枯草芽孢桿菌復合微生物制劑對雞壞死性腸炎的預防效果

關鍵詞 雞； 枯草芽孢桿菌復合微生物制劑； 壞死性腸炎； 產(chǎn)氣莢膜梭菌

中圖分類號 S852.3 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）03-0275-07

雞壞死性腸炎（necrotic enteritis，NE）是由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，CP）毒素引起的一種以空腸組織病變?yōu)橹鞯哪c道疾病，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素主要有α、β、ε、ι、腸毒素、壞死性腸炎B 樣毒素［1］。壞死性腸炎造成全球家禽業(yè)經(jīng)濟損失每年高達60 億美元［2］。長期以來家禽飼料中添加抗生素以控制NE 的發(fā)生［3］，自2020 年7 月1 日起我國禁止在畜禽飼料中添加抗生素。研究表明，益生元、益生菌、精油、植物提取物和有機酸可以作為抗生素的潛在替代品［4］，但尋找1 種對雞壞死性腸炎安全有效的抗生素替代品尤為重要。有研究表明日糧中添加枯草芽孢桿菌可以提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善腸道形態(tài)、降低腸道病變評分，調(diào)控腸道微生物群［5-6］。但有關枯草芽孢桿菌復合微生物制劑對壞死性腸炎肉雞的影響報道較少。因此，本研究通過在日糧中分別添加以枯草芽胞桿菌、香芹酚、百里香酚、肉桂醛為主的微生物制劑和以枯草芽孢桿菌及其低溫發(fā)酵產(chǎn)物為主的微生物制劑，探討枯草芽孢桿菌復合微生物制劑對肉雞感染CP 后體質(zhì)量、腸道形態(tài)、抗氧化能力和腸道緊密連接蛋白表達的影響，旨在為該微生物制劑應用于實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理

1 日齡健康817 雛雞120 只（購自襄陽正大農(nóng)牧有限公司），隨機分成4 個處理組，每組3 個重復，每個重復10 只：空白對照（Control）組、預防1（Prob1）組、預防2（Prob2）組、壞死性腸炎（NE）組。試驗第1～16 天 Control 組、NE 組肉雞飼喂基礎日糧，Prob1組肉雞飼喂基礎日糧和微生物制劑1，Prob2 組肉雞飼喂基礎日糧和微生物制劑2；試驗第14～16 天，Prob1、Prob2、NE 組每只肉雞灌胃CP（3×108 cfu/d）；試驗第17～23 天所有組肉雞飼喂基礎日糧。整個試驗周期為23 d。

基礎日糧為510 肉小雞飼料，購自襄陽正大農(nóng)牧有限公司，飼料組成：粗蛋白質(zhì)≥20%、粗纖維≤6%、粗灰分≤8%、鈣0.6%～1.2%、總磷≥0.5%、氯化鈉0.2%～0.8%、蛋氨酸和胱氨酸≥0.74%、水分≤14%。G 型產(chǎn)氣莢膜梭菌由華中農(nóng)業(yè)大學基礎獸醫(yī)病理實驗室分離鑒定保存，攻菌前用FTG（液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基）增菌培養(yǎng)至3×10⁸ cfu/mL；復合微生態(tài)制劑由武漢新聯(lián)大生物有限公司提供，微生物制劑的添加劑量為0.2%。微生態(tài)制劑1 主要成分：枯草芽胞桿菌（10⁹ cfu/g）、2% 香芹酚、2.5% 百里香酚、8% 肉桂醛；微生態(tài)制劑2 主要成分：枯草芽胞桿菌（10⁷ cfu/g）及其低溫發(fā)酵產(chǎn)物（小肽20.79%）。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：總超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、堿性磷酸酶（AKP）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNAIsolater Total RNA Extraction Reagen、HiScript II QRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

主要儀器：ELX800 酶標儀（BIO-TEK 公司）；Step One Plus 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；Nano-300 超微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 測定指標及方法

1）肉雞體質(zhì)量和平均日增重的測定。于試驗第14、23 天對肉雞稱質(zhì)量并計算平均日增重（averagedaily gain，ADG）。

2）肉雞空腸形態(tài)觀察。于試驗第17、23 天，每個處理組隨機選取10 只雞進行屠宰，剪取空腸部位2cm 于4% 甲醛中固定后制成石蠟切片，用輪式切片機制作成4 μm 切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察各組肉雞腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。采用Nikon 80i 生物光學顯微鏡及高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)測量肉雞空腸絨毛長度（villus length，VL）和隱窩深度（crypt depth，CD），并計算絨隱比。選取5 張切片進行測定，取平均值。

3）肉雞空腸黏膜抗氧化指標的測定。采用試劑盒測定總超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）、堿性磷酸酶（AKP）活性、丙二醛（MDA）含量。

4）肉雞空腸緊密連接蛋白基因表達的測定。根據(jù)Trizol 法提取腸道黏膜RNA，采用超微量分光光度計測定RNA 濃度和純度。采用熒光定量RTPCR（qRT-PCR）檢測各組肉雞空腸緊密連接蛋白閉合蛋白（claudin，CLDN）-1、閉合小環(huán)蛋白（zonula occludens，ZO）-1 和ZO-2 的基因表達。參照文獻［7］設計引物（表1）。

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR 擴增體系（10 μL）：cDNA 模板0.5 μL，上下游引物各0.2 μL，2×chamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix 5 μL，ddH₂O 4.5 μL。反應程序為 95 ℃預變性 5 min； 95 ℃ 5 s，56 ℃ 45 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s。采用2^-ΔΔCt 法計算CLDN-1、ZO-1、ZO-2 基因的mRNA 相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0 分析數(shù)據(jù)，以One-wayANOVA 進行Duncan’s 多重比較，結(jié)果用“平均值±標準差”表示。Plt;0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌復合微生物制劑對肉雞生長發(fā)育的影響

由表2 可知，試驗第14 天，NE 組肉雞體質(zhì)量和平均日增重低于Control 組但無顯著差異（Pgt;0.05）；Prob1 組肉雞體質(zhì)量顯著高于NE 組（Plt;0.05），日增重無差異（Pgt;0.05）；Prob2 組肉雞體質(zhì)量和日增重顯著高于NE 組（Plt;0.05）。試驗第23 天，NE 組肉雞體質(zhì)量和平均日增重顯著低于Control 組（Plt;0.05）；Prob1 組和Prob2 組肉雞體質(zhì)量和日增重均顯著高于NE 組（Plt;0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌復合微生物制劑對肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1 可見，NE 組雞空腸絨毛頂端黏膜上皮可見變性壞死，脫落入管腔（圖1D、H），Control 組肉雞腸絨毛完整，未見明顯異常（圖1A、E）；試驗第17、23天，Prob1 組（圖1B、F）、Prob2 組（圖1C、G）肉雞腸道結(jié)構(gòu)完整，無明顯病理變化。

由表3 可知，試驗第17、23 天NE 組肉雞空腸絨毛長度、絨隱比顯著低于Control 組（Plt;0.05），試驗第17 天NE 組肉雞空腸隱窩深度顯著高于Control 組（Plt;0.05），試驗第23 天無顯著差異（Pgt;0.05）。試驗第17、23 天，Prob1、Prob2 組空腸絨毛長度、絨隱比顯著高于NE 組（Plt;0.05），試驗第17 天Prob1 組隱窩深度與NE 組無顯著差異（Pgt;0.05），Prob2 組隱窩深度顯著低于NE 組（Plt;0.05），第23 天Prob1、Prob2 組隱窩深度與NE 組無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌復合微生物制劑對肉雞空腸黏膜抗氧化指標的影響

由表4 可知，試驗第17 天，NE 組肉雞空腸黏膜T-SOD、T-AOC、AKP 活性顯著低于Control 組（Plt;0.05）；Prob1 組肉雞空腸黏膜T-SOD、T-AOC、AKP 活性顯著高于NE 組（Plt;0.05）；Prob2 組肉雞空腸黏膜T-SOD 活性高于NE 組但無顯著差異（Pgt;0.05），T-AOC 、AKP 活性顯著高于NE 組（Plt;0.05）；試驗第23 天，NE 組肉雞空腸黏膜T-SOD、活性顯著低于Control 組（Plt;0.05），NE 組肉雞空腸黏膜T-AOC、AKP 活性低于Control 組但無顯著差異（Plt;0.05）；Prob1 組、Prob2 組肉雞空腸黏膜T-SOD、T-AOC、AKP 活性高于NE 組，差異不顯著（Pgt;0.05）。試驗第17、23天，NE組肉雞空腸黏膜MDA含量高于Control 組，而Prob1、Prob2 組肉雞空腸黏膜MDA含量低于NE組，但均無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.4 枯草芽孢桿菌復合微生物制劑對肉雞空腸緊密連接蛋白基因表達的影響

由表5 可知，試驗第17 天，NE 組肉雞空腸CLDN-1 和ZO-2 基因表達量顯著低于Control 組（Plt;0.05），ZO-1基因表達量低于Control組但差異不顯著（Pgt;0.05）；Prob1 肉雞空腸ZO-1、ZO-2 基因表達量高于NE組，無顯著差異（Pgt;0.05）；Prob2組肉雞空腸CLDN-1、ZO-1、ZO-2 基因表達量高于NE 組，無顯著差異（Pgt;0.05）。試驗第23天，NE組肉雞空腸CLDN-1、ZO-1、ZO-2 基因表達量低于Control 組，無顯著差異（Pgt;0.05），ZO-1 基因表達量顯著低于Control組（Plt;0.05）；Prob1組、Prob2組肉雞空腸CLDN-1、ZO-2 基因表達量高于NE 組，無顯著差異（Pgt;0.05），ZO-1基因表達量顯著高于NE組（Plt;0.05）。

3討論

自畜禽飼料中禁止添加抗生素以來，益生菌、植物精油等抗生素替代品在養(yǎng)殖業(yè)尤其是預防畜禽胃腸道疾病中逐步受到重視［4］。

通常情況下，肉雞感染CP 會引起腸道黏膜受損，導致雞生長遲緩和飼料轉(zhuǎn)化率降低［8］。本研究的組織學結(jié)果表明NE 組肉雞腸道上皮細胞壞死，2 種枯草芽孢桿菌復合微生物制劑不同程度緩解腸道病變。本研究雞群感染CP 后體質(zhì)量降低，這與Grilli等［9］報道的結(jié)果相似。在本研究中，枯草芽孢桿菌復合微生物制劑可以顯著提高肉雞的體質(zhì)量和日增重，同時感染CP 7 d 后Prob1 組肉雞體質(zhì)量顯著高于Prob2 組，添加以枯草芽孢桿菌為主要成分的微生物制劑可以明顯改善患有NE 雞群的生長性能，這與胡均等［10］報道的結(jié)果類似，可能是微生物制劑可以調(diào)節(jié)腸道pH 值而抑制病原體的生長。

小腸是機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，絨毛（VL）越長、隱窩（CD）越淺、VL/CD 值越大，代表小腸吸收能力越強［11］。連麗娜等［12］研究發(fā)現(xiàn)復合益生菌制劑可以顯著提高腸道絨毛長度和絨隱比，促進絨毛生長。本試驗中NE 組肉雞腸絨毛變短并且絨毛長度與隱窩深度的比值降低，通過在日糧中添加枯草芽孢桿菌復合微生物制劑可以提高肉雞的絨毛長度、絨隱比且Prob1 組肉雞腸絨毛長度要高于Prob2 組。

CLDN、ZO 是緊密連接蛋白，緊密連接蛋白對維持腸道屏障功能至關重要，具有調(diào)節(jié)免疫、轉(zhuǎn)運物質(zhì)、防止病原體入侵等作用［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，NE組空腸絨毛頂端黏膜上皮可見變性壞死、脫落入管腔，表明腸上皮細胞緊密連接受損，同時緊密連接蛋白基因表達量下降也印證了這一點。本研究使用枯草芽孢桿菌復合微生物制劑使空腸組織CLDN1、ZO-1、ZO-2 基因表達量有所升高，提高了腸道黏膜屏障的防御能力。

MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，而SOD 是一種抗氧化物酶，高活性SOD 可以清除氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化的發(fā)生［15］。有研究通過飼喂重組枯草芽孢桿菌制劑提高肉雞的SOD 活性、降低MDA 含量來提高機體的抗氧化能力［16］；而聯(lián)合添加益生菌和酶制劑也可以減少腸道脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，顯著降低腸道MDA 含量，同時提高SOD 活性［17］。同時，有文獻報道香芹酚、百里香酚、肉桂醛等精油具有抗氧化作用［18］。因此本研究設計中Prob1 組將枯草芽孢桿菌和植物精油同時添加。結(jié)果表明CP 可引起肉雞腸道內(nèi)SOD 活性和總抗氧化能力T-AOC 活性降低，MDA 含量升高；Prob1 組、Prob2 組肉雞空腸黏膜TSOD活性高于NE 組，MDA 含量均低于NE 組。說明在日糧中添加枯草芽孢桿菌復合微生物制劑可以提高肉雞的抗氧化能力，Prob1 組肉雞抗氧化能力要高于Prob2 組可能是因為枯草芽孢桿菌和植物精油的協(xié)同作用。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是廣泛分布于機體組織器官的單磷脂水解酶，主要分為組織非特異性和組織特異性AKP，如腸堿性磷酸酶（intestinalalkaline phosphatase，IAP）［19］。IAP 過表達可以提高腸道緊密連接蛋白基因ZO-1、ZO-2 表達量，調(diào)節(jié)腸道屏障功能［20］。本試驗中，感染CP 后腸道黏膜AKP 活性降低，Prob1、Prob2 組空腸黏膜的AKP活性升高，說明枯草芽孢桿菌復合微生物制劑可能通過提高空腸的AKP 活性從而調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白基因表達量。

綜上，日糧添加枯草芽孢桿菌復合微生物制劑可以促進肉雞生長、改善腸道形態(tài)、提高腸道緊密連接蛋白基因表達和機體抗氧化能力，其中枯草芽孢桿菌復合微生物制劑1 的預防效果更好。

（責任編輯：邊書京）