生物質(zhì)譜技術(shù)在腺相關(guān)病毒（AAV）載體制劑質(zhì)量控制中的應(yīng)用

李孟效，李惠琳

（中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006）

1 腺相關(guān)病毒(AAV)概述

基因治療是指為了治療目的而修改操縱基因表達(dá)或改變活細(xì)胞的基因，基因治療的方式可以劃分基因補(bǔ)充和基因編輯，基因補(bǔ)充是指將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入需要治療的靶細(xì)胞，基因編輯是指對細(xì)胞已有的缺陷基因進(jìn)行修改和調(diào)控，但無論哪種方式都需要依賴特定的遞送載體才能完成[1]。常用的基因治療載體可以分為病毒載體和非病毒載體，而非病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效力遠(yuǎn)低于病毒載體，尤其是在體內(nèi)[2-3]。病毒載體利用了病毒可以感染細(xì)胞的特性，其主要功能是保護(hù)被包裹的RNA 或DNA 和參與細(xì)胞定位和販運(yùn)。臨床前和臨床研究中常用的病毒載體包括腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、慢病毒和腺病毒[4-5]。其中，由于AAV 的非整合性和低免疫原性，能夠感染分裂期和非分裂期的細(xì)胞，在人體中的風(fēng)險較低，且在多種靶器官和靶細(xì)胞中可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此得到了較多研究[6-7]。

AAV 是一種非包膜單鏈DNA 病毒，屬于細(xì)小病毒科的細(xì)小病毒屬。AAV 需要輔助病毒（例如：腺病毒和皰疹病毒）的共同感染才能復(fù)制，因此其致病性較低[8]。AAV 在自然界中有許多野生類型，目前已分離到13 種血清型：AAV1～ AAV13，并被劃分為6個進(jìn)化枝：A ～ F（圖1）。不同的血清型之間的同源性的程度不同（57% ～ 99%），其氨基酸序列的差異導(dǎo)致了不同的組織趨向性、受體親和性和免疫原性，這會影響最終的轉(zhuǎn)導(dǎo)功效[9-10]。

Figure1 Types of adeno-associated virus （AAV） serotypes[8] (A) and clades of adeno-associated virus serotypes[10] (B)

野生型的AAV基因大小約為4 700 bp，AAV基因組主要由反向重復(fù)序列(inverted terminal repeats,ITRs）和2 個ITR 之間的2 個開放閱讀框(open reading frame, ORF)組成，左側(cè)的為編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的Rep 閱讀框，右側(cè)的為編碼結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3）的Cap閱讀框編碼，這3種基因的主要功能是完成AAV 的復(fù)制與組裝[8]。Rep 基因編碼Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40蛋白，兩種較大的Rep蛋白Rep78 和Rep68 主要參與基因組的復(fù)制，而兩個較小的Rep 蛋白Rep52 和Rep40 在病毒粒子的包衣中起重要作用[3]。其中ITRs 對于AAV 的組裝是必須的，因此在保留AAV 兩端ITRs 的前提下，可以利用基因工程的方式用目的基因替換Rep 和Cap基因，只保留Rep 和Cap 蛋白的反式作用元件，重組的AAV 病毒粒子就能成功組裝[11-12]。此外，在Cap 基因中還包含了一段與AAV 組裝相關(guān)的AAP（組裝激活蛋白）基因，由嵌入Cap基因內(nèi)的重疊閱讀框的非規(guī)范CTG 起始密碼子表達(dá)[13]。對于AAV2，在 AAP 中引入終止密碼子而不影響VP2/3的編碼可防止衣殼組裝和病毒/載體的產(chǎn)生。雖然衣殼組裝可以通過提供反式AAP 來恢復(fù)，但野生型（wt）AAP的過表達(dá)不會增加載體產(chǎn)量，這都說明AAP 的表達(dá)是完成最大滴度病毒組裝的重要條件之一[14]。不過新的研究發(fā)現(xiàn)，某些AAV 的血清型（AAV3、AAV9）不需要全長的AAP 基因來組裝病毒顆粒[15]。此外AAP 也被證明與AAV 的核仁定位、VP的穩(wěn)定性有關(guān)[14-15]。

Ogden 等[16]在建立AAV2 Cap 閱讀框的單密碼子突變病毒庫的過程中發(fā)現(xiàn)了嵌套在VP1 獨(dú)特結(jié)構(gòu)域中的一個ORF，編碼一種新的病毒蛋白。蛋白質(zhì)與綠色熒光蛋白（GFP）或Flag-tag 的C 端融合揭示了與細(xì)胞膜的關(guān)聯(lián)，于是作者將其命名為“膜相關(guān)輔助蛋白”（MAAP）。用滅活MAAP產(chǎn)生的重組病毒是可行的，并且產(chǎn)生的滴度與編碼wt-MAAP的AAV 相似。然而，除非MAAP 以反式形式提供，否則MAAP 突變的AAV 編碼wt-Cap 的病毒在表達(dá)水平上會更低。Ogden 和合作者提出MAAP 可能參與不同血清型AAV 基因組之間的競爭性排斥。Galibert 等[17]的研究也證實了上述觀點(diǎn)，并認(rèn)為MAAP 是AAV 感染的加速因素。rAAV 的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程極其復(fù)雜，首先以rAAV2 為例：它通過受體依賴性內(nèi)吞作用在細(xì)胞中攝取，并通過內(nèi)體途徑運(yùn)輸。內(nèi)體中完整的rAAV 經(jīng)歷一系列依賴pH 的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，這對于內(nèi)體逃逸、通過細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)和通過細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸至關(guān)重要。在核內(nèi)體逃逸后，rAAV 通過核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，然后進(jìn)行衣殼脫包，釋放基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)基因[18]。

傳統(tǒng)的rAAV 生產(chǎn)通常涉及“三重轉(zhuǎn)染”方法。三聯(lián)轉(zhuǎn)染組件由一個編碼轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒、一個含有腺病毒5 型(Ad5)輔助基因(即E1a/b、E2a、E4 和VA RNA)或其等同物的輔助質(zhì)粒和另一個編碼rAAV Rep和Cap蛋白的質(zhì)粒組成[7]（圖2）。然而傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法不適合rAAV 大規(guī)模生產(chǎn)，主要是因為轉(zhuǎn)染所用的細(xì)胞系HEK293是貼壁生長的，導(dǎo)致了容器的限制，還有3個質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染本身的操作復(fù)雜性。此外，轉(zhuǎn)染試劑（PEI）也可能會產(chǎn)生毒性[3]。因此后來開發(fā)了替代桿狀病毒表達(dá)載體(BEV)介導(dǎo)的rAAV 生產(chǎn)系統(tǒng)(Bac 系統(tǒng))。高效的BEV 感染比傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有優(yōu)勢，此外，昆蟲Sf9 細(xì)胞比HEK293 細(xì)胞更適合大規(guī)模高密度無血清懸浮培養(yǎng)[12]?，F(xiàn)在基于重組病毒和穩(wěn)定細(xì)胞系的平臺開發(fā)，仍面臨著許多需要改進(jìn)的地方，例如輔助/感染病毒過程都將是rAAV生產(chǎn)的潛在風(fēng)險，并且需要在下游過程中消除輔助/感染病毒，以避免與最終產(chǎn)品相關(guān)的安全問題。此外，在AAV 衣殼生產(chǎn)過程中，AAV 衣殼可能會包封宿主細(xì)胞DNA，如癌癥的基因序列（HeLa 的HPV 序列，HEK293的E1序列）[3]。

Figure2 Schematic diagram of AAV gene structure and rAAV production [3]

在衣殼結(jié)構(gòu)方面，AAV 是由60 個衣殼蛋白(VP)單體排列成五聚亞結(jié)構(gòu)組裝而成的直徑為20～26 nm的二十面體衣殼，每個衣殼含有3個高度同源的VP (VP1、VP2 和VP3)，比例為1∶1∶10，3 種VP 具有相同的C 端，其中VP2(約65 kD)包括VP3(約60 kD)的整個氨基酸序列，是VP3 的N 端延伸，VP1(約80 kD)則是VP2 的N 端延伸[10]。VP1 和VP2的N 端區(qū)域含有AAV 感染所需的元件，如磷脂酶A2(PLA2)結(jié)構(gòu)域、鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核定位信號[10]。細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)的主要特征包括近端3倍突起，其突出程度各不相同，5 倍軸周圍有一個大而淺的凹陷，兩個3 倍突起之間的2 倍軸中心有一個小凹陷[7]（圖3）。3倍區(qū)和2/5倍壁（2倍軸和5倍軸之間突起的區(qū)域）已被確定為許多AAV 血清型的受體結(jié)合位點(diǎn)，并作為細(xì)胞和組織向性的決定因素。細(xì)胞受體包括唾液酸、硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)、末端半乳糖、硫酸N-乙酰乳胺、AAVR、層粘連蛋白、αvβ1 整合素、αvβ5 整合素、肝細(xì)胞生長因子受體、成纖維細(xì)胞生長因子受體和血小板源性生長因子受體。除了受體結(jié)合外，衣殼的表面，包括5 倍區(qū)，顯示了宿主免疫反應(yīng)引起的抗體的抗原位點(diǎn)[10]。

Figure3 Schematic diagram of the 20-hedron structure of parvovirus [7]

目前rAAV 載體在基因治療方面得到了較多的研究和應(yīng)用?；趓AAV 的基因治療藥物Glybera 用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥、Luxturna用于治療遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良癥和Zolgensma用于治療致命性脊髓性肌萎縮癥，分別于2012年、2017 年和2019 年獲批上市[12]。使用腺相關(guān)病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的療法正在快速獲得視網(wǎng)膜疾病、充血性心力衰竭、血友病A 和B、X 連鎖肌管性肌病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤和脊髓性肌萎縮癥、肌肉系統(tǒng)疾?。I養(yǎng)不良癥）、關(guān)節(jié)炎、糖尿病的臨床批準(zhǔn)[8-9]。不過FDA 也召開會議提出了rAAV 載體的可能出現(xiàn)整合性和肝臟毒性的風(fēng)險，以及潛在的致瘤性、血栓性微血管病和神經(jīng)毒性風(fēng)險[2]。此外載體脫落、空衣殼的免疫原性、中和抗體也對AAV載體的質(zhì)量控制提出了更多的要求[9,19]。

2 AAV的關(guān)鍵質(zhì)量屬性

2.1 不同類型衣殼蛋白的比率

據(jù)報道，VP1、VP2 和VP3 的相對表達(dá)水平可以受到生產(chǎn)方法的影響，并可能偏離1∶1∶10 的比例，在某些情況下可能會導(dǎo)致傳染性降低[20-22]。VP1 的N 端含有一個磷脂酶A2 (PLA2)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在病毒的內(nèi)體逃逸中起重要作用[23]。此外，在衣殼VP1 和VP2 的N 端有幾個核定位信號(NLS)被細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制識別，以促進(jìn)核轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。因此VP1比率的降低可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的降低。Arriaga等[21]將AAV3B 的VP1/VP2 分別進(jìn)行了基因敲除，雖然其衣殼能夠組裝，但是感染的效率與野生型AAV 相比顯著降低。Bosma 等[22]對重組AAV5 的Cap 閱讀框中的VP1 的起始密碼子和上下游序列重新編碼和修飾，得到了不同VP 比率的rAAV5，并由此發(fā)現(xiàn)當(dāng)VP1 的比率偏低時其效價出現(xiàn)降低，過高的VP3占比也會使轉(zhuǎn)導(dǎo)效率下降，而11號構(gòu)建體實現(xiàn)了與野生型類似的VP 比率和感染效率。此外，漏掃描導(dǎo)致的VP3 不完整片段也會在生產(chǎn)的過程中產(chǎn)生，VPs的過程或產(chǎn)品相關(guān)降解可能降低載體效力并具有免疫原性風(fēng)險[25-26]。此外，有關(guān)衣殼組裝的隨機(jī)性導(dǎo)致的AAV 異質(zhì)性已被報道，即AAV 不同病毒粒子之間的VP 比率會有波動，1∶1∶10 只是一個總體的平均值，因此對于批次的AAV衣殼比率的檢查是有必要的[27]。

2.2 翻譯后修飾（PTMs）

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是一個或者多個氨基酸殘基在酶的作用下，被修飾上了不同的基團(tuán)，蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)也會因此變化。對于病毒來說，衣殼蛋白的翻譯后修飾可能會改變病毒感染特性和生命周期[28]。病毒蛋白也會因為生產(chǎn)所用的細(xì)胞系不同而產(chǎn)生獨(dú)特的翻譯后修飾。宿主細(xì)胞中病毒蛋白合成過程中的PTMs 是產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能多樣性/復(fù)雜性的重要來源，使病毒能夠適應(yīng)和共同進(jìn)化各種宿主細(xì)胞屏障，如腺病毒、痘苗病毒和多瘤病毒[29]。Mary 等[29]的研究證明AAV1-rh10 存在廣泛的PTMs，包括泛素化、磷酸化、糖基化、乙酰化、SUMO 化。此外，關(guān)于AAV8、AAV9 的脫酰胺修飾也引起了很多的關(guān)注[28]。

而且隨著PTMs 位點(diǎn)的研究不斷開展，各種PTMs對于AAV載體用于基因治療的影響也逐漸被實驗闡明。如磷酸化、脫酰胺化、泛素化和SUMO化，被報道會影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[28-30]。Zhong 等[30]發(fā)現(xiàn)了，衣殼蛋白酪氨酸殘基的磷酸化會對AAV2的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率產(chǎn)生負(fù)面影響，這與AAV 衣殼蛋白后續(xù)的泛素化有關(guān)；Giles 等[28]指出多種血清型的AAV 載體存在Asn 和Gln 的脫酰胺化，并對AAV8 的脫酰胺化的影響做了研究，發(fā)現(xiàn)脫酰胺化后的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率下降，下降的程度與不同的位點(diǎn)有關(guān)，其中N57，N94，N263，N305，Q467，N479 和N653 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率下降為不到原先的10%。Weger 等[31]證明AAV 的Rep 蛋白Rep68 和Rep78 通過SUMO 化過程修飾，有助于其穩(wěn)定性; AAV2 的K544 已經(jīng)被證實為泛素化的一個位點(diǎn)，而在密碼子K544 的目標(biāo)位點(diǎn)從賴氨酸突變?yōu)楣劝彼釋?dǎo)致蛋白體介導(dǎo)的衣殼降解減少，會導(dǎo)致更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[32]?？紤]到K258 是一個SUMO 化的位點(diǎn)，一項研究通過將AAV2-K258位點(diǎn)修飾為AAV2-K258Q，不僅發(fā)現(xiàn)了SUMO化的程度明顯減少，而且AAV2-K258Q 體外轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗在玻璃體注射兩周后的熒光強(qiáng)度相對于野生型可以忽略不計，表明了其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的下降[29]。

2.3 不同的AAV血清型

盡管不同AAV 血清型之間的VP 序列比較相似，但是不同血清型對組織的趨向性有所不同，清除的半衰期也不同，此外引起的免疫反應(yīng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也有差異[9,19]。因此對AAV 血清型鑒定至關(guān)重要。目前已經(jīng)批準(zhǔn)的關(guān)于AAV 載體的基因治療有用于視網(wǎng)膜疾病、充血性心力衰竭、血友病A 和B、X 連鎖肌管性肌病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤和脊髓性肌萎縮。而療效和安全性有賴于對不同的AAV血清型的選擇[9]。

組織傾向性反映了不同血清型和糖基受體之間特定相互作用。例如，AAV1 的α2，3 和α2，6 N-linked 唾液酸(SIA)；HSPG 用于AAV2、AAV3 和AAV13 等[33]。更深層次的原因是，不同血清型之間的結(jié)構(gòu)蛋白的序列在同源性上的差異導(dǎo)致了其對宿主細(xì)胞的表面受體有了不同的親和力。許多AAV 血清型的初始結(jié)合是通過主要受體，包括聚糖和蛋白聚糖，例如，在AAV2 中，由帶正電荷的R585、R588和R487殘基形成的肝素結(jié)合位點(diǎn)使病毒粒子與硫酸肝素蛋白聚糖細(xì)胞表面受體結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[29]。而在NHP 的動物實驗中，有研究報道了AAV 在小鼠肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，以AAV7和AAV8為基礎(chǔ)的載體比以AAV2或AAV5為基礎(chǔ)的載體效率高10～100 倍[9]。AAV2/8 相較于AAV2/2、AAV2/5 和AAV2/9 在小鼠視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性更高[34]。在大鼠DRG 神經(jīng)元中，AAV9的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯高于AAV5、AAV6、AAV8[35]。

AAV 在被機(jī)體清除后仍有活性，且不同血清型清除所需要的時間不同，例如AAV2/8 在2 周后就無法在精液中檢測到，而AAV5 在22 周時仍可以在精液中被檢測到[9,36]。

雖然rAAV 的免疫原性較低，但是目前關(guān)于AAV 導(dǎo)致的免疫反應(yīng)卻時常有報道，據(jù)報道rAAV給藥期間的宿主免疫反應(yīng)限制了人類長期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)與AAV 的血清型有著直接關(guān)聯(lián)[37]。在體液反應(yīng)方面，通過自然感染暴露于野生型AAV 或通過體內(nèi)基因治療暴露于rAAV會導(dǎo)致血清中的中和抗體產(chǎn)生并有效地阻斷靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。自然感染很常見，70%的人類血清含有抗rAAV1 和rAAV2 的抗體，45% 抗rAAV6 和rAAV9的抗體，38%抗rAAV8的抗體[38]。并且抗體已被證明在rAAV 血清型之間發(fā)生交叉反應(yīng)[39]。因此在選擇基因治療所用的AAV 血清型時就需要盡可能地避免交叉反應(yīng)，使用抗體滴度少免疫反應(yīng)更低的治療方案，這就對AAV 血清型的準(zhǔn)確、高效鑒定提出了要求。

2.4 產(chǎn)品中的空殼率

在AAV 載體生產(chǎn)的過程中還會產(chǎn)生未包裹目標(biāo)DNA 的空衣殼病毒顆粒和包裹部分截斷或者非目標(biāo)基因的病毒顆粒，通過透射電子顯微鏡(TEM)可以看到，空衣殼的水平可以在10% ～ 90%之間變化，這可能是由衣殼組裝的隨機(jī)性導(dǎo)致的[40]。不含基因組的AAV 衣殼被視為AAV 載體生產(chǎn)過程中的一個主要副產(chǎn)物[41]。因為空衣殼和那些含有截斷基因或非轉(zhuǎn)基因序列的衣殼會引發(fā)不必要的免疫反應(yīng)，降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和效果[42]。未包裹治療基因的空衣殼會導(dǎo)致所需要的治療劑量增加。研究發(fā)現(xiàn)，隨著載體劑量的增加，觀察到明顯的炎癥毒性，包括補(bǔ)體活化、細(xì)胞減少和嚴(yán)重的肝毒性[19]。據(jù)推測，空AAV 病毒粒子增加衣殼劑量可以增加衣殼抗原在主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類上的呈遞，從而觸發(fā)衣殼特異性CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)[43]。例如，Gao 等[44]合成了部分空的和完全空的AAV8 病毒粒子，完全包裝的rAAV8，以及空的和完全包裝的病毒粒子可變比例的混合物。將上述注射到兩種不同的小鼠品系中，然后分析不同時間點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空衣殼比例的增加不僅導(dǎo)致了目標(biāo)蛋白表達(dá)的抑制，而且增加了肝轉(zhuǎn)氨酶水平，這表明其產(chǎn)生了不良反應(yīng)，因此有必要對AAV 產(chǎn)品的空殼率實施質(zhì)量控制。

3 不同質(zhì)譜檢測方法在AAV 質(zhì)量屬性檢測上的應(yīng)用

目前，MS(質(zhì)譜)法在生物制藥和蛋白質(zhì)等大分子分析上已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[45]。在生物制劑檢測方面主要涉及在氨基酸序列、糖基化、二硫鍵和翻譯后修飾(PTMs)的表征，以及蛋白質(zhì)鑒定、表位定位、高階結(jié)構(gòu)測定、宿主細(xì)胞蛋白(HCP)監(jiān)測及蛋白質(zhì)定量質(zhì)量控制測試[46-49]。MS 法在獲取蛋白質(zhì)序列、3D 結(jié)構(gòu)和相互作用之間的信息越來越重要。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析上，MS 已經(jīng)成為經(jīng)典的核磁共振光譜和X 射線晶體學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方法的補(bǔ)充方法，而且克服了核磁共振光譜需要的蛋白質(zhì)濃度較高和X 射線衍射結(jié)晶法在一些柔性蛋白質(zhì)無法結(jié)晶方面上的局限[50]。此外，MS 技術(shù)也在得到不斷的發(fā)展，目前MS 與多種技術(shù)的聯(lián)用使得質(zhì)譜在表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和相互作用之間有了更加進(jìn)一步的發(fā)展，例如MS 聯(lián)用于化學(xué)交聯(lián)(XL)[51-52]、氫/氘交換(HDX)[53]、羥基自由基蛋白質(zhì)足跡(HRPF)[54-55]、限制性蛋白酶解[56]和細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移(CETSA)[57-58]。XL-MS 可以用于研究近端殘基的相互作用，推斷或者驗證蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜結(jié)合HDX、HRPF或有限蛋白水解技術(shù)可用于識別在復(fù)合物形成時表面可及性發(fā)生改變的殘基，從而提供分子間互作界面和復(fù)合物構(gòu)象動力學(xué)的信息。而細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移技術(shù)可以用于研究小分子配體的結(jié)合程度。

本文側(cè)重于現(xiàn)有質(zhì)譜方法在AAV 載體制劑的衣殼比率、翻譯后修飾、AAV 血清型表征和空白衣殼比率上的應(yīng)用。目前用于檢測衣殼比率的常用方法為凝膠電泳法，但是固有的偽影、染色差異以及染色的條帶強(qiáng)度與衣殼蛋白之間關(guān)系尚未闡明限制了該方法的準(zhǔn)確性[59-60]。AAV 血清型的表征主要采用酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA，但是應(yīng)用上受到不同血清型特異性抗體開發(fā)的限制[61]?？瞻滓職け嚷实臋z測目前已經(jīng)有qPCR 法、光密度法、分析型超速離心（AUC）法和TEM 法，但是這些方法中qPCR 法會受到部分包封的衣殼的影響導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差；光密度法較為簡便但是準(zhǔn)確性不高；AUC 法的操作較為復(fù)雜，檢測耗時久；TEM 法也無法區(qū)分部分包封的衣殼[62]。而MS由于其較高的質(zhì)量分辨率和質(zhì)量檢測范圍，可以實現(xiàn)對AAV 載體的完整衣殼蛋白、不同類型的VP 蛋白、肽段和氨基酸序列的表征，使得MS 在分析VP 蛋白及其片段、PTMs 和AAV 載體血清型中有著獨(dú)特的優(yōu)勢，并且檢測需要的樣品數(shù)量少、檢測時間短，可以與不同的分離技術(shù)聯(lián)用。此外，非變性質(zhì)譜和電荷檢測質(zhì)譜（CDMS）的應(yīng)用有望克服現(xiàn)有方法在衣殼蛋白比率和空白衣殼比率不夠準(zhǔn)確的難題。

3.1 衣殼比率（衣殼的化學(xué)計量）

目前對VP 化學(xué)計量學(xué)的評價主要采用電泳方法，尤其是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，采用SYPRO Ruby 染料進(jìn)行銀染或熒光染色可提高VP 條帶檢測的靈敏度[59-60]。雖然用染料染色和條帶強(qiáng)度與實際蛋白質(zhì)量之間的關(guān)系是闡明化學(xué)計量學(xué)所必需的，但與VPs的關(guān)系尚未確定。毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)對VP 具有良好的靈敏度和分離能力，已成為生物制藥質(zhì)量控制的主要方法[63-64]。分離出的蛋白質(zhì)是通過肽鍵或芳香族氨基酸殘基的吸收來檢測的，無需染色，因此可以實現(xiàn)對VP的直接定量。

MS 在估計AAV 中VP 比率方面的效用已被證明與基于LC 的分離和基于CGE 的技術(shù)相結(jié)合[25,65]。Oyama等[25]報道了基于SDS-PAGE、CGE 以及LC-UV-MS 的檢測VP3 變體的結(jié)果。通過SDSPAGE 中條帶的亮度密度、CGE 中電泳圖譜的峰面積、LC-UV 色譜圖譜的峰面積計算AAV 衣殼的VP比值。其中，CGE 與LC-UV-MS的檢測結(jié)果基本一致，SDS-PAGE 中對于VP2 的檢測值偏低，這可能是由于染料與VP 結(jié)合的定量關(guān)系不同導(dǎo)致的。此外，LC-UV-MS 的檢測過程中會產(chǎn)生的VP3 片段，這也應(yīng)該計算到VP3 的定量中，除了VP 的定量外，LC-UV-MS 還可以明確地鑒定所有VP 成分的氨基酸長度。對于AAV1、AAV2、AAV6，在SDSPAGE 圖中VP1、VP2、VP3 蛋白都被清晰地檢測出來，但是相較于SDS-PAGE，CGE 具有更好的分辨率和靈敏度，在CGE 中VP3 的一個小峰也被檢測出來。經(jīng)過LC-UV-MS 在完整蛋白和MS/MS 在肽段水平的分析，確認(rèn)了該小峰屬于VP3 基因漏掃描產(chǎn)生的不完整片段而該片段會導(dǎo)致在LC-UVMS中對VP3成分的檢測結(jié)果偏高。

親水作用色譜（HILIC）是反相色譜（RPLC）的一種補(bǔ)充方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于極性物質(zhì)的分析[66]。HILIC 可以有效地分離極性較大的物質(zhì)，克服了RPLC 對于強(qiáng)極性物質(zhì)的分離弱和正相色譜（NPLC）在流動相溶解量不足的問題[67]。在生物制藥實驗室中，基于HILIC的分離經(jīng)常被應(yīng)用于研究糖蛋白生物制藥中釋放的聚糖或糖肽。近年來，越來越多的報道表明，使用寬孔酰胺基柱的HILIC分離也可以成功應(yīng)用于完整的蛋白質(zhì)[68-70]。Liu等[71]利用親水作用色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，通過增大進(jìn)樣量到20 μL 或者在啟動洗脫之前重復(fù)給樣增大了柱子的裝載量，再通過脫溶性氣體改善TFA 的離子抑制提高了分辨率。該檢測在完整蛋白水平上成功實現(xiàn)了對于VP1、VP2 和VP3 的分離，質(zhì)譜的質(zhì)量偏差2 D 以內(nèi)。此外，利用色氨酸自帶的熒光可以實現(xiàn)對于VP 的化學(xué)計量，但這也導(dǎo)致了化學(xué)計量會偏向于色氨酸偏多的VP。此外，由于HILIC 分離可以進(jìn)一步分離出不同VP 的蛋白形態(tài)，不同VP 的蛋白形態(tài)可能發(fā)生共洗脫，導(dǎo)致峰整合不準(zhǔn)確。最后，尚不清楚不同VP 的回收率是否會因HILIC柱上吸附的不同而有所不同。盡管如此，該方法仍可用于半定量比較不同批次或工藝中3 個VP 的相對表達(dá)量，并且可以用于AAV不同批次間的比較。

非變性質(zhì)譜（native MS）是研究大分子和蛋白質(zhì)及其配體復(fù)合物的重要手段，因為它保留了相互作用之間的非共價作用力[72]。使用非變性質(zhì)譜可以確定完整大分子復(fù)合物的質(zhì)量、化學(xué)計量、組分之間的直接相互作用，并且在多亞基組裝的情況下，識別穩(wěn)定的亞配合物并分配亞基的相對位置[73-74]。Snijder 等[75]利用Orbitrap 質(zhì)譜儀獲得了不同病毒組裝體的高分辨率非變性質(zhì)譜圖，能分析相對分子質(zhì)量高達(dá)4.5 MD 病毒顆粒，并且由此對AAV1的3種VP的化學(xué)計量學(xué)做了檢測，得到了共8個匹配的化學(xué)計量（圖4），由此提出VP的組裝是隨機(jī)的。W?rner 等[27]通過使用Orbitrap UHMR 提高了有效轉(zhuǎn)移和檢測高質(zhì)量離子的能力，提高了非變性質(zhì)譜的分辨率。使用模擬的非變性質(zhì)譜與樣品的非變性質(zhì)譜做了比較，可以計算化學(xué)計量。為了模擬非變性質(zhì)譜，開發(fā)了一個python 類的程序，能夠創(chuàng)建復(fù)雜樣品的理論質(zhì)譜，對1 891（基于n= 3 個不同的VP，總共k= 60 個子單位，給出唯一的組合/質(zhì)量[3]）可能存在的理論質(zhì)譜做了模擬。分析的結(jié)果與LC-UV-MS 檢測的結(jié)果基本一致。并且提出了VP 在不同的血清型和批次之間存在異質(zhì)性，即使是同一批次內(nèi)的樣品，其VP 的組裝也具有隨機(jī)性，說明了VP 的比率1∶1∶10 只是一個總體分布的平均值，在實際生產(chǎn)中部分VP 的拷貝數(shù)可能會偏離這個比例，而這對于VP1 與VP2 來說變化程度較大，例如：AAV8_2中VP1的產(chǎn)生量是AAV8_1的2倍。

Figure4 Simulated mass spectra for AAV9, showing the convoluted ion signals of the 69 967 different ion species shown in a) at resolutions, corresponding to transient times of 32 ms and 128 ms. Each plot shows (top to bottom) the simulated mass spectra before and after baseline correction with their experimental counterpart. Experimental data was recorded by transient averaging, thereby removing the unresolved regions presented in the non-baseline corrected[27]

3.2 翻譯后修飾（PTMs）

MS 對于完整蛋白和肽段水平的分析都可以用于分析AAV 衣殼蛋白的翻譯后修飾[65]。Zhang等[65]利用優(yōu)化過后的RPLC-MS對AAV的衣殼蛋白進(jìn)行了分析，利用二氟乙酸（DFA）作為流動相，很好地改善了之前氟乙酸（FA）無法分離VP 蛋白的問題。精準(zhǔn)的質(zhì)量檢測使得在完整蛋白水平可以分析潛在的PTMs，例如，VP1和VP3的實測質(zhì)量與理論質(zhì)量相差89 D，說明N 端蛋氨酸截斷，加入了N 端乙酰化為潛在的分子形式；VP1 和VP2 的反卷積譜中檢測到80 D 的質(zhì)量位移，并確定為磷酸化。并且開發(fā)了一種新的酶解方法，對于AAV5的序列覆蓋率達(dá)到了98%，檢測到了包括N-乙?；⒚擋０坊?、氧化、甲基化和磷酸化在內(nèi)的多種PTMs。Jin 等[45]用LC-MS 直接分析AAV 衣殼蛋白，完整質(zhì)譜測量結(jié)合肽圖譜結(jié)果顯示，VP1和VP3中N 端蛋氨酸殘基被裂解，下一個丙氨酸殘基被乙?；?，而多種AAV 血清型(AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV9和AAVrh10)的VP2中沒有乙?；?/p>

利用CE(毛細(xì)管電泳)分離技術(shù)，Zhang 等[76]報道了一種基于微流體的CE-MS 鑒定AAV2 衣殼蛋白的方法。其中3 個VP 在MS 檢測之前幾乎已經(jīng)基線分離，VP1 與VP2 的分離優(yōu)于之前報道的RPLC-MS 法[45]。最后，完整蛋白質(zhì)量分析也可以潛在地識別由PTMs 形成引起的衣殼蛋白變異，如乙?；?42 D。上文提到的Oyama 等[25]和Liu等[71]也實現(xiàn)了對PTMs 的鑒定。作者等基于CGE和LC的分離后，在肽段水平的分析上檢測出了VP上的N-乙?；?，VP1、VP2 的磷酸化和VP 上天冬酰胺的脫酰胺。作者利用親水作用色譜與質(zhì)譜耦合的方法，質(zhì)譜分析證實了在所有血清型中VP1 和VP3中N端蛋氨酸的去除和后續(xù)丙氨酸的乙?；?，以及VP2中N端蘇氨酸的去除。此外，還有氧化和磷酸化的變體也被檢測到（圖5）。

Figure5 PTMs between different batches of AAV8[71]

除此之外，基于PTMs 的研究結(jié)果，通過蛋白質(zhì)工程來設(shè)計改善AAV 衣殼蛋白，可以使得AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率得到提高，半衰期得到延長。Giles等[28]對AAV 的脫酰胺進(jìn)行了研究，影響脫酰胺率的最重要因素之一是N+1氨基酸(天冬酰胺后的氨基酸殘基)的主酰胺作為親核試劑攻擊天冬酰胺殘基側(cè)鏈羰基碳形成琥珀酰亞胺的能力，以及肽主鏈的柔韌性。N+1 殘基對肽骨架的局部柔韌性至關(guān)重要，因此嚴(yán)重影響天冬酰胺的脫酰胺率。甘氨酸(G)在N+1位置形成一個NG 基序，對脫酰胺的影響最大，其次是組氨酸(H)和絲氨酸(S)[77]。該研究為AAV8 NG 位點(diǎn)突變體制作了小規(guī)模的載體，分別將每個N+1 殘基轉(zhuǎn)化為丙氨酸或絲氨酸。在絲氨酸的方案中，涉及N263 的兩種配對組合(G264A/G515A 和G264A/G541A)都提高了體外轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(分別是wt AAV8 的2.0 倍和2.6 倍)，而滴度沒有損失。

3.3 血清型的鑒定

AAV 血清型鑒定通常通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或Western blot 方法進(jìn)行。然而，這些方法受到血清型特異性抗體可用性的限制，可能不足以區(qū)分具有高序列同源性的血清型，這一問題將不可避免地因工程化AAV 血清型數(shù)量的迅速增長而復(fù)雜化[61]。最近，Bennett 等[78]報道了基于AAV1到AAV9 和AAVrh 特異融化溫度的差示掃描熒光法(DSF)在AAV 血清型鑒別中的應(yīng)用，可以確定AAV 不同血清型的熔化溫度，但是該方法的分辨率不高。

基于質(zhì)譜(MS)的方法在AAV 血清型鑒定中的應(yīng)用越來越多，它們可用于分析完整蛋白或VP 的肽圖譜。后者能夠明確區(qū)分衣殼蛋白氨基酸序列，它在氨基酸序列水平上提供了高可信度的衣殼鑒別。這是目前區(qū)分VPs 相對分子質(zhì)量差異小于10 D 的血清型所必需的。例如，AAV1 和AAV6的VP2 和VP3 氨基酸序列高度相似，相對分子質(zhì)量差僅為2 D[79]。在膠上酶切或溶液酶切后進(jìn)行的基于LC-MS 的肽圖譜分析，不僅可以提供每個衣殼蛋白的識別，而且還可以檢索位點(diǎn)特異性PTMs的信息[45,80]。相比之下，完整蛋白質(zhì)量分析通常是在色譜或電泳分離后在高分辨率精確的質(zhì)譜(HRAM)質(zhì)譜系統(tǒng)上進(jìn)行，是一種基于精確質(zhì)量測量和最小樣本處理的直接快速識別AAV 血清型特異性衣殼蛋白的技術(shù)。Lam 等[81]基于LC-MS/MS的肽圖分析對AAV 的VP序列實現(xiàn)了高效的鑒定，其中盡管VP1、VP2 的含量偏低，序列覆蓋率也能達(dá)到93%，由此對AAV2、AAV5、AAV8、AAV9 實現(xiàn)了鑒別。Jin 等[45]使用反相液相色譜(RPLC)耦合質(zhì)譜法對AAV2 衣殼蛋白進(jìn)行了鑒定。此外，Liu 等[71]報道了一種基于親水相互作用液相色譜(HILIC)-MS 的完整VP 分析方法。在具有高分離效率的同時也能夠檢測不同PTMs 后的VP。2D 液相色譜(2DLC)和毛細(xì)管電泳(CE)，也已為此目的而開發(fā)，并展示了不同的方法，通過這些方法可以在MS 分析之前有效地分離VP成分，表征VP的序列[76,82]。

3.4 空殼率

有多種方法可以確定滿AAV 衣殼和空AAV衣殼之間的比率。其中一種方法是通過用現(xiàn)有qPCR數(shù)據(jù)得到的基因組載體數(shù)除以ELISA數(shù)據(jù)得到的總衣殼數(shù)來確定完整衣殼在總衣殼中的百分比但是，這種方法缺乏足夠的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和精密度[41]。另一種方法是利用AAV 樣品在260 和280 nm 的吸收度，用分光光度法測定樣品中的蛋白質(zhì)和DNA 含量。該方法簡單、快速、易于操作。但AAV 樣品純度要求高，才能最大限度地減少雜質(zhì)對260 和280 nm 紫外光吸收度的干擾。AUC 可以完整分離不同的衣殼蛋白，但是操作上復(fù)雜、分析時間長、成本高，需要大量的樣本量，數(shù)據(jù)解釋需要專業(yè)知識[62]。利用TEM 也可以實現(xiàn)對于AAV 空衣殼和滿衣殼的區(qū)分，但是操作時間長，且無法分辨部分裝載的衣殼。

電荷檢測質(zhì)譜（CDMS）是一種單粒子方法，它同時測量單個離子的m/z和電荷(z)，以直接確定其相對分子質(zhì)量。帶電粒子的通過會產(chǎn)生一個信號，然后由電荷敏感放大器檢測到。典型的分析包括對數(shù)千個粒子的單獨(dú)測量，然后繪制成質(zhì)量直方圖，顯示樣品的相對分子質(zhì)量分布和各自的豐度[83]。質(zhì)譜法測量DNA和RNA的相對分子質(zhì)量分布時，由于反離子的存在而導(dǎo)致異質(zhì)性。非均質(zhì)性反過來又限制了傳統(tǒng)MS 可以測量的寡核苷酸的大小，CDMS 通過直接測量每個離子的質(zhì)量電荷比(m/z)和電荷克服了這一限制[84]。Barnes等[84]利用CDMS 對AAV8 的空滿衣殼進(jìn)行了測定（圖6），空衣殼為3.7 MD，滿衣殼為5.4 MD，成功測量了其比率。并且能夠檢測到部分DNA 被截斷，從而可以用于篩查這部分包裹了不完整DNA的衣殼。

Figure6 Representative mass distribution and charge-to-mass scatter plots recorded after incubation at 80 °C for 15 min [84]

4 總結(jié)與展望

正如前文所述，質(zhì)譜正在成為生物制藥行業(yè)分析AAV 基因治療產(chǎn)品的關(guān)鍵表征技術(shù)之一。MS 在分析AAV 載體的衣殼比率、翻譯后修飾、血清型、空殼率方面展現(xiàn)出了其獨(dú)特的優(yōu)勢，不僅能在完整蛋白的水平上分析AAV 載體，也能在肽段水平上分析AAV 的衣殼。隨著新的質(zhì)譜電離技術(shù)和上游分離技術(shù)的發(fā)展，CDMS 等先進(jìn)技術(shù)將在AAV 分析中發(fā)揮越來越重要的作用。MS 儀器和數(shù)據(jù)分析軟件的性能的增強(qiáng)，也能實現(xiàn)對于AAV組裝規(guī)律的揭示、批次間的快速比較和高通量的載體質(zhì)量檢測。而將MS 技術(shù)和眾多的分離技術(shù)正交可以實現(xiàn)對于AAV 蛋白質(zhì)氨基酸序列的高分辨表征。未來隨著AAV 生產(chǎn)工藝和應(yīng)用的發(fā)展，MS 技術(shù)有望在生產(chǎn)過程的各個階段實現(xiàn)對于AAV 載體質(zhì)量的實時監(jiān)控。同時作為一種表征技術(shù)，可以用于指導(dǎo)AAV 載體的設(shè)計過程。AAV 載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中面臨著適應(yīng)性免疫的限制，其免疫原性也會增加治療過程中的不良反應(yīng)[9,19]。PTMs 也會AAV 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率產(chǎn)生影響。因此如何設(shè)計更加具有優(yōu)勢的AAV 載體也得到了較多的關(guān)注[16,85]。而通過MS 技術(shù)對VP 序列和相關(guān)蛋白的表征可以很好地指導(dǎo)AAV 載體的設(shè)計。例如，通過對于PTMs 的研究，確認(rèn)不同血清型的不同位點(diǎn)氨基酸序列的變化對于AAV 載體質(zhì)量有何影響，從而可以通過蛋白質(zhì)工程對AAV 進(jìn)行改良，提高治療過程中的安全性[77]。