基于液相色譜-多級(jí)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（LC-MRM3）的高靈敏定量分析新策略

李 婷，張 珂，李 軍，王勝鵬，宋月林

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 102488；2北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；3澳門大學(xué)中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門 999078）

近年來(lái)，由于其高靈敏度、高特異性、高效分離等優(yōu)勢(shì)，液相色譜多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、藥物、食品科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的定性、定量分析中。尤其是超高效液相色譜（UHPLC）的快速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了在數(shù)分鐘內(nèi)單次分析數(shù)百個(gè)化合物，使得LC-MS/MS 兼具高通量的優(yōu)勢(shì)。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple-reaction monitoring，MRM）主要依靠三重四極桿質(zhì)譜（QqQ-MS）實(shí)現(xiàn)。由于其重復(fù)性好、精密度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為復(fù)雜基質(zhì)中痕量化學(xué)成分分析的強(qiáng)有力工具。LC-MRM 被認(rèn)為是小分子定量分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1-3]。然而，在對(duì)生物樣品、土壤、污水等高度復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)，無(wú)法完全去除背景干擾，導(dǎo)致LC-MRM 的靈敏度和選擇性難以滿足定量分析要求[2,4-5]。為了彌補(bǔ)該缺陷，有學(xué)者提出了采用多個(gè)MRM 離子對(duì)檢測(cè)同一分析物，通過(guò)將多個(gè)離子對(duì)的信號(hào)強(qiáng)度加和提高靈敏度。由于采用了多個(gè)碎片離子，該方法也可用于分析物的確認(rèn)[6-7]。然而，對(duì)于存在強(qiáng)干擾的復(fù)雜基質(zhì)，該方法依舊難以實(shí)現(xiàn)靈敏度的有效提升[8]。

離子阱質(zhì)譜（ion trap MS，IT-MS）具有離子聚焦、共振激發(fā)、共振彈射、多級(jí)碎裂等多種功能，可以實(shí)施多級(jí)質(zhì)譜（MSn）掃描，主要包含三維離子阱（3D IT-MS）和線性離子阱（linear ion trap MS，LITMS；又稱二維離子阱）兩種類型[9]。其中，3D IT-MS可以通過(guò)多次的“冷卻-激發(fā)”循環(huán)，理論上可以實(shí)現(xiàn)無(wú)限極質(zhì)譜掃描，而LIT-MS只能實(shí)現(xiàn)單次的“冷卻-激發(fā)”程序。相較于3D-IT MS，LIT-MS 具有更大的捕獲空間、更高的注入效率和更強(qiáng)的離子存儲(chǔ)能力[10-11]以及更小的空間電荷效應(yīng)[12-13]。四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Qtrap-MS）通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)的三重四極桿質(zhì)譜（QqQ-MS）進(jìn)行改良，其最后一個(gè)質(zhì)量分析器（Q3）可以在四極桿（Q）和LIT 模式間快速切換，同時(shí)具有多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜（MS3）分析和離子選擇性富集能力，有效提高了去除背景噪音或雜質(zhì)干擾的能力。

多級(jí)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple-reaction monitoring tubed，MRM3）在MS3掃描的基礎(chǔ)上，通過(guò)前體離子→子離子→孫離子對(duì)目標(biāo)化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)。與MRM 只進(jìn)行兩次離子篩選相比，MRM3對(duì)分析物產(chǎn)生的離子進(jìn)行三次連續(xù)篩選，顯著降低了背景噪音或雜質(zhì)干擾，進(jìn)而有效提升了靈敏度和選擇性。作為一種新興的定量技術(shù)，近年來(lái)，MRM3定量技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品[5]、生物樣品[14-15]等復(fù)雜基質(zhì)中化學(xué)成分的定量分析。

鑒于LC-MRM3在定量分析中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，本文將從儀器原理、參數(shù)設(shè)置及其在生物標(biāo)志物、藥物、法醫(yī)毒物、食品和環(huán)境等領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 儀器原理

MSn（n≥ 3）掃描是IT-MS 的特有掃描模式，而由于LIT 在高離子儲(chǔ)存能力及低空間電荷效應(yīng)等方面的優(yōu)勢(shì)，LIT 在定量分析中更為常用。通過(guò)二維的射頻電壓（radio frequency，RF）將離子徑向限制，并利用施加在端電極上的停止電位進(jìn)行軸向限制，前體離子在LIT 中經(jīng)歷碰撞冷卻，選擇隔離，共振激發(fā)裂解等過(guò)程，產(chǎn)生的碎片離子從離子阱中軸向噴出并靜電聚焦至檢測(cè)器中被檢測(cè)[12,16-17]。前體離子在LIT 中被共振激發(fā)并從RF 中吸收能量，獲得動(dòng)能，與引入的碰撞氣體發(fā)生碰撞并裂解產(chǎn)生子離子，然后可以進(jìn)一步發(fā)生裂解或進(jìn)行質(zhì)量分析[18]。Qtrap-MS 結(jié)合了四極桿和LIT 兩種質(zhì)量分析器的優(yōu)勢(shì)，具有MS3分析能力和離子選擇性富集能力，可有效甄別目標(biāo)信號(hào)和干擾信號(hào)。由于更高的靈敏度和選擇性，Qtrap-MS 在復(fù)雜基質(zhì)定量分析中的應(yīng)用更為廣泛。如圖1-A所示，整個(gè)儀器主要由前端的一個(gè)純射頻電壓（RF）的預(yù)四極桿（Q0）和中間3 個(gè)四極桿質(zhì)量分析器（Q1，q2，Q3/LIT）組成[16,19]。其中，Q3 既可以作為傳統(tǒng)的直流/射頻（RF/DC）分辨的四極桿質(zhì)量分析器，也可以作為軸向射出的LIT。當(dāng)Q3 作為L(zhǎng)IT 時(shí)，通過(guò)在LIT上施加射頻（RF）電壓將離子徑向限制，并利用施加在短電極上的靜止電位進(jìn)行軸向限制，產(chǎn)生的子離子與殘余的前體離子在壓力較低（3 × 10-5Torr）的LIT 中被阱?。▓D1-B）。在MS3掃描模式下，前體離子通過(guò)RF/DC 分辨的Q1 四極桿，并加速進(jìn)入q2 碰撞池（壓力約為5 × 10-3Torr）。在q2中以特定的碰撞能（collision energy，CE）發(fā)生碰撞誘導(dǎo)解離（collision induced dissociation，CID），產(chǎn)生的子離子進(jìn)入LIT 中被阱集，然后篩選目標(biāo)子離子，以設(shè)定的激發(fā)能量（excitation energy，EE，對(duì)應(yīng)儀器參數(shù)AF2）以共振激發(fā)的形式發(fā)生進(jìn)一步CID，產(chǎn)生的孫離子碎片被阱集，并做進(jìn)一步篩選。由于在高真空區(qū)域中離子阱無(wú)法實(shí)現(xiàn)離子直接碰撞解離，使用脈沖閥技術(shù)向離子阱中短暫注入碰撞氣體（如N2），從而實(shí)現(xiàn)更快、更有效的多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析[20]。

采用LC-MS3進(jìn)行定量分析有兩種方式: 一種是以MS3全掃描的形式掃描子離子在LIT 中裂解產(chǎn)生的所有孫離子，并將其中一個(gè)或多個(gè)孫離子豐度的加和用于定量分析[21-23]。另一種則是MRM3掃描，依據(jù)感興趣的孫離子設(shè)置窄質(zhì)量掃描范圍，在MRM 設(shè)定的前體離子→子離子離子對(duì)基礎(chǔ)上，增加孫離子信息，實(shí)現(xiàn)前體離子→子離子→孫離子3 次連續(xù)篩選檢測(cè)（圖1-C）。與MRM 只進(jìn)行兩次離子篩選相比，MRM3顯著降低了背景噪音或雜質(zhì)干擾，進(jìn)一步提高選擇性、增強(qiáng)靈敏度，更適合復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析。Campbell等[8]對(duì)比了MRM，MS3和MRM3（該研究稱為Scan-free MS3）3 種掃描方式的定量分析能力，其中MS3掃描的選擇性比MRM 更高，但循環(huán)時(shí)間通常比MRM 長(zhǎng)，而MRM3掃描由于只采集預(yù)選的離子信號(hào)，相較于傳統(tǒng)的MS3分析可以減少約35%的循環(huán)時(shí)間，不會(huì)造成靈敏度損失，其性能與MRM和傳統(tǒng)的MS3相比更好。

MS（3MRM3）掃描激發(fā)效率高，掃描速度可達(dá)20 kD/s。通過(guò)多次碎裂和篩選，對(duì)分析物的選擇性增強(qiáng)、基線降低、信噪比提升，從而顯著提升靈敏度。

2 MRM3掃描參數(shù)設(shè)置

通過(guò)相關(guān)參數(shù)優(yōu)化，可以提高分析物MRM3離子對(duì)的響應(yīng)，增強(qiáng)方法的選擇性和靈敏度。CE 和去簇電壓（declustering potential，DP）是與一級(jí)CID產(chǎn)生子離子相關(guān)的參數(shù)；與LIT 掃描相關(guān)的參數(shù)主要包括激發(fā)能量（EE，對(duì)應(yīng)儀器參數(shù)AF2）、激發(fā)時(shí)間、LIT 填充時(shí)間、掃描速度等，這些參數(shù)與分析物的響應(yīng)密切相關(guān)。

2.1 去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）

DP 控制orifice 上的電壓，從而控制orifice 和Qjet 之間離子的聚簇能力。DP 電壓越高，傳遞給離子的能量就越高，適當(dāng)?shù)腄P 可以避免溶劑分子的吸附，但DP 過(guò)高會(huì)引發(fā)源內(nèi)裂解，導(dǎo)致目標(biāo)化合物碎裂[24]。CE是導(dǎo)致母離子在q2中發(fā)生CID的參數(shù)。低CE 值難以產(chǎn)生足夠強(qiáng)度和種類豐富的子離子，而高CE 值則常會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)子離子過(guò)度裂解為非目標(biāo)碎片。因此，需對(duì)DP 和CE 進(jìn)行優(yōu)化以獲得足夠強(qiáng)度的目標(biāo)子離子，從而增強(qiáng)MRM3離子對(duì)的整體響應(yīng)。針對(duì)DP和CE，可以采用注射對(duì)照品的方式或者在線能量分辨質(zhì)譜（online energyresolved-MS，online ER-MS），采集不同DP 和CE 下離子對(duì)的響應(yīng)，根據(jù)色譜峰面積或平均質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化[25-27]。

2.2 激發(fā)能量（EE）

EE值描述了LIT對(duì)q2碰撞產(chǎn)生的子離子施加的張力，對(duì)子離子的裂解效率影響最大[19]。其優(yōu)化步驟與CE類似，可以采用online ER-MS方法，通過(guò)采集不同EE 下離子對(duì)信息，以色譜峰峰面積或平均質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度對(duì)EE 值作高斯曲線擬合，曲線頂點(diǎn)即為最優(yōu)EE值[28]。

2.3 激發(fā)時(shí)間與LIT填充時(shí)間

激發(fā)時(shí)間即施加激發(fā)能量的時(shí)間。如果激發(fā)時(shí)間過(guò)短，離子在離子阱中無(wú)法充分裂解，碎片離子過(guò)少甚至無(wú)法產(chǎn)生碎片。反之，則碎片過(guò)多，影響目標(biāo)孫離子的產(chǎn)生。LIT 填充時(shí)間為子離子在LIT 中的累積時(shí)間，包括動(dòng)態(tài)和固定填充時(shí)間兩種設(shè)置方式。動(dòng)態(tài)填充時(shí)間根據(jù)來(lái)自離子源的離子通量自動(dòng)調(diào)節(jié)填充時(shí)間使碎片離子在離子阱中積累。一般而言，MRM3定量首選固定填充時(shí)間。一方面，固定的填充時(shí)間使每次分析的占空比完全相同，保證每個(gè)色譜峰的點(diǎn)數(shù)相同，從而具有更高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。另一方面，當(dāng)使用固定填充時(shí)間時(shí)，可以激活Q0 捕獲選項(xiàng)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)靈敏度的提升。在一定范圍內(nèi)，激發(fā)時(shí)間和LIT 填充時(shí)間的增加，可以顯著提高離子對(duì)的響應(yīng)。然而，這種增長(zhǎng)并非線性增長(zhǎng)，在超過(guò)一定值后，化合物響應(yīng)增強(qiáng)效果不再明顯，反而會(huì)導(dǎo)致循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)。一個(gè)LC-MS色譜峰至少需要15 ～ 20個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)方能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量分析[29]，而激發(fā)時(shí)間和LIT 填充時(shí)間的增加則會(huì)減少每個(gè)色譜峰的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)，從而影響色譜峰峰形。因此，需要綜合考慮信號(hào)改善和色譜峰數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)更好的定量分析效果。已有報(bào)道中，部分研究者將LIT 填充時(shí)間和激發(fā)時(shí)間作為一個(gè)與化合物非相關(guān)的參數(shù)，在對(duì)所有化合物檢測(cè)時(shí)均保持LIT 填充時(shí)間和激發(fā)時(shí)間固定不變[21,30]。然而，Lopukhov 等[31]在研究過(guò)程中注意到LIT 填充時(shí)間和激發(fā)時(shí)間與化合物相關(guān)的現(xiàn)象，在增加LIT 填充時(shí)間和激發(fā)時(shí)間的情況下，由于其他基質(zhì)物質(zhì)的共生聚集，分析物發(fā)生降解，因此需要對(duì)不同的分析物進(jìn)行不同LIT 填充時(shí)間和激發(fā)時(shí)間的優(yōu)化。Guironnet 等[4]的研究也證實(shí)了這一現(xiàn)象，即對(duì)于MRM3掃描的每一個(gè)分析物，特別是在針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的化合物分析時(shí)，應(yīng)對(duì)不同化合物的LIT 填充時(shí)間和激發(fā)時(shí)間參數(shù)分別進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 掃描速度

MRM3掃描速度也會(huì)影響循環(huán)時(shí)間和峰響應(yīng)強(qiáng)度。掃描速度降低，響應(yīng)增強(qiáng)，循環(huán)時(shí)間增加；反之，掃描速度增加，可以縮短循環(huán)時(shí)間，但可能伴隨著色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度降低的發(fā)生。Sordet 等[30]針對(duì)分析物進(jìn)行了3個(gè)掃描速度的優(yōu)化，結(jié)果顯示1 kD/s 的速度大大延長(zhǎng)了循環(huán)時(shí)間；20 kD/s 的速度由于離子在脫離離子阱前沒(méi)有時(shí)間被聚集和穩(wěn)定，因此降低了分析物的響應(yīng)強(qiáng)度；在最佳循環(huán)時(shí)間和響應(yīng)響度之間的最適宜掃描速度為10 kD/s。

2.5 其他參數(shù)

前述可知，MRM3掃描通常循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致其同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)化合物的能力較差。采用常規(guī)高效液相色譜（HPLC）與MRM3聯(lián)用，為獲得良好的色譜峰峰形，一個(gè)掃描周期內(nèi)通常只能容納10 ～ 12 個(gè)MRM3離子對(duì)。在使用UHPLC 時(shí)，色譜峰峰寬更窄，通常為10 s 左右[32-33]，可同時(shí)監(jiān)測(cè)的分析物則更少。為了增加同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)化合物的能力，可以通過(guò)設(shè)置分段掃描或者動(dòng)態(tài)掃描的方式。依據(jù)保留時(shí)間，在不同的時(shí)間段內(nèi)分別設(shè)置對(duì)應(yīng)的離子對(duì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)[30,34]。

另外，Q0 為高壓腔內(nèi)僅射頻的四極桿離子導(dǎo)引，可通過(guò)高壓碰撞聚焦技術(shù)提高離子聚焦能力，更多氣體分子與離子碰撞，減少離子路徑空間，使離子的傳輸最大化。設(shè)置Q0 捕獲（Q0 trapping）也被用來(lái)增加靈敏度和占空比，通過(guò)增加聚焦層，從離子源到分析器的離子飛行時(shí)間被放大[4,17,35]。

3 應(yīng) 用

LC-MRM3定量分析策略已被廣泛用于生物標(biāo)志物、藥物、法醫(yī)毒物、食品和環(huán)境分析等領(lǐng)域。尤其是在對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的痕量化學(xué)成分進(jìn)行靶向定量分析時(shí)，可以顯著提升靈敏度和選擇性，降低檢測(cè)限和定量限。

3.1 生物標(biāo)志物分析

生物標(biāo)志物是指可被客觀測(cè)量并能用于評(píng)價(jià)正常生物過(guò)程、病理過(guò)程及治療反應(yīng)的指標(biāo)，對(duì)臨床治療、疾病診斷與分型、疾病發(fā)展進(jìn)程等具有重要指導(dǎo)意義[36]。褪黑素在許多生理過(guò)程中起著重要的作用，而6-磺酰氧基褪黑素（6-sulfatoxymelatonin，6-SM）是尿液中褪黑素排泄的主要代謝產(chǎn)物，其濃度與血漿中褪黑素水平存在相關(guān)性。因此，對(duì)尿液中的6-SM進(jìn)行定量分析可以評(píng)估褪黑素的水平[37]。Lopukhov 等[31]通過(guò)優(yōu)化MRM3參數(shù)，建立了人體尿液中6-SM 的LC-MRM3定量分析方法。該方法的定量準(zhǔn)確性和精確性與LC-MRM 相當(dāng)，但具有更優(yōu)的選擇性。Richards等[2]采用LC-MRM3策略實(shí)現(xiàn)了人體血清中甲狀腺激素類成分的定量分析，定量下限（lower limits of quantification，LLOQ）可達(dá)2.63 ～ 194.22 μg/mL（0.005 ～ 0.25 nmol/L），基質(zhì)效應(yīng)低，靈敏度高，方法準(zhǔn)確可靠。對(duì)于復(fù)雜生物基質(zhì)中類固醇激素[38]、視黃酸[39]、5-羥色胺[40]、去甲腎上腺素[41]等多種小分子代謝物生物標(biāo)志物的LC-MRM3定量分析方法均被成功建立。LC-MRM3定量分析策略也被成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)類生物標(biāo)志物的檢測(cè)。載脂蛋白F（APO-F）被認(rèn)為是一種新穎且有應(yīng)用前景的肝纖維化標(biāo)志物，屬于低豐度蛋白，而且其濃度會(huì)隨著肝纖維化的進(jìn)程而降低，因此需建立一種高靈敏的檢測(cè)方法。Kumar 等[42]利用LC-MRM3策略建立了人血漿中APO-F 的定量分析方法，檢測(cè)限可達(dá)到1.67 ng/mL（對(duì)應(yīng)色譜柱上多肽載樣量2.5 fmol），靈敏度、選擇性顯著增強(qiáng)。Simon 等[43]建立了人體尿液中腎小球損傷潛在生物標(biāo)志物Podocin 蛋白的LC-MRM3定量分析方法，LLOQ 為0.39 ng/mL，準(zhǔn)確度為105% ～ 112%，精密度為7% ～ 20%，方法準(zhǔn)確可靠，且可節(jié)約樣品用量。Pailleux 等[44]建立的大鼠脊髓中Tachykinin 蛋白的LC-MRM3分析方法可以顯著降低共流出物的干擾，增強(qiáng)選擇性。

3.2 藥物分析

由于高選擇性和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，LC-MRM3常用于中藥中目標(biāo)化學(xué)成分的含量測(cè)定、體內(nèi)外定量分析及藥代動(dòng)力學(xué)等研究中。Vaclavik 等[45]基于LC-MRM3建立了毒性成分馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ定量分析方法并成功應(yīng)用于30個(gè)中成藥中馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ的含量測(cè)定。Duan 等[5]建立了McF-7 細(xì)胞中農(nóng)藥殘留物甲草胺的LC-MRM3定量分析方法，并成功應(yīng)用于20 μg/mL 甲草胺給藥后的McF-7 細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)研究中。Ren 等[46]結(jié)合微固相萃取的前處理方法，基于LC-MRM3分析策略對(duì)大鼠曲普瑞林（十肽藥物）給藥后的血漿進(jìn)行了含量測(cè)定。利用微固相萃取進(jìn)行樣品快速制備，MRM3則顯著降低基質(zhì)干擾，最終實(shí)現(xiàn)多肽藥物在pg/mL水平的定量分析，并成功應(yīng)用于曲普瑞林大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究中。Cesari 等[47]采用LC-MRM3定量分析策略對(duì)小分子藥物D-amphetamine 進(jìn)行了大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究。

LC-MRM3在臨床藥物分析和藥代動(dòng)力學(xué)研究中也有較多應(yīng)用實(shí)例。甲氨蝶呤血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)減少不良反應(yīng)和調(diào)整給藥劑量至關(guān)重要，因此Yin等[48]建立了高選擇性和高靈敏度的LC-MRM3分析策略檢測(cè)甲氨蝶呤的血藥濃度。該方法不需要額外濃縮，節(jié)約分析樣品，方法準(zhǔn)確可靠，與LC-MRM定量結(jié)果一致。Ma 等[49]和Sun 等[50]采用LC-MRM3建立了人血漿中卡馬西平和金剛烷胺定量分析方法，并成功應(yīng)用于臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。

小分子類化合物在CID 裂解時(shí)產(chǎn)生碎片過(guò)小而無(wú)法被有限的質(zhì)譜掃描范圍識(shí)別或無(wú)法裂解產(chǎn)生碎片，故在進(jìn)行LC-MS/MS分析時(shí)，僅以前體離子構(gòu)建離子對(duì)進(jìn)行MRM 或MRM3檢測(cè)，基線較高、靈敏度較低、專屬性差。針對(duì)這一現(xiàn)象，有學(xué)者以分析物的醋酸鈉加合離子（[M + 2CH3COONa-H]-）作為母離子構(gòu)建MRM3離子對(duì)[M + 2CH3COONa-H]-→[M + CH3COONa-H]-→[M-H]-，建立了人血漿中伊馬替尼[51]、丙戊酸[52]和γ-羥基丁酸（GHB）[53]的LCMRM3定量分析方法，信噪比顯著增強(qiáng)，選擇性和靈敏度得到大幅度提升。此外，LC-MRM3定量分析策略在藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究中也顯示出其優(yōu)勢(shì)[54]。

3.3 法醫(yī)毒物分析

迄今為止，大麻仍是世界上最常用的毒品之一。主要的神經(jīng)興奮活性成分為四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC），THC及其代謝產(chǎn)物Δ9-四氫大麻酚-9-羧酸（OH-THC）和11-去甲-Δ9-四氫大麻酚-9-羧酸（THC-COOH）為法醫(yī)和臨床分析中重要的診斷標(biāo)志物，在血液、尿液或毛發(fā)等多種生物基質(zhì)等中均能檢測(cè)到[55]，檢測(cè)毛發(fā)中的THC-COOH是確認(rèn)大麻攝入的重要方式。相較于樣品前處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)的氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析，基于LC-MS 的毛發(fā)中THC-COOH 定量分析方法已有報(bào)道。Dulaurent 等[56]等采用LC-MRM3建立毛發(fā)中THC-COOH 的絕對(duì)定量分析方法，其LLOQ 可達(dá)0.2 pg/mL，并結(jié)合MRM 掃描，對(duì)毛發(fā)中其他大麻中的化學(xué)成分和代謝物包括THC、大麻酚和大麻二酚進(jìn)行了定量分析。Cho 等[57]建立了柱切換系統(tǒng)對(duì)LC-MS3分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，有效降低了基質(zhì)干擾。同時(shí)，作者認(rèn)為針對(duì)毛發(fā)中THC-COOH濃度較低接近定量限的樣品，將LC-MRM 與LCMRM3兩種模式結(jié)合，可以有效地增強(qiáng)分析結(jié)果的可靠性。而Park 等[58]采用柱切換結(jié)合LC-MRM3的方式，對(duì)毛發(fā)中的THC-COOH 進(jìn)行定量，其定量限降低至0.1 pg/mL。與LC-MRM 相比，LC-MRM3可以有效地去除基質(zhì)中的干擾信號(hào)，提高分析方法的選擇性?；瘜W(xué)衍生化技術(shù)是提升THC-COOH 檢測(cè)靈敏度的有效方式之一。Thieme 等[59-60]對(duì)THCCOOH 進(jìn)行選擇性甲基化和吡啶甲酸酯衍生化，建立其衍生化產(chǎn)物的LC-MRM3分析方法，LLOQ 為0.05 pg/mL，相較于常規(guī)分析方法，降低為原來(lái)的25% ～ 50%，增強(qiáng)了檢測(cè)靈敏度。液液萃?。↙LE）對(duì)提取的毛發(fā)樣品進(jìn)行凈化，無(wú)須額外的衍生化處理，結(jié)合LC-MRM3也可以增強(qiáng)THC-COOH 分析靈敏度[61]。除了大麻相關(guān)成分的檢測(cè)，針對(duì)其他毒品或興奮劑成分的LC-MRM3定量分析研究也有報(bào)道。如Zubaidi 等[62]基于分段掃描的MRM-EPIMRM3掃描策略，實(shí)現(xiàn)了多種苯丙胺類中樞興奮劑高靈敏、高選擇性的快速同步分析；Dziadosz[53]建立了人體血清中中樞神經(jīng)興奮劑GHB 的LC-MRM3定量分析策略。

3.4 食品分析

農(nóng)藥、獸藥的使用雖然極大地促進(jìn)了農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的發(fā)展，但其濫用導(dǎo)致農(nóng)藥、獸藥殘留超標(biāo)，引發(fā)食品安全問(wèn)題，對(duì)人類健康具有潛在威脅。LCMS/MS 已被中國(guó)、歐盟以及其他多個(gè)國(guó)家地區(qū)用于農(nóng)藥、獸藥殘留分析。靈敏度更高、選擇性更強(qiáng)的LC-MRM3策略也逐漸被用于食品中農(nóng)藥、獸藥的殘留分析中。氟苯尼考是一種用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)的廣譜抗菌藥，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有效。氟苯尼考是會(huì)引起耐藥性的抗生素，可以傳遞到人體內(nèi)造成抗菌素耐藥性[63]，因此，有必要對(duì)食品中氟苯尼考的殘留水平進(jìn)行測(cè)定。Faulkner 等[64]基于UHPLC-MRM3定量分析策略，對(duì)牛奶中氟苯尼考的殘留量進(jìn)行測(cè)定，在0.25 ～ 5μg/kg 和1 ～ 100 μg/kg 的范圍內(nèi)線性良好，平均總體回收率（準(zhǔn)確率）為103%，與LC-MRM 相比，該方法顯著提升了檢測(cè)靈敏度和選擇性。殘留在食品中的克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇等β-受體激動(dòng)劑經(jīng)人使用會(huì)引發(fā)頭痛、胸悶、心悸等不良反應(yīng)，甚至可能危及生命。傳統(tǒng)的LC-MRM檢測(cè)方法對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品中待測(cè)物的選擇性較差，導(dǎo)致基線較高或無(wú)法與干擾物分離，可能存在假陽(yáng)性或假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。Sun等[65]基于高選擇性的LC-MRM3策略建立了豬肝臟等復(fù)雜基質(zhì)中克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇?xì)埩魴z測(cè)的方法。與LC-MRM相比，MRM3可以顯著降低共流出物對(duì)分析物的干擾，選擇性高，實(shí)現(xiàn)了分析物的準(zhǔn)確定量。該方法在0.5 ～10 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度、靈敏度高，精密度好，為進(jìn)一步提升β-受體激動(dòng)劑在食品中的殘留監(jiān)控能力，保障食品安全提供了新方案。

單端孢霉烯族類霉菌毒素（tricothecenes）是由各種真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝物[66]，被列為最重要的慢性膳食健康風(fēng)險(xiǎn)，需建立準(zhǔn)確可靠的分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以保證食品安全。Lim 等[67]基于MRM 和MS3聯(lián)合定量分析策略分析玉米粉和大米粉中的9 個(gè)Tricothecenes 類化合物。采用MRM 和MS3策略的定量限分別為2 ～ 6 μg/kg 和4 ～ 10 μg/kg，基質(zhì)效應(yīng)分別為-9% ～ 11%和-13% ～ 12%，準(zhǔn)確度在90% ～ 108%之間，方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠。

吡咯里西啶類生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物中一類毒性成分，廣泛分布于菊科、豆科、紫草科植物中。將有毒物種作為代茶飲、傳統(tǒng)藥物或食用含有PAs 種子污染的谷物可能會(huì)引起人體毒性反應(yīng)。Chung 等[68]通過(guò)對(duì)15 個(gè)PAs 和13個(gè)N-氧化PAs 分析，對(duì)比了MRM、MS3和差分離子遷移譜（differential ion mobility spectrometry，DMS）對(duì)PAs 的選擇性和定量分析能力。結(jié)果顯示，MS3與DMS 具有更好的選擇性，但受限于循環(huán)時(shí)間，更適合于監(jiān)測(cè)高毒性的特定PAs。烏頭屬植物的根莖常被用于藥酒炮制，烏頭堿是其中的有效成分和毒性成分，需建立特異性和選擇性的分析方式對(duì)其進(jìn)行分析。He 等[69]建立了藥酒中烏頭堿的LC-MRM3分析方法，烏頭堿在0.1 ～ 500 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，定量限和檢測(cè)限分別為0.03 和0.01 ng/mL，定量準(zhǔn)確度高，方法精密可靠，并應(yīng)用于藥酒樣品檢測(cè)中，與LC-MRM 的定量結(jié)果基本一致。而且，由于其多次篩選的特性，MRM3可有效去除基質(zhì)中的干擾信號(hào)，提升烏頭堿檢測(cè)的選擇性和靈敏度。

食物過(guò)敏在過(guò)去幾十年中已成為全球廣泛關(guān)注的問(wèn)題。甲殼類、貝類、雞蛋、堅(jiān)果和小麥/麩質(zhì)等是過(guò)敏患者的高風(fēng)險(xiǎn)食物，對(duì)食物中的過(guò)敏原進(jìn)行定量并給出指導(dǎo)含量對(duì)于保障食品安全至關(guān)重要。由于ELISA 和PCR 檢測(cè)過(guò)敏原具有局限性，LC-MS/MS 逐步成為特異性、穩(wěn)健的蛋白質(zhì)檢測(cè)方式。但由于基質(zhì)的復(fù)雜性或蛋白豐度低等原因，仍需建立選擇性更強(qiáng)、靈敏度更高的檢測(cè)方式。Korte 等[70]基于自下而上（bottom-up）蛋白質(zhì)組分析的策略，采用LC-MS/MS、LC-MRM3和LC-MRM對(duì)甲殼類食物進(jìn)行非靶向與靶向蛋白組學(xué)結(jié)合分析，尋找不同甲殼類動(dòng)物的生物標(biāo)志物。MRM3的檢測(cè)限比MRM 降低為原來(lái)2.5%，還顯著提升了肽段分析的專屬性和特異性。此外，該學(xué)者還將LC-MRM3用于堅(jiān)果類食物的靶向蛋白定量分析，結(jié)果同樣表明MRM3具有高選擇性和高靈敏度的特性[31]。Bargen 等[71-72]建立了牛肉中馬肉、豬肉等摻偽食品的特異性檢測(cè)方法，采用LC-MRM3對(duì)特異性多肽進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)牛肉中0.13% ～0.24%的豬肉或馬肉添加。以上結(jié)果顯示了LCMRM3技術(shù)在食品中過(guò)敏原污染物或非法成分添加的高靈敏檢測(cè)方面的巨大潛力。

3.5 環(huán)境分析

工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各方面的發(fā)展給人類生活帶來(lái)便利的同時(shí)，也給環(huán)境帶來(lái)了污染。環(huán)境分析基質(zhì)如水、淤泥等組成復(fù)雜，干擾多，待測(cè)物含量低，因此靈敏度高、選擇性好的分析方法對(duì)復(fù)雜環(huán)境基質(zhì)中的污染物分析至關(guān)重要。然而傳統(tǒng)的LCMRM分析策略在某些應(yīng)用場(chǎng)景下也無(wú)法實(shí)現(xiàn)高靈敏的檢測(cè)。LC-MRM3由于其高選擇性和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，被逐步應(yīng)用于環(huán)境基質(zhì)定量分析中。研究者借助LC-MRM3技術(shù)對(duì)廢水中的X 射線造影劑[30]或甲殼類動(dòng)物中不同的新興污染物[21]進(jìn)行測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜環(huán)境基質(zhì)中污染物的痕量分析，相較于LC-MRM，其選擇性和靈敏度均顯著提升。在此基礎(chǔ)上，Guironnet 等[4]建立了淤泥中5 個(gè)β-內(nèi)酰胺類新興污染物的LC-MRM3分析方法，LLOQ 在0.8 ～ 14.7 ng/g之間，定量結(jié)果準(zhǔn)確，且MRM3可以有效去除基質(zhì)干擾，具有更好的檢測(cè)特異性。以上結(jié)果表明，高靈敏和高選擇性的LC-MRM3定量分析策略在復(fù)雜的環(huán)境基質(zhì)分析中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。

除上述應(yīng)用領(lǐng)域外，LC-MRM3定量分析策略也可用于組學(xué)研究中。Hartung 等[73]結(jié)合MRM 和MRM3建立了包含環(huán)氧合酶和脂氧合酶介導(dǎo)的花生四烯酸信號(hào)通路的靶向蛋白組學(xué)方法，并將其與脂氧化物代謝組學(xué)方法結(jié)合，首次在單個(gè)樣本中通過(guò)LC-MS/MS 表征了免疫細(xì)胞中的花生四烯酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前MRM3在組學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少，但該研究顯示了MRM3策略在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析中的應(yīng)用前景。

4 總結(jié)與展望

LC-MS/MS 具有靈敏度高、選擇性好、通量高等優(yōu)勢(shì)。然而，在僅采用MS1或MS2定量分析復(fù)雜基質(zhì)或低豐度化合物時(shí)，其靈敏度和選擇性仍難以滿足要求。離子阱可以實(shí)現(xiàn)MS3裂解，目標(biāo)分析物相關(guān)離子經(jīng)多級(jí)質(zhì)譜篩選，可以降低共流出物或背景噪聲干擾，顯著增強(qiáng)選擇性和靈敏度，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中低豐度分析物的檢出。雖然采用傳統(tǒng)3D-IT 的LC-MS3定量分析也有報(bào)道[74-75]，但由于3D-IT 的空間電荷效應(yīng)更明顯，所以線性范圍通常在2 個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)，定量能力有限。LIT 串聯(lián)質(zhì)譜在LC-MS3定量分析中更為常用。如Arioli 等[76]基于LTQ Orbitrap MS 的MSn掃描功能建立了人尿液中游離皮質(zhì)醇及其15種內(nèi)源性代謝物的定量分析方法；Park 等[77]采用高分辨率的Orbitrap Eclipse Tribrid MS 建立了基于MS3掃描的單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析方法，實(shí)現(xiàn)了高通量、高靈敏的分析?；赒trap-MS 的MRM3定量分析策略具有更高的靈敏度和選擇性，去除干擾能力更強(qiáng)，在小分子類和多肽蛋白質(zhì)類成分的定量分析中均有廣泛應(yīng)用。此外，由于選擇性和靈敏度的提升，LC-MRM3可以減少樣品用量以及簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程。因此，LCMRM3常被用于如血漿、尿液、細(xì)胞、頭發(fā)等生物基質(zhì)，環(huán)境樣品或食品等復(fù)雜基質(zhì)中的化學(xué)成分痕量定量分析中，顯示出非常好的應(yīng)用前景。

然而，LC-MRM3方法仍存在一些有待改進(jìn)之處：（1）為獲得更好的質(zhì)譜響應(yīng)和靈敏度，MRM3方法中LIT填充時(shí)間和激發(fā)時(shí)間設(shè)置導(dǎo)致MRM3掃描的循環(huán)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法達(dá)到與MRM 相當(dāng)?shù)姆治鐾?。通過(guò)設(shè)置分段掃描的方式，即將不同化合物根據(jù)保留時(shí)間設(shè)置為多個(gè)窗口，每個(gè)窗口內(nèi)設(shè)置相應(yīng)的MRM3方法，可以在一定程度上改善該缺陷。（2）低質(zhì)量端檢測(cè)能力差。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量小于200 D 內(nèi)的化合物，由于背景噪音累積的影響，可能會(huì)造成靈敏度的缺失導(dǎo)致定量限升高，而且這種現(xiàn)象可能會(huì)隨著離子阱累積時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步加劇。利用分析物與流動(dòng)相添加劑形成的加合離子或結(jié)合金屬離子絡(luò)合物構(gòu)建離子對(duì)可以提高分析物的選擇性，改善相對(duì)分子質(zhì)量較小的化合物靈敏度降低的問(wèn)題，從而降低定量限和檢測(cè)限。（3）線性范圍窄。相較于MRM 能夠?qū)崿F(xiàn)大約5 個(gè)數(shù)量級(jí)的線性監(jiān)測(cè)，MRM3掃描基本只能實(shí)現(xiàn)2 ～ 3 個(gè)數(shù)量級(jí)線性范圍內(nèi)的定量分析[70]。在高真空環(huán)境中，離子占空比有限，盡管LIT 在傳統(tǒng)3D-IT的基礎(chǔ)上提升了容納電荷的能力，但由于空間限制，在較高濃度下，離子阱過(guò)度填充，導(dǎo)致質(zhì)譜信號(hào)受到抑制，峰形不佳，從而影響線性范圍。