yè)委員會(huì)，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由幾乎所有細(xì)胞類型釋放的納米級(jí)脂質(zhì)雙層囊泡，包括外泌體、微囊泡和凋亡小體等。EVs 廣泛存在于各種體液和細(xì)胞上清中，并穩(wěn)定攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等重要的生物分子，參與病理和生理過程的調(diào)控，如細(xì)胞增殖分化、血管生成和免疫應(yīng)答等，具有多種生物活性，是信息交流的重要載體[1-2]。植物EVs 在形態(tài)（納米囊泡）、組成（脂質(zhì)、RNA 和蛋白質(zhì)）和功能上與哺乳動(dòng)物EVs 相似，但因細(xì)胞壁的存在而以非細(xì)胞自主的方式發(fā)揮重要作用，甚至能在物種之間交換生物信息。植物EVs憑借來源廣、產(chǎn)率高、活性明顯等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[3-6]。本共識(shí)所指中草藥囊泡是嚴(yán)格來源于中草藥細(xì)胞外液的EVs 和來源于中草藥汁液的 EVs 樣顆粒（extracellular vesicles-like particles，EVLP）2 種納米結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱。

自2021 年10 月全國EVs 大會(huì)首屆中草藥囊泡研究論壇以來，中草藥囊泡研究取得了諸多標(biāo)志性的進(jìn)展，同時(shí)也呈現(xiàn)出一些共性問題。為推動(dòng)中草藥囊泡的發(fā)展，特別是標(biāo)準(zhǔn)的建立，由全國中草藥囊泡研究與應(yīng)用專家委員會(huì)牽頭，邀請(qǐng)全國中草藥囊泡領(lǐng)域的研究專家，在整理相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以德爾菲法、共識(shí)會(huì)議與名義小組相結(jié)合的方法，形成“中草藥囊泡研究與應(yīng)用專家共識(shí)”，旨在聯(lián)合國內(nèi)外研究學(xué)者們共同建立安全、有效、可控的精準(zhǔn)化中草藥囊泡研究和應(yīng)用體系。

本共識(shí)采取文獻(xiàn)研究證據(jù)和專家研究基礎(chǔ)相結(jié)合的方式，對(duì)中草藥囊泡研究及臨床應(yīng)用的相關(guān)問題形成共識(shí)建議，且隨著中草藥囊泡研究與臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的不斷進(jìn)展，以及新的循證證據(jù)的出現(xiàn)而予以不斷更新和修訂；應(yīng)用本共識(shí)時(shí)須充分考慮所研究中草藥的實(shí)際情況。

1 中草藥囊泡研究的現(xiàn)狀和存在問題

自1967 年首次發(fā)現(xiàn)胡蘿卜細(xì)胞中的多囊泡體[7]、2009 年首次從葵花籽中分離出外泌體樣膜層結(jié)構(gòu)的囊泡[8]以來，植物衍生的納米囊泡由于其來源豐富等優(yōu)勢以及對(duì)生物醫(yī)學(xué)和納米技術(shù)應(yīng)用的廣闊前景而備受關(guān)注[4]。從多種均質(zhì)化的植物和果汁[9-13]中，均發(fā)現(xiàn)形態(tài)和分子特征與哺乳動(dòng)物EVs 類似的膜封閉結(jié)構(gòu)，具有潛在的生物活性，其中最顯著的是抗炎[14]、抗癌[15-16]和抗氧化[17]等作用。

近年來已開展人參[18]、生姜[19]、大蒜[20]、蘆薈[21]、姜黃[22]、桑白皮[23]、紫菀[24]、天冬[25]和骨碎補(bǔ)[26]等中草藥囊泡的相關(guān)研究，中草藥囊泡作為當(dāng)前醫(yī)學(xué)和納米技術(shù)發(fā)展的一部分可能為藥物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用開辟新的途徑。中草藥囊泡來源于天然植物，具有多組分、多功能的特點(diǎn)，容易被生物體吸收，可以作為生物治療劑和藥物遞送載體，有助于解決許多活性成分生物利用度差的問題，具有更好的生物安全性。利用中草藥囊泡與蛋白質(zhì)、RNA 和生物活性物質(zhì)結(jié)合等作用，中草藥囊泡也可作為藥物發(fā)現(xiàn)的重要工具。

研究表明中草藥囊泡可能引起不良免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)活性等，這與其大小和異質(zhì)性有關(guān)。由于中草藥囊泡中的生物活性成分未知，在應(yīng)用時(shí)還可能面臨潛在的生物安全性和毒性等相關(guān)的問題。為了克服中草藥囊泡的這些缺點(diǎn)，應(yīng)優(yōu)化其分離方法以獲得穩(wěn)定的納米囊泡，并評(píng)估其形態(tài)特征、定量和活性成分等與功能相關(guān)的詳細(xì)信息。另外，中草藥囊泡分泌機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

基于中草藥囊泡研究的現(xiàn)狀和存在問題形成專家共識(shí)意見1、2。

共識(shí)意見1傳統(tǒng)要跟著時(shí)代走。中草藥資源豐富，通過EVs 的研究可拓展其應(yīng)用，發(fā)揮其優(yōu)勢。中草藥囊泡具有發(fā)展成為下一代治療藥物的潛力，迫切需要本領(lǐng)域研究學(xué)者共同發(fā)現(xiàn)問題、解決問題，將中醫(yī)藥發(fā)展壯大，走上現(xiàn)代化、規(guī)范化、精準(zhǔn)化的必由之路。共識(shí)意見2在中草藥囊泡用作治療劑和藥物載體之前，安全性評(píng)估是必要和首要考慮的問題。中草藥囊泡并非來源于人體，是其在體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性考慮的主要原因之一。給藥途徑是影響安全性的重要因素，一般認(rèn)為，對(duì)于經(jīng)過長期臨床實(shí)踐驗(yàn)證的口服中草藥，口服給藥中草藥囊泡是相對(duì)安全的方式；對(duì)于非胃腸道給藥方式，要通過仔細(xì)的研究驗(yàn)證。中草藥囊泡的安全性和免疫原性的證據(jù)仍然缺乏，需要更多的關(guān)注和研究。

2 制訂中草藥囊泡研究與應(yīng)用專家共識(shí)的意義

傳統(tǒng)中草藥具有獨(dú)特的思維理念和簡便驗(yàn)廉的優(yōu)勢，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)EVs 結(jié)合協(xié)同互補(bǔ)，傳承精華、守正創(chuàng)新，是中藥現(xiàn)代化和精準(zhǔn)化的體現(xiàn)。專家們認(rèn)真學(xué)習(xí)借鑒各方面的好經(jīng)驗(yàn)、好做法形成本共識(shí)，將共識(shí)內(nèi)容運(yùn)用到中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的全過程，有助于加強(qiáng)同領(lǐng)域研究者之間交流合作，進(jìn)一步提升中醫(yī)藥治理能力和水平，共同推動(dòng)中醫(yī)藥高質(zhì)量發(fā)展，為加快健康中國建設(shè)、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)高質(zhì)量發(fā)展貢獻(xiàn)更多智慧和力量。

大量研究者已在中草藥EVs領(lǐng)域進(jìn)行了深入的研究，產(chǎn)出了眾多優(yōu)秀的學(xué)術(shù)成果，但領(lǐng)域內(nèi)仍存在一些關(guān)鍵的爭議問題。例如，中草藥囊泡命名多樣不統(tǒng)一，中草藥囊泡提取方法的選擇、產(chǎn)量和純度的提高，分泌的可能機(jī)制的探索，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定，功能研究時(shí)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用時(shí)的安全性問題等。凝聚共識(shí)、回答問題、解決爭議不僅需要專家們的智慧和經(jīng)驗(yàn)，更需要厘清問題、集中力量、合作探索。為推動(dòng)中草藥囊泡命名、提取、質(zhì)量控制和應(yīng)用的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)的建立，推動(dòng)中草藥囊泡研究與應(yīng)用更好、更快的發(fā)展，吸引和指引相關(guān)研究學(xué)者進(jìn)入中草藥囊泡研究領(lǐng)域，凝聚共識(shí)是第1 步，也是未來研究的基礎(chǔ)。

3 中草藥囊泡命名方法

中草藥囊泡目前的命名多種多樣，尚未統(tǒng)一。中草藥囊泡名稱由中草藥和囊泡2 部分組成。中藥名稱部分有以拉丁名、英文名或中文拼音命名的，囊泡名稱部分有以EVs、囊泡樣納米顆粒、外泌體樣納米顆粒、外泌體樣納米囊泡、湯劑體等命名。例如，姜黃來源的外泌體樣納米顆粒（ turmeric-derived exosome-like nanoparticles，TDNPs）[22]、大蒜外泌體樣納米顆粒（garlic exosomelike nanoparticles，GaELNs）、[20]、天冬來源的外泌體樣納米囊泡 [Asparaguscochinchinensis(Lour.)Merr.-derived exosome-like nanovesicles，ACNVs][25]、苦瓜來源的 EVs 樣納米顆粒（Momordicacharantia-derived extracellular vesicleslike nanovesicles，MCELNs）[27]、人參來源EVs（ginseng-derived extracellular vesicles，GEVs）[18]、石榴來源的 EVs （ extracellular vesicles from pomegranate juice，PgEVs）[28]、紅景天湯劑體（decoctosome）[29]等。隨著相關(guān)研究的日益增多，由于尚缺乏明確的生物發(fā)生途徑以及嚴(yán)格的理化性質(zhì)表征，定義不明確、命名不統(tǒng)一和不規(guī)范的現(xiàn)象將會(huì)越來越嚴(yán)重。規(guī)范命名將是中草藥囊泡標(biāo)準(zhǔn)化、國際化邁出的第一步。

3.1 中草藥部分

中草藥囊泡來源于中草藥，為推進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，以《中國藥典》為標(biāo)準(zhǔn)，采用其植物標(biāo)準(zhǔn)拉丁名。為了避免縮寫重復(fù)率過高，建議用至少2 位首字母縮寫。需要注意的是，在學(xué)術(shù)成果的正文部分需注明中草藥的產(chǎn)地來源、拉丁名、漢語拼音等盡可能詳細(xì)全面的資料，應(yīng)避免因語言文化差異造成混亂和負(fù)面含義。

3.2 囊泡部分

EVs 作為封閉脂質(zhì)雙層的細(xì)胞來源顆粒物的統(tǒng)稱，在2011 年由Gy?rgy 等[30]首次提出。2018 年國際 EVs 研究協(xié)會(huì)（ International Society for Extracellular Vesicles，ISEV ） 在Journalof ExtracellularVesicles上發(fā)布囊泡研究的最少實(shí)驗(yàn)要求（minimal information for studies of extracellular vesicles，MISEV）[31]，定義EVs 為所有由細(xì)胞天然釋放到細(xì)胞外空間的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)且不能復(fù)制（不含有功能的細(xì)胞核）的囊泡樣顆粒物（EV-like particles，EVLP）的總稱。MISEV 建議根據(jù)分離方法不同使用操作性的名稱和尺寸限制的命名方式，將無法通過MISEV 標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)EVs 特性的顆粒稱為細(xì)胞外顆粒（extracellular particle，EP），不含脂質(zhì)雙層的顆粒是指非囊泡狀細(xì)胞外顆粒（non-vesicular extracellular particle，NVEP）[31-33]。

基于中草藥囊泡命名規(guī)則專家組形成共識(shí)意見3、4。

4 中草藥囊泡分離方法

4.1 中草藥初處理

我國中草藥種類多、分布廣、資源豐富。中草藥有根、莖、葉、花、樹皮、果實(shí)、種子和干燥地上部分等分類。針對(duì)新鮮中草藥，目前文獻(xiàn)研究中榨汁破壁法為主要處理手段，如生姜囊泡、大蒜囊泡[20]、人參納米囊泡等。榨汁破壁的方法處理中草藥容易操作、效率高、產(chǎn)量大，但破壁會(huì)造成細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)容物釋放，膜結(jié)構(gòu)重排。其次是真空滲透質(zhì)外洗液（apoplastic washing fluid，AWF），Huang 等[34]介紹了一種分離擬南芥質(zhì)外體的方法，真空滲透獲得的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞內(nèi)容物污染少，但操作相對(duì)繁瑣、時(shí)間長、產(chǎn)量低。已有研究者對(duì)破壁和滲透離心法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)真空滲透法獲得的擬南芥EVs 粒徑更小、電位更低、密度更小、脂膜厚度更高[35]。Zhao 等[36]提出用纖維素酶和果膠酶等消化破壁獲得巴戟天來源的EVs。

蔣澄宇教授研究團(tuán)隊(duì)[29]從植物湯劑中提取具有熱穩(wěn)定性外泌體樣膜結(jié)構(gòu)的納米顆粒狀物質(zhì)稱為“湯劑體”，其對(duì)蒲公英和穿心蓮等中草藥的初處理手段可作為中草藥水煎液EVs 制備的參考方法。

基于中草藥的初處理專家組形成共識(shí)意見5。

共識(shí)意見5中草藥種類豐富多樣，大多數(shù)新鮮中草藥的囊泡提取都可用榨汁破壁初處理，其中含汁液較多的新鮮中草藥可直接擠壓出汁或破壁榨汁；有部分汁液豐富的中草藥因纖維成分多，破壁榨汁會(huì)產(chǎn)生大量絮狀纖維復(fù)合物，在離心/過濾過程中難以去除，擠壓是更適合收取汁液的方法；干品（僅曬干但未經(jīng)炮制的）、含汁液不多的中草藥可以添加適量預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液后破壁榨汁；新鮮葉類可通過滲透收集質(zhì)外洗液獲取囊泡。果實(shí)類、種子類等含果膠成分較多的中草藥不適合榨汁，建議可酶法消化細(xì)胞壁初處理。

4.2 差速超高速離心法

以上初處理手段結(jié)合差速超高速離心法是目前廣泛用于分離囊泡的方法，但各研究團(tuán)隊(duì)離心參數(shù)各不相同，最佳離心方案尚未統(tǒng)一。離心法也有較為明顯的缺點(diǎn)，包括潛在造成囊泡聚集、回收率低，且由于高離心速度可能導(dǎo)致的囊泡完整性受損，加之需要大型超高速離心設(shè)備。

蔗糖密度梯度離心[37]、碘二醇梯度分離[38]在較低的密度下可觀察到分離良好的可見條帶，比哺乳動(dòng)物EVs 的密度要高。基于密度的分離也有不足，即分離密度相似但不同的粒子分子含量或細(xì)胞來源囊泡，且回收率低。

4.3 超濾法

超濾是使用具有不同相對(duì)分子質(zhì)量截留值的超細(xì)納米過濾膜從中草藥汁液中分離EVs。與超速離心方法相比，基于超濾的分離大大縮短了處理時(shí)間，為經(jīng)典的超速離心策略提供了理想的替代方法。如切向流過濾（tangential flow filtration，TFF）[39]解決由于過濾膜上大顆粒堆積而造成的堵塞問題。

4.4 尺寸排阻色譜法

尺寸排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC）是當(dāng)中草藥溶液通過由多孔樹脂顆粒組成的固定相時(shí)，分子可因不同尺寸得到分離；不同尺寸的顆粒表現(xiàn)出不同的保留時(shí)間，有助于基于尺寸的分離。SEC 能夠保留分離囊泡的天然生物活性；與超高速離心和超濾不同，SEC 通過被動(dòng)重力流不會(huì)影響囊泡結(jié)構(gòu)和完整性；通過選擇具有生理滲透壓和黏度的洗脫緩沖液［如磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）］，可以進(jìn)一步增強(qiáng)中草藥囊泡的自然狀態(tài)。但其大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的挑戰(zhàn)在于設(shè)備成本相對(duì)較高，并且需要額外的富集方法[40]。

4.5 免疫親和捕獲法

有研究者將抗體固定在固體表面上進(jìn)行外泌體分離，成功開發(fā)首個(gè)靶向植物EVs 膜蛋白的免疫磁珠[41]。由于其有較大的表面積和近乎均勻的工藝而可以達(dá)到較高的捕獲效率和靈敏度，而且還可容納較大的起始樣品量，因此允許針對(duì)特定應(yīng)用進(jìn)行升級(jí)或縮小。但需要考慮到的是，相關(guān)的非中性pH 和非生理洗脫緩沖液（用于將囊泡與抗體分離）可能會(huì)不可逆地影響所收集的EVs的生物學(xué)功能。此外，該方法還存在產(chǎn)量較低、抗體成本較高的問題，化學(xué)抗體或許是下一步的改進(jìn)方向。但中草藥囊泡標(biāo)志性蛋白目前尚不清楚，缺乏商品化抗體。

4.6 聚合物沉淀法

高親水性的聚合物與囊泡周圍的水分子相互作用，產(chǎn)生疏水性微環(huán)境，使其沉淀。在各種親水性聚合物中，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一種具有良好生物相容性的無毒聚合物（醫(yī)藥產(chǎn)品的常用賦形劑），具有重塑周圍材料水溶性的能力，已被廣泛使用。應(yīng)用PEG 沉淀中草藥囊泡，是一種很有前途的大規(guī)模分離中草藥EVs 的方法。聚合物沉淀法的優(yōu)勢在于設(shè)備需求低、樣品量兼容性高、效率高，但所需處理時(shí)間較長，需要復(fù)雜的化合物去除步驟，會(huì)因此影響下游分析和定量的結(jié)果。其制備的中草藥囊泡純度較其他方案低，但可優(yōu)化[42]。

4.7 其他方法

電泳結(jié)合3×105截留量透析袋從檸檬汁中分離檸檬源性胞外小泡，分離的完整囊泡具有與標(biāo)準(zhǔn)方法超速離心法得到的囊泡相似的大小和數(shù)量[43]。該方法省時(shí)且不需要特殊設(shè)備，可在任何常規(guī)生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。一種快速毛細(xì)管通道聚合物纖維旋下尖端方法（capillary-channeled polymer，C-CP）被證實(shí)可從20 種常見水果和蔬菜（包括中藥生姜等）中分離EVs[44]。

基于中草藥囊泡的分離方法專家組形成共識(shí)意見6。

共識(shí)意見6當(dāng)分離對(duì)象為高純度EVs 時(shí)，推薦使用密度梯度離心；當(dāng)分離對(duì)象為中草藥EVs 樣顆粒時(shí)，推薦使用切向流超濾和SEC 法。推薦結(jié)合不同臨床應(yīng)用和科學(xué)研究問題、設(shè)備條件、成本經(jīng)濟(jì)及中草藥特點(diǎn)在機(jī)構(gòu)內(nèi)開展驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，從而最終選用適合的分離提取方法。鼓勵(lì)本領(lǐng)域研究者們共同協(xié)作，在現(xiàn)有技術(shù)方法的基礎(chǔ)上繼續(xù)探索和優(yōu)化創(chuàng)新適宜的研究方法，優(yōu)化創(chuàng)新分離方法，不斷提高中草藥囊泡分離的效率。

5 中草藥囊泡質(zhì)量控制

中草藥囊泡的研究與應(yīng)用，除分離純化方法和穩(wěn)定性等方面需要仔細(xì)斟酌，全面的質(zhì)量控制，最大限度地減少由于囊泡異質(zhì)性造成的批間差異也是非常重要的。

5.1 形態(tài)

中草藥囊泡呈直徑30～400 nm 的典型茶托樣形態(tài)，可通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）、冷凍電子顯微鏡（cryoelectron microscope，Cyro-EM）進(jìn)行觀測。這些儀器檢測各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中應(yīng)用最廣的是容易操作且效率高的TEM，但測試前對(duì)樣品進(jìn)行脫水和固定可能導(dǎo)致細(xì)胞外囊泡樣納米顆粒變形。SEM 可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，但分辨率相對(duì)較低，樣本類型要求苛刻；AFM 分辨率高，但掃描速度慢、成本高、圖像尺寸單一；Cyro-EM 能呈現(xiàn)囊泡的真實(shí)狀態(tài)，但冷凍導(dǎo)致樣品脆性增大，無法有目的的選擇視野。

5.2 粒徑、電位、濃度和產(chǎn)率

動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（dynamic light scattering，DLS）測量光強(qiáng)的波動(dòng)隨時(shí)間的變化反映中草藥囊泡的粒徑和電位。納米顆粒追蹤分析技術(shù)（nanoparticle tracking analysis，NTA）根據(jù)光散射和布朗運(yùn)動(dòng)檢測囊泡粒徑和濃度。納米流式檢測技術(shù)（nano-flow cytometry，nFCM）可用于檢測粒子粒徑和濃度。激光透射光譜技術(shù)（laser transmission spectrum，LTS）可對(duì)入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析，得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息用于粒徑分析。

5.3 純度

中草藥囊泡純度即每毫克蛋白含粒子數(shù)（particles/mg）。

5.3.1 雙吡啶卡賓酸實(shí)驗(yàn)（bicinchoninic acid assay，BCA） BCA 檢測中草藥囊泡蛋白濃度，NTA 或nFCM 獲得粒子濃度，換算得到每毫克囊泡蛋白所含粒子數(shù)。

5.3.2 Triton X-100 破膜實(shí)驗(yàn) Triton X-100 可對(duì)有膜囊泡顆粒進(jìn)行裂解，而對(duì)無膜顆粒影響不大（Triton X-100 對(duì)部分脂類/脂蛋白等顆粒有一定的裂解作用），Triton X-100 孵育裂解后納米流式檢測儀檢測中草藥囊泡樣品中有膜顆粒占比，可在一定程度上間接反映其純度。

以上2 種方法無法對(duì)雜質(zhì)成分及含量進(jìn)行評(píng)估，因此有學(xué)者提出尺寸排阻高效液相色譜（size exclusion-high-performance liquid chromatography，SEC-HPLC）的分離和檢測方法，可以排除核酸和蛋白雜質(zhì)的干擾。

基于中草藥囊泡粒徑、電位、濃度、產(chǎn)率和純度專家組形成共識(shí)意見7。

共識(shí)意見7建議檢測中草藥囊泡的形態(tài)、電位、粒徑、粒子濃度和顆粒蛋白比（particles/μg）。當(dāng)嚴(yán)格以EVs 為評(píng)價(jià)對(duì)象時(shí)，應(yīng)對(duì)Triton X-100 破膜效率進(jìn)行檢測，建議1% Triton X-100 破膜效率達(dá)到80%以上。另外，因中草藥資源豐富、來源便捷的優(yōu)勢，研究者需要關(guān)注中草藥囊泡的產(chǎn)率，即每克中草藥中獲得的囊泡粒子數(shù)或囊泡蛋白量。

5.4 內(nèi)容物

5.4.1 蛋白質(zhì) 中草藥囊泡裂解后采用BCA 檢測其蛋白濃度。有研究對(duì)擬南芥、橄欖、煙草、向日葵的蛋白組學(xué)進(jìn)行交集發(fā)現(xiàn)共同表達(dá)蛋白：熱休克蛋白HSP70、S-腺苷同型半胱氨酸酶、甘油醛3 磷酸脫氫酶[45]。植物和中草藥囊泡目前還沒有明確的特異性蛋白標(biāo)志物。

5.4.2 核酸 采用DNA/RNA 電泳檢測核酸條帶；RNA 測序發(fā)現(xiàn)具體功能性片段。已有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥EVs 裝載各種功能性RNA 和不同RNA 降解片段，可能對(duì)人類基因有調(diào)控作用[46]。

5.4.3 脂質(zhì) 采用薄層液相色譜檢測脂質(zhì)；脂質(zhì)組學(xué)篩選特征性脂質(zhì)成分。例如，擬南芥葉片組織和EVs 脂質(zhì)組成不同，EVs 含有大量的鞘磷脂[47]。

5.4.4 代謝物 可通過高效液相色譜-質(zhì)譜和代謝組學(xué)研究對(duì)中草藥囊泡的代謝物進(jìn)行分析。生姜囊泡通過代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)其中的姜烯酚可以逆轉(zhuǎn)酒精性肝損傷[19]。

基于中草藥囊泡內(nèi)容物專家組形成共識(shí)意見8。

共識(shí)意見8中草藥囊泡、植物囊泡已有的蛋白/脂質(zhì)/代謝標(biāo)志物涉及種類少，缺乏共通性，機(jī)制未闡明，亟需開發(fā)中草藥囊泡的通用和種類特異的標(biāo)志物。建議研究者廣泛開展組學(xué)研究，對(duì)中草藥囊泡進(jìn)行脂質(zhì)、核酸、蛋白及代謝物分析、有害物分析等多參數(shù)、多指標(biāo)評(píng)價(jià)，有利于發(fā)現(xiàn)中草藥囊泡標(biāo)志物、分析中草藥囊泡的藥用價(jià)值、下游轉(zhuǎn)化和針對(duì)性用藥。

5.5 標(biāo)志性小分子化合物

中草藥已有《中國藥典》作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，中草藥囊泡來源于中藥，藥典規(guī)定的指標(biāo)成分含量標(biāo)準(zhǔn)可作為中草藥囊泡的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[19]。通過特征圖譜、質(zhì)譜檢測囊泡中的標(biāo)志性小分子化合物，一方面對(duì)應(yīng)國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有無特征譜圖，一方面對(duì)應(yīng)《中國藥典》中有效成分含量是否達(dá)標(biāo)。基于中草藥囊泡內(nèi)標(biāo)志性成分專家組形成共識(shí)意見9。

共識(shí)意見9推薦根據(jù)《中國藥典》將中草藥囊泡按照中草藥新劑型進(jìn)行質(zhì)量控制。所研究的中草藥囊泡內(nèi)標(biāo)志性成分的含量也可作為質(zhì)控指標(biāo)之一。

5.6 生物活性

中草藥囊泡蘊(yùn)含了中草藥中絕大部分的活性成分，是中草藥有效成分濃縮的精華。張明真團(tuán)隊(duì)[22]從姜黃根莖中獲取了姜黃EVLP，具有優(yōu)異的抗炎、抗氧化性能。在口服條件下能安全穿越上消化道并有效富集在結(jié)腸炎癥部位，通過調(diào)控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路顯著緩解硫酸葡聚糖鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎及促進(jìn)炎癥的快速消退。張皇閣團(tuán)隊(duì)[48]發(fā)現(xiàn)生姜EVs 中的小RNA 能影響腸道菌群，并完善腸道的屏障功能，通過激活芳香烴受體（arylhydrocarbon receptor，AHR）途徑誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-22（interleukin-22，IL-22）表達(dá)以加強(qiáng)鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）介導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎抑制作用。曹鵬團(tuán)隊(duì)[18]發(fā)現(xiàn)人參EVLP 改變巨噬細(xì)胞極化以抑制黑色素瘤生長，并可重編程腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抗體功效[49]。

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院蔣澄宇團(tuán)隊(duì)[29]從紅景天湯劑中提取了含小RNA-m7（Hongjingtian-derived small RNA m7，HJT-sRNA-m7）的外泌體，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的抗肺纖維化作用。該研究發(fā)現(xiàn)紅景天EVLP 在減輕小鼠疾病癥狀中起著重要作用，并進(jìn)一步確定藥用植物外泌體作為新的活性成分的價(jià)值。中草藥湯劑體展現(xiàn)生物活性，小RNA 與湯劑脂質(zhì)成分共組裝形成湯劑體。

這些研究結(jié)果揭示了中草藥囊泡包括復(fù)方湯劑體，可以被人體攝取，其包含的微小 RNA（microRNA，miRNA）等分子可以與靶器官和基因相互作用以防治疾病，同時(shí)也從側(cè)面證實(shí)中草藥囊泡可以作為一種新的中藥活性成分。

基于中草藥囊泡生物活性專家組形成共識(shí)意見10。

共識(shí)意見10不同的中藥具有不同的生長年限，其藥用價(jià)值也隨之不同，產(chǎn)生的EVs 內(nèi)的各生物標(biāo)志物的種類和表達(dá)量也會(huì)隨之不同，需要對(duì)其進(jìn)行一系列的研究；不同的中藥的藥用價(jià)值通過其不同的炮制方法體現(xiàn)，炮制方法是否會(huì)影響中藥分泌的胞外囊泡的功能，需要對(duì)其進(jìn)行研究。同一中草藥不同部位的功效有一定差別，對(duì)其進(jìn)行分部位囊泡提取，對(duì)比囊泡在含量、生物活性或者藥物傳遞能力等方面的差異，對(duì)中草藥囊泡標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

6 中草藥囊泡的應(yīng)用

研究表明中草藥囊泡生物相容性良好且可大批量分離提取，具有較好的應(yīng)用潛力和前景。植物藥是中藥的主要組成部分，其所含的黃酮、皂苷、生物堿等次生代謝產(chǎn)物已被系統(tǒng)性研究。但由于中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，許多中藥的有效成分及作用機(jī)制仍未得到有效闡釋。隨著在人乳中檢測到植物miRNA，并且可能影響嬰兒體中幾條重要的生物途徑[50]，以及美國加州大學(xué)河濱分校金海翎課題組發(fā)現(xiàn)了宿主擬南芥細(xì)胞EVs 可以傳遞sRNAs 至真菌病原體灰霉病菌并富集，誘導(dǎo)關(guān)鍵致病性真菌基因沉默等[51]，以EVs 作為中藥活性成分的研究也在逐漸展開。

6.1 抵抗和防御功能的應(yīng)用

擬南芥EVs 參與植物免疫應(yīng)答，假單胞菌感染后擬南芥分泌EVs 富含參與生物脅迫反應(yīng)的蛋白質(zhì)——防御蛋白[51]。Cai 等[52]首次系統(tǒng)驗(yàn)證擬南芥EVs 的抗真菌功能，富含小RNA 的EVs 聚集在感染部位內(nèi)化裂解mRNA 沉默靶基因。生姜來源的納米顆?？深A(yù)防酒精誘導(dǎo)的肝損傷并抑制牙齦卟啉單胞菌的致病性[53]。

6.2 醫(yī)療美容與護(hù)膚品領(lǐng)域的應(yīng)用

中草藥囊泡可攜帶原細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)、活性因子等高生物活性物質(zhì)，激活細(xì)胞再生功能，滲入皮膚后釋放囊泡包裹的營養(yǎng)物質(zhì)，持續(xù)滋養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞微環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞活力，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移，促進(jìn)膠原蛋白及彈性修復(fù)損傷、細(xì)胞再生，恢復(fù)皮膚年輕態(tài)。如黃漆木囊泡可減少黑色素生成和降低酪氨酸酶活性以促進(jìn)皮膚美白[54]。

6.3 促進(jìn)傷口愈合的應(yīng)用

中草藥囊泡可以修復(fù)損傷組織、促進(jìn)細(xì)胞生長及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，通過大部分毛細(xì)血管到達(dá)遠(yuǎn)處損傷部位，并且可與現(xiàn)有已知活性藥物進(jìn)行組合，增強(qiáng)療效，促進(jìn)炎癥消除和傷口愈合。

6.4 其他應(yīng)用

中草藥囊泡已在皮膚再生、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等方面發(fā)揮生物學(xué)功能并得到廣泛應(yīng)用。例如，生姜納米顆?？梢苑乐咕凭愿螕p傷，抑制牙齦普林單胞菌致病性等。中草藥囊泡也可用于臨床增效減毒、靶向治療。

基于中草藥囊泡的應(yīng)用專家組形成共識(shí)意見11、12。

共識(shí)意見11我國傳統(tǒng)中草藥多內(nèi)傷口服，外傷外敷。研究者以對(duì)比中草藥囊泡治療效果為目的的研究可選擇一致的給藥方式，首選口服給藥；以探明治療機(jī)制為目的的研究可選擇多種給藥方式，如口服遞送、尾靜脈注射、腹腔注射等；同時(shí)也要根據(jù)疾病情況具體問題具體分析，如阿爾茨海默病采用側(cè)腦室注射、創(chuàng)傷采用外敷等方法。共識(shí)意見12中草藥囊泡的研究考慮適應(yīng)證時(shí)，不拘泥于傳統(tǒng)中藥，應(yīng)保證中草藥囊泡的安全、產(chǎn)率、純度和標(biāo)準(zhǔn)化，是實(shí)現(xiàn)應(yīng)用轉(zhuǎn)化的前提。

7 其他需要探索的問題

隨著EVs 領(lǐng)域研究的不斷深入，其有望作為藥物、醫(yī)美護(hù)膚品、疫苗遞送的重要載體即“新型納米遞送系統(tǒng)”。有研究發(fā)現(xiàn)人參囊泡可通過運(yùn)載miRNA 刺激干細(xì)胞的神經(jīng)分化[55]，以檸檬囊泡負(fù)載阿霉素可以克服癌癥耐藥性[15]，葡萄柚囊泡融合活化的白細(xì)胞膜可搭載抗癌藥物殺傷腫瘤[56]。其中，中草藥傳統(tǒng)的歸經(jīng)特性決定其具有天然的優(yōu)秀靶向能力，中草藥囊泡通過工程化修飾可靶向到特定的組織和器官，解決傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)難以解決的靶向問題；納米級(jí)囊泡攜帶細(xì)胞表面分子具有克服生物屏障的能力，且安全、經(jīng)濟(jì)、方便儲(chǔ)存。

我國幅員遼闊、地形復(fù)雜及顯著的氣候差異和土壤環(huán)境，為各類藥用植物的生長和繁殖提供了得天獨(dú)厚的生態(tài)條件，因而蘊(yùn)藏著豐富的藥材資源。中草藥的地域性、多樣性、安全性和穩(wěn)定性問題也增加了中草藥囊泡研究的復(fù)雜性?；谥胁菟幍赖匦浴⑺幮缘忍匦詫＜医M形成共識(shí)意見13。

共識(shí)意見13功能性研究對(duì)象優(yōu)先選擇道地藥材。選擇特定環(huán)境和生長年限、療效穩(wěn)定的藥材進(jìn)行研究，提高實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。鼓勵(lì)研究者們對(duì)不同產(chǎn)地、不同生長年限的某一中草藥進(jìn)行系統(tǒng)研究。如能將中草藥囊泡與中藥四氣五味、升降浮沉、歸經(jīng)的特性相結(jié)合，用現(xiàn)代研究解釋傳統(tǒng)中藥理論，將是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的一大突破。

8 結(jié)語與展望

中草藥作為中藥材是中華民族在與疾病長期斗爭的過程中積累的寶貴財(cái)富。國務(wù)院印發(fā)的《中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要》中指出，在繼承發(fā)揚(yáng)中醫(yī)藥優(yōu)勢特色的基礎(chǔ)上，充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化和國際化，以滿足時(shí)代發(fā)展和民眾日益增長的醫(yī)療保健需求。中草藥免疫原性低、安全性高、可大批量低成本生產(chǎn)制備，使中草藥囊泡在防治疾病或作為藥物運(yùn)輸載體產(chǎn)生協(xié)調(diào)治療效果等方面將發(fā)揮極大的優(yōu)勢。但也面臨一些挑戰(zhàn)：中草藥囊泡提純方法的開發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)化、特異性標(biāo)志物的篩選、生物功能等。中草藥囊泡研究與應(yīng)用是中醫(yī)藥現(xiàn)代化新機(jī)遇，應(yīng)用前景無限，機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存。

本共識(shí)匯聚國內(nèi)中草藥及囊泡相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的智慧，博極醫(yī)源，汲古求新，充分結(jié)合和發(fā)揮傳統(tǒng)中醫(yī)藥獨(dú)特優(yōu)勢，期望能引領(lǐng)國內(nèi)外中草藥囊泡研究領(lǐng)域的高質(zhì)量發(fā)展，取得更高、更快、更強(qiáng)的突破性成果，有力地推動(dòng)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展。

本共識(shí)參照《中醫(yī)藥臨床應(yīng)用專家共識(shí)的報(bào)告規(guī)范》的規(guī)則制訂，由中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)細(xì)胞外囊泡專業(yè)委員會(huì)中草藥囊泡研究與應(yīng)用專家委員會(huì)、廣東省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中草藥囊泡研究與應(yīng)用專業(yè)委員會(huì)與中草藥囊泡廣東省工程研究中心共同提出并發(fā)布。

共識(shí)編寫專家委員會(huì)

學(xué)術(shù)顧問（按姓氏拼音排列）

蔣澄宇 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所

王 前 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院

王 偉 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

共識(shí)召集人

趙可偉 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心

編寫組長（按姓氏拼音排列）

曹 鵬 南京中醫(yī)藥大學(xué)

王宏斌 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

王 通 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院

趙可偉 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心

鄭 磊 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

主要執(zhí)筆專家

趙 清 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心

王 通 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院

趙可偉 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心

編寫組專家（按姓氏拼音排列）

曹 鵬 南京中醫(yī)藥大學(xué)

陳 熹 南京大學(xué)

樊俊兵 南方醫(yī)科大學(xué)

姜云耀 清華大學(xué)

蔣澄宇 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所

靳紅磊 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

李 博 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

李 耿 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

李智洋 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院

林興棟 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心

劉筆鋒 華中科技大學(xué)

彭麗華 浙江大學(xué)

齊素華 徐州醫(yī)科大學(xué)

喬宏志 南京中醫(yī)藥大學(xué)

汪 泱 上海市第六人民醫(yī)院

王宏斌 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

王勝鵬 澳門大學(xué)

王 通 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院

王 鶯 南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

張還添 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院

張明真 西安交通大學(xué)

趙可偉 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心

趙 清 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心

鄭建建 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

鄭 磊 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

周玖瑤 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

利益沖突所有參與本共識(shí)制訂的專家均聲明不存在利益沖突。

志謝本共識(shí)形成得到中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)細(xì)胞外囊泡研究與應(yīng)用專業(yè)委員會(huì)（CSEV）、廣東省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中草藥囊泡研究與應(yīng)用專業(yè)委員會(huì)和中草藥囊泡廣東省工程研究中心的支持。

通信作者

趙可偉 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，中草藥囊泡廣東省工程研究中心，中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)細(xì)胞外囊泡專業(yè)委員會(huì)中草藥囊泡研究與應(yīng)用專家委員會(huì)，廣東省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中草藥囊泡研究與應(yīng)用專業(yè)委員會(huì)，廣州市中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

鄭 磊 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院