二氫楊梅素對(duì)鐵過載導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

［摘要］ 目的

探討二氫楊梅素（DMY）對(duì)枸櫞酸鐵銨（FAC）導(dǎo)致的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

方法 取出生24 h SD乳鼠的原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，使用CCK-8法檢測(cè)不同濃度DMY處理后的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的活性，確定DMY給藥濃度。將原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為對(duì)照組（H組）、100 mmol/L濃度的DMY處理組（I組）、250 mmol/L濃度的FAC處理組（J組）、100 mmol/L濃度的DMY與250 mmol/L濃度的FAC共處理組（K組），使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中活性氧（ROS）的含量，使用比色法檢測(cè)各組細(xì)胞中丙二醛（MDA）的含量，采用Western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中的NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）和谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，在DMY濃度為100 mmol/L時(shí)，原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的存活率最高（F=9.95，Plt;0.05），故以該濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與H組相比，J組細(xì)胞中ROS和MDA含量明顯升高（F=176.81、5 523.35，Plt;0.05）；與J組相比，K組細(xì)胞中ROS含量和MDA含量明顯降低（F=18.21、412.96，Plt;0.05）。與H組相比，J組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（F=27.35～81.32，Plt;0.05）；與J組相比，K組細(xì)胞中的Nrf2、HO-1、GPX4蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（F=8.74～21.46，Plt;0.05）。

結(jié)論 DMY可以緩解鐵過載導(dǎo)致的原代海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能與其激活了原代海馬神經(jīng)元中的Nrf2-HO-1/GPX4通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 二氫楊梅素；鐵超負(fù)荷；海馬；神經(jīng)元；氧化性應(yīng)激；NF-E2相關(guān)因子2；血紅素加氧酶-1；谷胱甘肽過氧化酶

［中圖分類號(hào)］ R284；R589.9；R349.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

Protective effect of dihydromyricetin against hippocampal neuronal injury caused by iron overload and its mechanism

SUI Yunjie， MA Zegang

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the protective effect of dihydromyricetin （DMY） against injury of primary hip-

pocampal neurons caused by ferric ammonium citrate （FAC） and its mechanism.

Methods Primary hippocampal neurons were collected from 24-hour neonatal Sprague-Dawley rats for in vitro culture， and CCK-8 assay was used to measure the viability of primary hippocampal neurons treated with different concentrations of DMY and determine the administration concentration of DMY. Primary hippocampal neurons were divided into control group （H group）， 100 mmol/L DMY treatment group （I group）， 250 mmol/L FAC treatment group （J group）， and 100 mmol/L DMY+250 mmol/L FAC treatment group （K group）. Flow cytometry was used to measure the content of reactive oxygen species （ROS） in each group; colorimetry was used to measure the content of malondialdehyde （MDA） in each group; Western blot was used to measure the protein expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， and glutathione peroxidase 4 （GPX4） in each group.

Results

CCK-8 assay showed the highest viability of primary hippocampal neurons at the concentration of 100 mmol/L for DMY （F=9.95，Plt;0.05）， and therefore， this concentration was used for subsequent experiments. Compared with the H group， the J group had significant increases in the content of ROS and MDA （F=176.81，5 523.35，Plt;0.05）， and compared with the J group， the K group had significant reductions in the content of ROS and MDA （F=18.21，412.96，Plt;0.05）. Compared with the H group， the J group had significant reductions in the relative protein expression levels of Nrf2， HO-1， and GPX4 （F=27.35-81.32，Plt;0.05）， and compared with the J group， the K group had significant increases in the relative protein expression levels of Nrf2， HO-1， and GPX4 （F=8.74-21.46，Plt;0.05）.

Conclusion DMY can alleviate oxidative stress damage in primary hippocampal neurons due to iron overload， possibly by activating the Nrf2-HO-1/GPX 4 pathway in primary hippocampal neurons.

［KEY WORDS］ Dihydromyricetin; Iron overload; Hippocampus; Neurons; Oxidative stress; NF-E2-related factor 2; Heme oxygenase-1; Glutathione peroxidase

鐵是人體必需的微量元素，但過量的鐵會(huì)引起鐵過載，從而導(dǎo)致不良反應(yīng)［1］。隨著年齡的增長(zhǎng)或不良飲食習(xí)慣等多種原因，鐵過載會(huì)發(fā)生在人體多個(gè)器官中，大腦中的海馬體是鐵過載的高發(fā)區(qū)域之一，鐵過載會(huì)引起海馬神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)癲癇、記憶衰退等，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)鸢柶澓ＤY（Alzheimer’s disease，AD）等一系列神經(jīng)退行性疾?。?-2］。目前臨床治療鐵過載的方法主要有鐵螯合劑藥物治療或放血治療。鐵螯合劑藥物治療會(huì)使人體產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，如嘔吐、腹瀉、關(guān)節(jié)疼痛等，放血治療適用對(duì)象有限，僅適用于非貧血患者［3］，因此尋找安全且有效的治療手段是臨床治療鐵過載的迫切需要。大量研究表明，姜黃素、大黃素等天然物質(zhì)可以有效抑制鐵過載造成的細(xì)胞損傷，維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)［4-5］，其他植物來源的天然黃酮類化合物是否有類似的作用還有待驗(yàn)證。

江西盛產(chǎn)的藤茶在我國(guó)藥用歷史悠久，其提取物二氫楊梅素（DMY）可以緩解包括帕金森綜合征（PD）和AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的癥狀［6］。然而關(guān)于DMY對(duì)鐵過載導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷是否具有保護(hù)作用尚不明確。本研究通過枸櫞酸鐵銨（FAC）構(gòu)建SD大鼠原代海馬神經(jīng)元鐵過載模型，觀察DMY對(duì)鐵過載致乳鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

出生24 h的健康SD乳鼠，體質(zhì)量為3～6 g，總共60只，全部購買于青島大任富城畜牧有限公司。DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國(guó)Hyclone公司，青鏈霉素混合液購買于蘇州新賽美生物科技有限公司，CCK-8、B27無血清添加劑購自美國(guó)Gibco公司，DMY購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F(xiàn)AC、二甲基亞砜（DMSO）、多聚賴氨酸購買于美國(guó)Sigma公司，兔抗NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）、兔抗血紅素加氧酶-1（HO-1）、兔抗谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）、兔抗β-actin及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自杭州華安生物有限公司，三色預(yù)染蛋白Marker購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購買于安徽白鯊生物科技有限公司，SDS聚丙烯酰胺凝膠、ECL發(fā)光液購買于武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司，丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng) 取出生24 h SD乳鼠共10只，置于液氮中急凍5 s使其休克。隨后使用體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇溶液浸泡消毒后，浸入預(yù)冷的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，完整地取出乳鼠全腦，分離出左右腦的海馬體并除去脈絡(luò)叢。剪碎10只小鼠的海馬體，置于胰蛋白酶中消化5 min，加入含體積分?jǐn)?shù)0.1的FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基中終止消化。吹散組織，用70 μm網(wǎng)篩過濾后收集于離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞密度為7×108個(gè)/L，置于混合培養(yǎng)液（DMEM/F-12培養(yǎng)基中加入含體積分?jǐn)?shù)0.02的B27無血清添加劑和體積分?jǐn)?shù)0.01的青霉素-鏈霉素）中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d進(jìn)行一次半換液。7 d之后通過顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞體豐滿，光暈明顯，突起增粗、變長(zhǎng)，并連接成錯(cuò)綜復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，提示細(xì)胞成熟，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，每次取10小鼠。

1.2.2 藥物配置 將DMY溶于DMSO中，配置濃度為10 mol/L的儲(chǔ)存液。FAC置于DMEM/F-12培養(yǎng)基中，配置濃度為10 mol/L的培養(yǎng)液。后續(xù)使用時(shí)再分別將DMY與FAC稀釋成所需濃度。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選DMY的適宜濃度 將濃度為10 mol/L的FAC稀釋至250 mmol/L，并將濃度為10 mol/L的DMY稀釋為0.1、1、10、100及200 mmol/L。將成熟的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約5 000個(gè)，分為A～G組。A組細(xì)胞在混合培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，B組細(xì)胞在混合培養(yǎng)液中加入250 mmol/L濃度FAC培養(yǎng)24 h，C～G組細(xì)胞混合培養(yǎng)液中分別加入250 mmol/L濃度的FAC和0.1、1、10、100、200 mmol/L濃度的DMY，培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)液以后，每孔加入200 μL 的CCK-8混合工作液（混合培養(yǎng)液與CCK-8工作液的比例為91），在培養(yǎng)箱中孵育2 h。將酶標(biāo)儀的發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為450 nm，使用雙蒸水調(diào)零，檢測(cè)每孔中CCK-8工作液的吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（各組細(xì)胞的吸光度值/A組細(xì)胞的吸光度值）×100%。根據(jù)各組的細(xì)胞存活率，選擇最適宜的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞分組和處理 將成熟原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約80 000個(gè)，分為H～K組。H組細(xì)胞在混合培養(yǎng)液之中培養(yǎng)24 h，I～K組細(xì)胞分別于混合培養(yǎng)液之中加入100 mmol/L濃度DMY、250 mmol/L濃度FAC、100 mmol/L濃度DMY+250 mmol/L濃度FAC，培養(yǎng)24 h。

1.2.5 細(xì)胞中ROS水平的檢測(cè) 將6孔板中培養(yǎng)24 h的H～K組細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液，使用PBS清洗3次，每孔加入1 mL含10 mmol/L DCFH-DA的PBS，移至培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，吸去原培養(yǎng)液，再以PBS清洗3次后，每孔中加入1 mL PBS制成細(xì)胞懸液，以200目網(wǎng)篩過濾后，置于流式試管中渦旋振蕩，充分混合均勻。將流式細(xì)胞儀的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為529 nm，設(shè)置檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量為10 000個(gè)，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的ROS水平。先將H組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度設(shè)置為25%，隨后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)I～K組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度，以此計(jì)算各組細(xì)胞的ROS水平。

1.2.6 細(xì)胞中MDA水平的檢測(cè) 將6孔板中培養(yǎng)24 h的H～K組細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液，使用PBS清洗3次，每孔中加入300 μL提取液制成細(xì)胞懸液，移至EP管中，使用超聲破碎儀（功率200 W）進(jìn)行破碎，重復(fù)30次，每次時(shí)長(zhǎng)3 s，兩次破碎間隔10 s。然后4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL置于另一EP管中，加入100 μL檢測(cè)液。以100 μL蒸餾水＋100 μL檢測(cè)液為空白組。將空白組和各樣本組均100 ℃加熱60 min，冰上冷卻后，常溫10 000 r/min離心10 min，取上清液，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)532 nm和600 nm處的吸光度（A）值，并采用相關(guān)的公式計(jì)算各組細(xì)胞當(dāng)中MDA的含量。MDA含量（nmol/107 cell）=107.5×△A，其中△A=（A532測(cè)定－A532空白）－（A600測(cè)定－A600空白）。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的含量 取H～K組培養(yǎng)24 h的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，使用RIPA裂解液將細(xì)胞充分裂解后，收集裂解液，然后4 ℃下12 000 r/min離心30 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/4體積的5×loading buffer，充分振蕩混勻，煮沸10 min，收集蛋白樣本。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用體積分?jǐn)?shù)0.05的脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，一抗4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下與膜孵育1 h，洗膜，隨后在暗室中曝光顯影。利用Image J軟件分析蛋白灰度值，并以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 27.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x-±s表示。細(xì)胞存活率的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較使用Turkey法。不同分組間比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 不同濃度DMY對(duì)FAC處理的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

A～G組原代細(xì)胞的存活率分別為（90.59±31.56）%、（37.06±9.99）%、（40.02±12.47）%、（59.62±25.20）%、（63.43±20.91）%、（67.78±22.89）%、（46.68±17.74）%。單因素方差分析的結(jié)果顯示，各組比較差異具有顯著意義（F=9.95，Plt;0.05），其中F組的細(xì)胞存活率顯著高于B組（Plt;0.05）。各實(shí)驗(yàn)組中F組原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞存活率最高，以該濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 DMY對(duì)FAC處理的原代海馬神經(jīng)元ROS水平的影響

H～K組的ROS陽性細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的比例分別為（24.78±2.16）%、（23.17±4.23）%、（65.03±4.32）%、（43.86±9.03）%。2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AC、DMY及DMY與FAC的交互作用均對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量差異有顯著影響（FFAC=176.81，F(xiàn)DMY=24.73，F(xiàn)交互=18.21，Plt;0.05）。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，用FAC處理時(shí)，DMY處理與不處理差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.68，Plt;0.05），不用FAC處理時(shí)，DMY處理與不處理差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；用DMY處理時(shí)，F(xiàn)AC處理與不處理差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.77，Plt;0.05），不用DMY處理時(shí)，F(xiàn)AC處理與不處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=154.25，Plt;0.05），DMY可明顯降低FAC導(dǎo)致的ROS積累。

2.3 DMY對(duì)FAC處理的原代海馬神經(jīng)元MDA水平的影響

H～K組神經(jīng)元細(xì)胞當(dāng)中MDA含量分別為（2.08±0.14）、（2.00±0.04）、（6.48±0.07）、（4.51±0.16）nmol/107 cell。2×2析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AC、DMY及DMY與FAC交互作用均對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA的含量均有顯著影響（FFAC=5 523.35，F(xiàn)DMY=484.87，F(xiàn)交互=412.96，Plt;0.05）。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，用FAC處理時(shí)，DMY處理與不處理差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=896.39，Plt;0.05），不用FAC處理時(shí)，DMY處理與不處理差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；用DMY處理時(shí)，F(xiàn)AC處理與不處理差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 457.88，Plt;0.05），不用DMY處理時(shí)，F(xiàn)AC處理與不處理差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4 478.44，Plt;0.05），DMY可明顯降低FAC導(dǎo)致的MDA積累。

2.4 DMY對(duì)FAC處理的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AC對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、GPX4相對(duì)表達(dá)量有顯著影響（FFAC=27.36～81.32，Plt;0.05），DMY對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、GPX4相對(duì)表達(dá)量有顯著影響（FDMY=9.71～15.69，Plt;0.05），DMY與FAC對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、GPX4的相對(duì)表達(dá)量的影響存在交互效應(yīng)（F交互=8.74～21.46，Plt;0.05）。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，用FAC處理時(shí)，DMY處理與不處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.92～30.02，Plt;0.05），不用FAC處理時(shí)，DMY處理與不處理差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；用DMY處理時(shí)，F(xiàn)AC處理與不處理Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.87，9.62，Plt;0.05），不用DMY處理時(shí)，F(xiàn)AC處理與不處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.51～93.16，Plt;0.05），DMY顯著緩解了FAC導(dǎo)致的原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Nrf2、HO-1、GPX4表達(dá)量的降低。見圖1、表1。

3 討" 論

鐵參與了細(xì)胞中許多正常的生理過程，但當(dāng)細(xì)胞中的鐵過多時(shí)，多余的鐵會(huì)通過芬頓反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)［2］。海馬體是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu)之一，具有形成記憶和定位方向的功能［7］。鐵是海馬體發(fā)揮功能所必需的微量元素，但過量鐵會(huì)對(duì)海馬體中的海馬神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性。研究證

實(shí)，鐵過載所致海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激與包括AD在

內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生與惡化有關(guān)［8］。

目前治療鐵過載的方法均存在不同程度的局限性，因此尋找新的治療鐵過載的方法是臨床的迫切需要［3］。隨著近年來對(duì)中藥資源的不斷開發(fā)與利用，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)許多植物來源的天然化合物治療鐵過載效果良好［4-5］。DMY是一種具有天然活性的黃酮類化合物，具有抗氧化特性，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞和機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的多種疾?。?-10］。如研究發(fā)現(xiàn)，DMY可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抑制乙酰膽堿酯酶的活性緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠的認(rèn)知障礙；DMY還可以通過調(diào)節(jié)Akt/GSK-3β通路降低多巴胺能神經(jīng)元的氧化應(yīng)激，緩解PD的癥狀［11-12］。但DMY能否對(duì)鐵過載致海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激產(chǎn)生影響以及相關(guān)機(jī)制尚不明確。

本研究首先使用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度DMY對(duì)FAC處理后的海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明DMY能以濃度依賴的方式緩解鐵過載致海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性的降低，在DMY的濃度為100 mmol/L時(shí)，對(duì)于鐵過載致海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性降低的緩解作用最強(qiáng)，因此選用100 mmol/L DMY進(jìn)行后續(xù)研究。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體會(huì)在短時(shí)間內(nèi)生成大量ROS，過多的ROS會(huì)損傷細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生大量的MDA［13-14］。本研究結(jié)果顯示，鐵過載導(dǎo)致了海馬神經(jīng)元細(xì)胞中ROS水平和MDA含量升高，DMY的處理抑制了鐵過載導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元中ROS水平和MDA含量的升高，提示DMY可能是緩解了鐵過載致海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而減輕了鐵過載對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷。

Nrf2是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的重要因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)，Nrf2可直接影響細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶和體內(nèi)一系列與抗氧化有關(guān)的因子，維持機(jī)體氧化平衡［15-17］。HO-1在血紅素代謝中至關(guān)重要，可將血紅素分解成膽綠素，并且參與細(xì)胞中的鐵代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)［18-19］。GPX4具有清除膜脂過氧化氫產(chǎn)物、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和預(yù)防氧化應(yīng)激的能力，是細(xì)胞中參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子［20-22］。細(xì)胞中的Nrf2-HO-1/GPX4通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，Nrf2是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的主要調(diào)控因子，在介導(dǎo)鐵代謝、脂質(zhì)代謝和谷胱甘肽合成方面也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，HO-1和GPX4均受到Nrf2的調(diào)控［23-25］。有證據(jù)表明，Nrf2-HO-1/GPX4通路廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)正常運(yùn)行具有重要意義，如激活Nrf2-HO-1/GPX4通路可促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，維持神經(jīng)元形態(tài)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及鐵死亡致神經(jīng)系統(tǒng)疾病［26-29］。為進(jìn)一步明確DMY對(duì)鐵過載致海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響，本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了H～K組細(xì)胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，F(xiàn)AC的處理顯著降低了海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表達(dá)量，而DMY抑制了鐵過載導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元中Nrf2以及HO-1、GPX4表達(dá)量的降低。本研究結(jié)果提示DMY可緩解鐵過載致原代海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激，其機(jī)制可能是DMY激活了海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的Nrf2-HO-1/GPX4通路。

本研究結(jié)果顯示，J組細(xì)胞中的Nrf2和HO-1的相對(duì)表達(dá)量與H組相比顯著降低，這表明在海馬神經(jīng)元細(xì)胞中，鐵過載會(huì)抑制Nrf2和HO-1的表達(dá)。有研究顯示，小鼠體內(nèi)發(fā)生鐵過載會(huì)激活肝細(xì)胞中Nrf2和HO-1的表達(dá)［30］。分析兩項(xiàng)研究不一致的原因，可能與海馬神經(jīng)元細(xì)胞與肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能不同有關(guān)，但具體原因還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，天然活性物質(zhì)DMY可通過抑制鐵過載致海馬神經(jīng)元細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕鐵過載對(duì)原代海馬神經(jīng)元的損傷，其機(jī)制可能與激活了海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的Nrf2-HO-1/GPX4通路有關(guān)。本研究為DMY治療海馬體鐵過載的研究提供了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)支持，但是否在動(dòng)物或人體內(nèi)也具有同樣的作用，還有待進(jìn)一步深入探討。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QDU-AEC-2024451）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照科技部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的條例進(jìn)行。

作者聲明：所有作者均參與了研究的設(shè)計(jì)、論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）