矮牽牛PhSPL9b基因的克隆及功能分析

關(guān)鍵詞 矮牽牛； PhSPL9b； 超量表達(dá)； 開花； 轉(zhuǎn)錄激活特性

中圖分類號 S681.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）03-0240-09

開花是高等植物從營養(yǎng)生長到生殖生長狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，這一過程決定植物能否成功繁殖子代［1-2］。植物的開花受多種外界因素和內(nèi)部因素的綜合調(diào)控，這些調(diào)控途徑既可以單獨發(fā)揮作用，也存在大量的交叉整合，通過基因之間的相互促進(jìn)和抑制，形成自我調(diào)控、正向反饋調(diào)控、負(fù)向反饋調(diào)控等不同的調(diào)控模式，最終繪制出一個復(fù)雜而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近年來，研究人員已經(jīng)在許多植物中開展開花相關(guān)基因的研究，如改變園藝植物的開花時間或延長整個花期，解決雜交育種過程中花期不遇等問題［2］。此外，開花基因會影響植物的花序結(jié)構(gòu)，而花序結(jié)構(gòu)對糧食、經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量具有重要的調(diào)控作用［3］。因此，研究開花基因在植物中的作用，對園藝作物與經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量提高及觀賞植物的花期調(diào)控都具有重要的指導(dǎo)意義。

SPL（SQUAMOSA-promoter binding proteinlike）是植物中特異的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物營養(yǎng)生長和生殖生長過程中發(fā)揮著重要作用［4-7］。近年來，SPL 家族基因的功能在許多植物中被廣泛報道，其中SPL9 亞家族成員的功能研究較多且深入。如在擬南芥中，過表達(dá)AtSPL9 和AtSPL15，影響花芽發(fā)育和開花［6］，此外，SPL9 響應(yīng)生長素信號并抑制擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育［4］。Xie 等［8］發(fā)現(xiàn)AtSPL9 和AtSPL15與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的轉(zhuǎn)錄因子FHY3（FAR-REDELONGATED HYPOCOTYL 3）和FAR1（FARRED-IMPAIRED RESPONSE 1），以及獨腳金內(nèi)酯信號通路關(guān)鍵抑制因子SMXL6/SMXL7/SMXL8（SUPPRESSOR OF MORE AXILLARYGROWTH2-LIKE）相互作用，并利于BRC1（BRANCHED 1）的轉(zhuǎn)錄激活，最終促進(jìn)擬南芥分枝。Yu 等［9］發(fā)現(xiàn)SPL9 可直接靶向TCL1（TRICHOMELESS1）和TRY（TRIPTYCHON）調(diào)控擬南芥表皮毛的發(fā)育。Cui 等［10］研究表明miR156/157可直接調(diào)控SPL9，進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)花青素的積累。此外，SPL9 可直接調(diào)控CBF2（C-REPEAT BINDINGFACTOR 2）提高植物的抗寒性［11］。在水稻中，IPA1（ideal plant architecture 1）數(shù)量性狀位點關(guān)聯(lián)的OsSPL14（AtSPL9/15 的同源蛋白）通過改變水稻株型最終影響水稻的產(chǎn)量［12］；在大豆中，GmSPL9d（AtSPL9/15 的同源蛋白）與WUS（WUSCHEL）互作協(xié)調(diào)調(diào)控大豆的分枝結(jié)構(gòu)，最終影響大豆的產(chǎn)量［13］。

矮牽牛（Petunia hybrida）為茄科碧冬茄屬的一、二年生草本花卉，花色絢麗、株型豐富、花期長，被譽為“花壇之王”。目前對矮牽牛的研究主要集中在花器官發(fā)育方面［14-16］，而對開花分子機(jī)理的研究極為有限。Morel 等［17］發(fā)現(xiàn)矮牽牛AP1/SQUA 亞家族的4 個成員PFG、FBP26、FBP29 和euAP1 都能調(diào)控開花，但作用程度存在差異；Preston 等［18］研究發(fā)現(xiàn)PhSBP1（PhSPL3）和PhSBP2（PhSPL4c）不同程度地促進(jìn)矮牽牛成花轉(zhuǎn)換，且PhSBP1 加速葉片的萌發(fā)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR156/157 靶向部分PhSPLs 基因調(diào)控矮牽牛和擬南芥開花［19-20］，但具體是通過靶向哪個或者哪些PhSPLs 基因調(diào)控開花尚不明確。因此，為了深入研究PhSPL9b 轉(zhuǎn)錄因子在矮牽牛成花轉(zhuǎn)換中的作用，本研究克隆了PhSPL9b基因，對其基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄激活特性進(jìn)行分析，構(gòu)建相關(guān)載體分別轉(zhuǎn)化矮牽牛和擬南芥，以期揭示PhSPL9b 在矮牽牛成花轉(zhuǎn)換中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以矮牽牛W115 株系（Petunia hybrida var.Mitchel diploid）和野生型（Col-0 生態(tài)型）擬南芥（Arabidopsis thaliana）為試驗材料。矮牽牛種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地溫室，常規(guī)管理。擬南芥種植于光照培養(yǎng)箱（光照強(qiáng)度2 000 lx、16 h 光照/8 h 黑暗，溫度21～22 ℃，濕度75%）。

1.2 PhSPL9b 相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)矮牽?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定的PhSPLs 基因［19］，設(shè)計并合成特異引物，以矮牽牛不同組織部位的混樣cDNA 為模板，用高保真酶擴(kuò)增并克隆PhSPL9b基因。PCR反應(yīng)條件為98 ℃ 2 min；32～35 循環(huán)：98 ℃ 10 s，55～60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min；總延伸72 ℃ 10 min，保溫4 ℃ 10 min。測序無誤后，使用Sal Ⅰ 和BamH Ⅰ 分別雙酶切含有PhSPL9b 的pMD18-T 和植物表達(dá)載體pCAMBIA2300，用T4DNA 連接酶將目的基因連接到植物表達(dá)載體，構(gòu)建35S∶∶PhSPL9b 表達(dá)載體。同時，利用重疊延伸PCR 法將PhSPL9b 的miR156/157 靶位點進(jìn)行點突變，由GGTGCTCTCTCTCTTCTGTCA 突變成GGAGCGCTATCACTGCTTTCC，構(gòu)建35S∶∶rPhSPL9b 表達(dá)載體，具體操作和PCR 反應(yīng)條件同上。

以35S∶∶PhSPL9b 質(zhì)粒為模板，設(shè)計并合成含EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 酶切位點的特異引物克隆PhSPL9b基因。測序無誤后，使用EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切含有PhSPL9b 的pMD18-T 與酵母表達(dá)載體pGADT7 和pGBKT7，用T4 DNA 連接酶將雙酶切后的表達(dá)載體與目的基因連接，構(gòu)建pGADT7-PhSPL9b 和pGBKT7-PhSPL9b 表達(dá)載體。

所有構(gòu)建的質(zhì)粒都通過PCR 檢測篩選及雙酶切進(jìn)行驗證。所用引物見表1。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將PhSPL9b 和rPhSPL9b 基因表達(dá)載體質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至GV3101 和AGL0 農(nóng)桿菌，通過花序侵染法和葉盤轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化擬南芥和矮牽牛，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株，具體操作方法參照Zhou 等［19-20］。獲得轉(zhuǎn)化株系后，利用2×CTAB 法提取轉(zhuǎn)化植株葉片DNA，用特異引物35S-F 和PhSPL9b-R（short）進(jìn)行PCR 檢測，篩選轉(zhuǎn)基因陽性株系。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定

在擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中，根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株的表型，每個載體各選擇3 個符合3∶1 分離比的T2代轉(zhuǎn)基因株系，將其后代在長日照植物光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)植株抽薹1 cm 高時，統(tǒng)計分析每個株系35 株轉(zhuǎn)基因植株（T3代）的表型，如開花時間、蓮座葉數(shù)目和莖生葉數(shù)目。

在矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系中，每個載體各選擇3 株表達(dá)量不同的T0代轉(zhuǎn)基因植株，將其后代在長日照條件下種植。經(jīng)PCR 鑒定后，每個轉(zhuǎn)基因株系各統(tǒng)計25 株轉(zhuǎn)基因植株（T1 代）的表型，如開花時間、植株高度、葉片長寬比、葉片節(jié)間距、花朵直徑和分枝數(shù)。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)hSPL9b基因表達(dá)量分析

在擬南芥中，選取同一時期CK（空載pCAMBIA2300轉(zhuǎn)化Col-0）未開花時的幼苗和T3代35S∶∶PhSPL9b 和35S∶∶rPhSPL9b 抽薹的轉(zhuǎn)基因植株；在矮牽牛中，選取同一時期CK 未開花時的頂芽和T2代35S∶∶PhSPL9b 已分化出花序的頂芽，分別通過RT-PCR 和qRT-PCR 檢測PhSPL9b 在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)情況。每個株系3 個生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR 的反應(yīng)體系為10 μL：1 μL 稀釋10 倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA），5.0 μL 2×SYBR Mixture，0.2 μL上游特異引物和0.2 μL 下游特異引物（10 μmol/L），0.2 μL ROX，3.4 μL ddH₂O。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，55 ℃退火34 s，40 次循環(huán)，以擬南芥AtEF1α 和矮牽牛PhEF1α 作為內(nèi)參基因［21］。

1.6 矮牽牛PhSPL9b 轉(zhuǎn)錄激活特性分析

將pGBKT7-PhSPL9b 和pGADT7、pGADT7-PhSPL9b 和pGBKT7、pGBKT7-53 和pGADT7-T（陽性對照）及pGBKT7-Lam 和pGADT7-T（陰性對照）組合分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，經(jīng)SD/?Trp/?Leu 篩選及陽性檢測后，再在SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade 篩選。將各組合的陽性菌落在SD/? Trp/? Leu 液體培養(yǎng)基中30 ℃ 220 r/min 孵育24 h，稀釋后使其OD₆₀₀=1，菌液經(jīng)3500 r/min 室溫離心4 min 后棄上清，用ddH₂O 重懸菌體，吸打混勻后將菌液稀釋成5 個濃度梯度，即10¹、10⁰、10^?1、10^?2和10^?3，每個濃度梯度的菌液各取6 μL 點于SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X- α-gal（16 ng/μL）固體培養(yǎng)基，30 ℃遮光倒置孵育3～5 d，檢測PhSPL9b的轉(zhuǎn)錄激活特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PhSPL9b的基因結(jié)構(gòu)

序列分析結(jié)果顯示，PhSPL9b 基因編碼區(qū)長度為1 125 bp，編碼374 個氨基酸。與矮牽?；蚪M數(shù)據(jù)［22］比對發(fā)現(xiàn)，PhSPL9b 含有3 個外顯子，2 個內(nèi)含子（圖1）。

2.2 PhSPL9b 表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR 擴(kuò)增、測序、雙酶切、連接等步驟，完成植物表達(dá)載體35S∶∶PhSPL9b 和35S∶∶rPhSPL9b、酵母表達(dá)載體pGADT7-PhSPL9b 和pGBKT7-PhSPL9b 的構(gòu)建（圖2A）。雙酶切驗證結(jié)果表明，所有載體均構(gòu)建成功（圖2B）。

2.3 PhSPL9b 轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定

將35S∶∶PhSPL9b 和35S∶∶rPhSPL9b 載體分別電轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101 和AGL0，通過花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥和葉盤法轉(zhuǎn)化矮牽牛。經(jīng)Kan 篩選和PCR 檢測，獲得42 個擬南芥35S∶∶PhSPL9b 轉(zhuǎn)基因株系（圖3A）和34 個矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系（圖3B）；獲得39 個擬南芥35S∶∶rPhSPL9b 轉(zhuǎn)基因株系（圖3C），但未能獲得矮牽牛轉(zhuǎn)化株系。

表型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中，36 株35S∶∶PhSPL9b 轉(zhuǎn)基因T1 代植株和29 株35S∶∶rPhSPL9b 轉(zhuǎn)基因T₁ 代植株表現(xiàn)出早花表型，其中35S∶∶PhSPL9b 轉(zhuǎn)基因植株的平均提前開花時間為4.9 d，35S∶∶rPhSPL9b 轉(zhuǎn)基因植株的平均提前開花時間為8.1 d。如圖4 和表2 所示，35S∶∶PhSPL9b 轉(zhuǎn)基因株系#13、#19 和#21 株系有明顯的早花表型，同時蓮座葉數(shù)目顯著減少，其中#13 株系開花時間提前5.6 d，#19 株系開花時間提前4.0 d，#21 株系開花時間提前5.3 d。35S∶∶rPhSPL9b 轉(zhuǎn)基因株系中，#8、#12 和#26 株系有明顯的早花表型，且蓮座葉數(shù)目也顯著減少（圖5 和表2），但莖生葉數(shù)目與CK 相比無顯著差異，其中#8 株系開花時間提前7.5 d，#12 株系開花時間提前8.9 d，#26 株系開花時間提前7.8 d。RT-PCR 和qRT-PCR 結(jié)果顯示，與CK 相比，擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中PhSPL9b 的表達(dá)量均被上調(diào)，且表達(dá)量越高，早花表型越明顯。由此可見，PhSPL9b和rPhSPL9b 超量表達(dá)后，均可促進(jìn)擬南芥開花，且35S∶∶ rPhSPL9b 轉(zhuǎn)基因株系的表型比35S∶∶PhSPL9b 轉(zhuǎn)基因株系更明顯。

在矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株中，27 株T0 代35S∶∶PhSPL9b 轉(zhuǎn)基因植株的開花時間較CK 提前，開花時間平均提前7.6 d。如圖6 和表3 所示，轉(zhuǎn)基因株系#7、#13 和#28 有明顯的早花表型，但株高、葉片長寬比、分枝數(shù)、葉片節(jié)間距和花朵直徑與CK 均沒有顯著性差異。其中#28 株系早花表型最顯著，開花時間提前9.2 d，#7 株系開花時間提前6.6 d，#13 株系開花時間提前7.1 d。RT-PCR 和qRT-PCR 結(jié)果顯示，PhSPL9b 的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株中顯著高于CK（圖6）。

2.4 矮牽牛PhSPL9b 的轉(zhuǎn)錄激活特性分析

將質(zhì)粒組合pGBKT7-PhSPL9b+pGADT7、pGADT7-PhSPL9b+pGBKT7、pGBKT7-53+pGADT7-T （ 陽性對照） 及pGBKT7-Lam+pGADT7-T（陰性對照）分別轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對照pGBKT7-53+pGADT7-T 和pGBKT7-PhSPL9b+pGADT7 共轉(zhuǎn)后的酵母單菌落在SD/―Trp/―Leu 和SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade 上正常生長，并在SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade/X-α-gal 上發(fā)生顯色反應(yīng)（藍(lán)色），而pGADT7-PhSPL9b+pGBKT7 和pGBKT7-Lam+pGADT7-T（陰性對照）共轉(zhuǎn)后的酵母單菌落在SD/―Trp/―Leu 上正常生長，但在SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade 不能正常生長，也不能在SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade/X-α-gal 上發(fā)生顯色反應(yīng)（圖7）。因此，推斷PhSPL9b 是一個轉(zhuǎn)錄激活子，可通過激活下游基因的表達(dá)而發(fā)揮其功能。

3 討論

開花是觀賞植物的重要性狀，決定著觀賞植物的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值［23］，研究開花基因在植物中的功能，并應(yīng)用到實際育種中，具有重要的現(xiàn)實意義。SPL 是植物特異的轉(zhuǎn)錄因子家族，在高等植物成花轉(zhuǎn)換及生長發(fā)育過程中扮演著重要角色。近年來，關(guān)于SPL 基因功能的研究在模式植物如擬南芥、水稻和番茄中成果頗豐，但在矮牽牛中關(guān)于SPL 功能的研究相對較少。在擬南芥、水稻和番茄等植物中研究發(fā)現(xiàn)，SPL 基因家族成員根據(jù)其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系均分為8 個亞家族［6， 24］。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，矮牽牛SPL 基因家族成員也被分為8 個亞家族，且同一亞家族成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)［19］，推測同一亞家族成員中矮牽牛PhSPLs 和擬南芥AtSPLs可能具有相似的功能；同時，課題組研究發(fā)現(xiàn)miR156/157 靶向部分PhSPLs 調(diào)控矮牽牛和擬南芥開花［19-20］，但具體是通過靶向哪個或者哪些PhSPLs基因調(diào)控開花尚不明確。

本研究構(gòu)建35S∶∶PhSPL9b 和35S∶∶rPhSPL9b超量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化矮牽牛和擬南芥，結(jié)果顯示PhSPL9b 和rPhSPL9b 超量表達(dá)擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株的開花時間顯著提前，蓮座葉數(shù)目減少；35S∶∶PhSPL9b 矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株的開花時間與對照相比也顯著提前，這表明PhSPL9b 對開花時間具有重要的調(diào)控作用。Xu 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，AtSPL9 和AtSPL15在擬南芥中超量表達(dá)后，促使擬南芥提前開花。在本研究中，PhSPL9b 也促進(jìn)擬南芥和矮牽牛開花，這表明其功能具有保守性。本研究未獲得矮牽牛35S∶∶rPhSPL9 轉(zhuǎn)基因植株，表明矮牽牛中不同基因的轉(zhuǎn)化效率不同，而轉(zhuǎn)化效率和目標(biāo)基因有關(guān)的報道在其他植物中也較常見，如李姝璇［25］發(fā)現(xiàn)不同基因在大豆中的轉(zhuǎn)化效率有顯著差異。

基因表達(dá)分析研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量和表型強(qiáng)弱密切相關(guān)，且rPhSPL9b 作用更顯著。Xu 等［6］研究發(fā)現(xiàn)將AtSPL9 對應(yīng)的miR156/157的靶位點突變后，miR156/157 不能準(zhǔn)確地與rAt?SPL9 靶位點進(jìn)行互補配對，從而不能識別該靶位點，無法進(jìn)行AtSPL9 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切割，最終導(dǎo)致At?SPL9 表達(dá)量劇增，顯著性地促進(jìn)擬南芥開花［6］，因此推測，PhSPL9b 靶位點突變后，miR156/157 不能對其轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行切割，導(dǎo)致PhSPL9b 表達(dá)量劇增，最終顯著性地促進(jìn)擬南芥開花。

轉(zhuǎn)錄因子能發(fā)揮有效調(diào)控的必要前提是具有轉(zhuǎn)錄活性［26］。本研究通過轉(zhuǎn)錄激活試驗分析發(fā)現(xiàn)PhSPL9b 是一個轉(zhuǎn)錄激活子，同時PhSPL9b 在矮牽牛和擬南芥中超量表達(dá)均表現(xiàn)出早花表型，這表明PhSPL9b 可能是通過轉(zhuǎn)錄激活下游基因而調(diào)控矮牽牛和擬南芥開花。但PhSPL9b 是如何調(diào)控擬南芥和矮牽牛開花的？其下游靶基因是什么？這些相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

（責(zé)任編輯：葛曉霞）