順鉑聯(lián)合衣霉素對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抑制作用及其機制

［摘要］ 目的

探究順鉑（DDP）聯(lián)合衣霉素（TM）對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞的抑制作用及其機制。

方法 將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞分為對照組、TM組（0.4 mg/L TM處理24 h）、DDP組（4 mg/L DDP處理24 h）和DDP+TM組（0.4 mg/L TM+4 mg/L DDP共處理24 h）。采用CCK-8實驗、平板克隆實驗、劃痕實驗、Transwell實驗分別檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖能力、遷移能力和侵襲能力，采用免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中JAK2-STAT3-HIF1α通路相關(guān)蛋白JAK-2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和HIF1α的表達水平。

結(jié)果 實驗結(jié)果顯示，DDP+TM組兩種細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖能力、侵襲能力、第12及24小時時的遷移能力及JAK2-STAT3-HIF1α通路各蛋白表達水平均顯著低于其他三組（tLSD=2.14～78.95，P＜0.05）。

結(jié)論 DDP聯(lián)合TM可通過JAK2-STAT3-HIF1α通路抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖和遷移，該結(jié)果為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供了新思路。

［關(guān)鍵詞］ 神經(jīng)母細(xì)胞瘤；順鉑；衣霉素；Janus激酶2；STAT3轉(zhuǎn)錄因子；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；細(xì)胞運動；細(xì)胞增殖

［中圖分類號］ R730.264

［文獻標(biāo)志碼］ A

The inhibitory effect of cisplatin combined with tunicamycin on neuroblastoma and related mechanism

ZHANG Tenglong， SUN Wenjing， SONG Junying， HOU Lin

（Department of Biochemistry and Molecular Biology， College of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the inhibitory effect of cisplatin （DDP） combined with tunicamycin （TM） on human neuroblastoma SH-SY5Y and SK-N-SH cells and related mechanism.

Methods Human neuroblastoma SH-SY5Y and SK-N-SH cells were divided into control group， TM group （treated with 0.4 mg/L TM for 24 h）， DDP group （treated with 4 mg/L DDP for 24 h）， and DDP+TM group （treated with 0.4 mg/L TM and 4 mg/L DDP for 24 h）. CCK-8 assay， plate colony formation assay， scratch assay， and Transwell assay were used to measure the viability and proliferation， migration， and invasion abilities of cells in each group， and Western blotting was used to measure the expression levels of the JAK2-STAT3-HIF1α pathway-related proteins such as JAK-2， p-JAK2， STAT3， p-STAT3， and HIF1α in each group of cells.

Results Experimental results showed that compared with the other three groups， the DDP+TM group had significantly lower viability， proliferation and invasion abilities， migration ability at 12 and 24 h， and expression levels of the JAK2-STAT3-HIF1α pathway-related proteins （tLSD=2.14-78.95，Plt;0.05）.

Conclusion DDP combined with TM can inhibit the proliferation and migration of neuroblastoma via the JAK2-STAT3-HIF1α pathway， which provides new ideas for the treatment of neuroblastoma.

［KEY WORDS］ Neuroblastoma; Cisplatin; Tunicamycin; Janus kinase 2; STAT3 transcription factor; Hypoxia-inducible factor 1， alpha subunit; Cell movement; Cell proliferation

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最為常見的外周神經(jīng)系統(tǒng)實體腫瘤，該病發(fā)病率占兒童惡性腫瘤的8%～10%，嚴(yán)重危害兒童健康［1-2］。順鉑（DDP）目前被普遍用于NB患者的治療，但其過多使用也會造成腫瘤細(xì)胞耐藥及胃、肝、腎、耳等器官損傷［3-6］。尋找新型藥物與DDP聯(lián)合使用以減少DDP毒副作用，并克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，對于提高NB的治療效果尤為重要［7］。衣霉素（TM）對NB有抗癌活性［8-12］。已有研究表明在肝癌、肺癌及頭頸癌中，TM可提高腫瘤細(xì)胞對DDP的敏感性，但其是否對NB有相同作用目前尚不清楚［13-15］。酪氨酸激酶2（JAK2）-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）-缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）通路作為腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵信號通路促進腫瘤的增殖和侵襲遷移［16-18］。本研究探究DDP聯(lián)合TM對人NB細(xì)胞的抑制作用及其機制，旨在為NB患者的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人NB細(xì)胞系SH-SY5Y、SK-N-SH細(xì)胞（貼壁細(xì)胞）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DDP、TM購自上海生工生物工程股份有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購買于上海雅酶生物科技有限公司，β-actin、JAK-2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和HIF1α抗體購自英國Abcam公司，CCK-8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，胰酶及0.1%的結(jié)晶紫溶液購自武漢塞維爾生物科技有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自上海翌圣生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組

將SH-SY5Y、SK-N-SH細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.1的胎牛血清以及1%青霉素/1%鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。分別將1 mg DDP粉末及1 mg TM粉末用200 μL DMSO充分溶解，再用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋到4 mg/L，以備后續(xù)分組使用。將SH-SY5Y、SK-N-SH細(xì)胞分別分為對照組（DMEM高糖培養(yǎng)基處理24 h）、DDP組（4 mg/L DDP處理24 h）、TM組（0.4 mg/L TM處理24 h）、DDP+TM組（0.4 mg/L TM和4 mg/L DDP共處理24 h）。

1.3 CCK-8實驗檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活力

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，鋪于96孔板中過夜培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基后按1.2中分組方法處理細(xì)胞。處理結(jié)束以后，在96孔板每孔中直接加入10 μL CCK-8溶液，室溫孵育3 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各組溶液的吸光度（A）值，并且據(jù)此計算各組細(xì)胞的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=1-（A對照-A給藥）/（A對照-A調(diào)零）×100%

1.4 平板克隆實驗檢測各組細(xì)胞增殖能力

使用胰酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，并以1 000 r/min離心，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以獲得單細(xì)胞懸液。取20 μL單細(xì)胞懸液用DMEM培養(yǎng)基稀釋為1×106個/L，每孔200 μL接種于6孔板中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，按1.2中分組方法處理細(xì)胞，處理結(jié)束以后將各組培養(yǎng)基更換為不含藥的DMEM培養(yǎng)基，隨后放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2周。棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗2次，隨后4%多聚甲醛固定細(xì)胞并使用0.1%結(jié)晶紫溶液染色后，用自來水將結(jié)晶紫溶液沖洗干凈，室溫放置干燥。對各組細(xì)胞拍照并用Image J軟件分析圖片，得到各組克隆細(xì)胞數(shù)，以克隆形成率代表細(xì)胞增殖能力。克隆形成率=（克隆細(xì)胞數(shù)÷接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度＞95%時，用200 μL移液槍槍頭垂直于6孔板劃痕，用PBS洗2次后，隨后按1.2各組步驟處理細(xì)胞。后在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)各組細(xì)胞，分別在培養(yǎng)第0、12、24小時于同一視野拍照并測量劃痕面積。細(xì)胞遷移率=（劃痕面積0 h－劃痕面積12 h/24 h）/劃痕面積0 h×100%。

1.6 Transwell實驗檢測各組細(xì)胞侵襲力

將Matrigel基質(zhì)膠提前放入4 ℃冰箱過夜，稀釋后包被Transwell小室底部膜的上室面，室溫風(fēng)干。使用胰酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，再以1 000 r/min離心后，按1.2中分組方法處理細(xì)胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后得到細(xì)胞懸液。在小室中加入細(xì)胞懸液，并將小室放置于24孔板中。在24孔板下室加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，以4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min；

棄掉多聚甲醛后加入2 mL

0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，將結(jié)晶紫溶液沖洗干凈，室溫下放置至干燥以后，顯微鏡拍照并計數(shù)侵襲至小室下層的細(xì)胞。細(xì)胞侵襲率=（侵襲細(xì)胞數(shù)÷接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.7 免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中JAK-2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和HIF1α蛋白表達水平

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，按1.2中分組方法處理細(xì)胞，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白。接著加入電泳緩沖液，然后于100 ℃水中煮沸變性15 min。配制SDS-PAGE電泳所需的分離膠和濃縮膠，在濃縮膠加樣孔中各加入相應(yīng)組別的蛋白進行電泳。電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將電轉(zhuǎn)后的膜用50 g/L的脫脂奶粉浸泡封閉2 h。將膜放在一抗稀釋液（1∶1 000）中室溫孵育3 h，TBST洗膜；將膜放在二抗稀釋液中室溫孵育1 h，TBST洗膜。最后加入ECL發(fā)光液顯影以后，拍照保存圖像。使用Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，以β-actin蛋白作為內(nèi)部參照，計算各組目的蛋白的相對表達量。各組目的蛋白的相對表達量以目的蛋白的條帶灰度值/β-actin蛋白的條帶灰度值表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔，所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果取均值。符合正態(tài)分布的計量資料以x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 各組SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞的細(xì)胞活力比較

CCK-8實驗結(jié)果顯示，對照組、DDP組、TM組以及DDP+TM組SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為（100.00±0.67）%、（86.43±0.45）%、（90.21±0.82）%、（75.34±0.53）%，DDP+TM組細(xì)胞的細(xì)

胞活力均顯著性低于其他三組

（F=35.31，tLSD=13.25～

45.89，P＜0.05）；對照組、DDP組、TM組以及DDP+TM組SK-N-SH細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為（100.00±0.45）%、（82.85±0.52）%、（89.56±0.67）%、（66.23±0.41）%，DDP+TM組細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著性低于其他三組細(xì)胞（F=63.25，tLSD=11.67～31.33，P＜0.05）。

2.2 各組SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞克隆形成率比較

平板克隆實驗結(jié)果顯示，對照組、DDP組、TM組、DDP+TM組SH-SY5Y細(xì)胞克隆形成率分別為（73.68±2.12）%、（67.25±3.21）%、（60.43±1.78）%、（43.67±2.53）%，DDP+TM組的細(xì)胞克隆形成率顯著低于其他三組（F=63.84，tLSD=12.21～24.23，P＜0.05）；對照組、DDP組、TM組及DDP+TM組SK-N-SH細(xì)胞克隆形成率分別為

（78.98±3.12）%、（63.47±1.83）%、（71.23±2.44）%、

（50.43±1.34）%，DDP+TM組的細(xì)胞克隆形成率顯著性低于其他三組（F=42.23，tLSD=21.34～35.21，P＜0.05）。見圖1。

2.3 各組SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞的細(xì)胞遷移率比較

重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，時間、組別及其交互作用對SH-SY5Y細(xì)胞的遷移率均有顯著影響（F時間=352.68，F(xiàn)組別=234.57，F(xiàn)交互=148.12，P＜0.05）；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，第12、24小時時DDP+TM組細(xì)胞遷移率均顯著性低于其他三組（F組間=121.23、134.85，tLSD=2.14～55.23，P＜0.05）。時間、組別及其交互作用對SK-N-SH細(xì)胞的遷移率均有顯著影響（F時間=456.65，F(xiàn)組別=176.45，F(xiàn)交互=53.52，P＜0.05）；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，第12、24小時時DDP+TM組細(xì)胞遷移率均顯著低于其他三組（F組間=236.38、634.23，tLSD=13.75～76.32，P＜0.05）。見表1、圖2。

2.4 各組SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞的細(xì)胞侵襲率比較

Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組、DDP組、TM組以及DDP+TM組SH-SY5Y細(xì)胞侵襲率分別為（78.23±1.12）%、（65.45±1.03）%、（70.54±1.35）%、（55.67±1.21）%，DDP+TM組細(xì)胞侵襲率顯著低于其他三組（F=723.41，tLSD=11.09～33.23，P＜0.05）；對照組、DDP組、TM組、DDP+TM組SK-N-SH細(xì)胞的侵襲率分別為（81.23±1.08）%、（73.17±1.23）%、（78.78±1.12）%以及（52.43±1.08）%，DDP+TM組細(xì)胞侵襲率顯著低于其他三組（F=625.46，tLSD=13.23～32.12，P＜0.05）。見圖3。

2.5 各組SH-SY5Y以及SK-N-SH細(xì)胞中JAK2-STAT3-HIF1α通路相關(guān)蛋白表達水平比較

DDP+TM組SH-SY5Y細(xì)胞JAK-2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、HIF1α蛋白水平均顯著低于其他三組（F=523.40～657.80，tLSD=14.25～78.95，P＜0.05）；DDP+TM組SK-N-SH細(xì)胞JAK-2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、HIF1α蛋白水平均顯著低于其他三組（F=356.78～523.81，tLSD=18.09～56.43，P＜0.05）。見圖4、表2。

3 討" 論

NB是一種由未成熟神經(jīng)細(xì)胞形成的腫瘤，最常見于幼兒。通常起始于腎上腺，但也可形成于頸部、胸部、腹部和脊柱。NB的臨床特征主要是其異質(zhì)性，根據(jù)診斷年齡、腫瘤組織學(xué)類型、MYCN基因等指標(biāo)的情況，NB可以分為低危組、中危組和高危組［19］。目前對于高危組NB的治療有多種方式，如手術(shù)治療、化療、放療、干細(xì)胞移植、靶向治療、免疫治療等，但是鑒于高危組NB本身的復(fù)雜性，及其在治療過程中產(chǎn)生的耐藥性和化療抵抗性，即便綜合各種強化治療方案，高危組NB患者的預(yù)后仍不理想，治愈率僅為30%左右［20］。因此，其治療選擇是臨床醫(yī)生面臨的一個相當(dāng)棘手的問題。

DDP是含有氯基和氨基的第一代鉑類化療藥物，普遍用于NB患者的治療，但DDP的過度使用會造成腫瘤細(xì)胞對其耐藥，同時高劑量DDP的使用也會損傷患者的胃、肝、腎、耳等器官，因此DDP的臨床應(yīng)用被極大地限制，如何減少DDP的臨床用量以減輕其毒副作用和提高腫瘤細(xì)胞對DDP的敏感性成為目前臨床研究重點［21-22］。TM是一種通過抑制N-連接的糖基化從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的天然抗生素，能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇、多柔比星、曲妥珠單抗等多種藥物的耐藥性［23］。DDP和TM在肝癌、肺癌、鼻咽癌等多種腫瘤的聯(lián)合治療中的作用已有報道，但在NB治療中的作用還未見研究報道。本研究利用人NB細(xì)胞系SH-SY5Y和SK-N-SH細(xì)胞探究DDP聯(lián)合TM對NB的治療效果及其作用機制。

本項研究中，CCK-8實驗檢測DDP聯(lián)合TM對于人SH-SY5Y以及SK-N-SH細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明DDP聯(lián)合TM顯著抑制了SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞活力；平板克隆實驗結(jié)果表明，DDP、TM兩藥聯(lián)合處理可使SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制；劃痕實驗結(jié)果表明，兩藥聯(lián)合處理使SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞遷移能力受到抑制；Transwell實驗結(jié)果則表明，DDP聯(lián)合TM可使SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞侵襲能力受到抑制。

JAK2-STAT3-HIF1α通路與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［24］。有研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，JAK2磷酸化激活STAT3，而STAT3則能夠與HIF1α相互作用，抑制HIF1α蛋白的泛素化降解，最終促進腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。JAK2-STAT3-HIF1α通路已經(jīng)成為抑制多種腫瘤生長和遷移侵襲的重要靶點［25］。為了進一步探究DDP聯(lián)合TM抑制NB進展的具體機制，本研究通過使用免疫印跡法檢測SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞中JAK2-STAT3-HIF1α通路相關(guān)蛋白的表達，實驗結(jié)果顯示DDP聯(lián)合TM處理可使SH-SY5Y及SK-N-SH細(xì)胞中JAK-2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和HIF1α的蛋白表達水平顯著下降，表明細(xì)胞中JAK2-STAT3-HIF1α通路被抑制。以往研究僅發(fā)現(xiàn)DDP聯(lián)合TM能夠通過增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而本研究首次發(fā)現(xiàn)DDP聯(lián)合TM能夠通過抑制JAK2-STAT3-HIF1α通路減緩NB進展，這也表明兩藥聯(lián)合可多靶點作用于NB細(xì)胞，從而協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。但是DDP聯(lián)合TM抑制JAK2-STAT3-HIF1α通路的具體調(diào)控機制，以及該機制是否與TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，這些問題仍有待今后更加深入的研究。

綜上所述，本研究證明DDP聯(lián)合TM可以通過JAK2-STAT3-HIF1α通路抑制人NB細(xì)胞系的SH-SY5Y和SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。兩藥聯(lián)用有希望提高NB治療有效率，降低DDP對于NB患者的毒副作用，從而為NB的臨床治療提供新策略。

作者聲明：張騰龍、孫文靜、宋軍瑩參與了研究設(shè)計；張騰龍、侯琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）