去甲斑蝥素通過(guò)誘導(dǎo)自噬體聚集促使乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

夏 源，姜慶玲，王曉婷，李敏敬，鄭秋生1，2，*，李德芳1，2，**

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆植物藥物資源與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832061；2濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院山東省高等學(xué)校-中藥活性成分生物合成與靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)特色實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264003；3濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院煙臺(tái)市腫瘤代謝中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264003）

乳腺癌是全球女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，年增長(zhǎng)幅度約為3.1%[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是最嚴(yán)重的一種乳腺癌亞型，在乳腺癌患者中占15% ～ 20%[2]。與其他乳腺癌相比，TNBC 患者發(fā)病年齡較小，且惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有預(yù)后差、易復(fù)發(fā)、患者總體生存期短等特點(diǎn)，常見(jiàn)的內(nèi)分泌治療及針對(duì)HER2 的分子靶向藥物治療對(duì)TNBC 患者無(wú)效，并且患者也易對(duì)化療耐受[3-4]。因此尋找能有效治療三陰性乳腺癌的藥物是十分必要的。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中在某些因素的作用下通過(guò)基因調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，旨在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡受多種蛋白調(diào)節(jié)，其中Bcl-2 家族和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族（caspases）最受關(guān)注。眾所周知，Bcl-2家族包含兩種類(lèi)型的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，即促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bid 或Bad）和抗凋亡蛋白（Mcl-1、Bcl-2 和Bcl-xl）。其中，線粒體相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白家族和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）家族在眾多凋亡調(diào)控基因中最受關(guān)注。其中，Bax 是細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)反應(yīng)所必需的，通過(guò)轉(zhuǎn)位到線粒體形成同源二聚體或多聚體，引起線粒體膜通透性增加及促凋亡因子釋放，并最終啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。相反，Bcl-2 通過(guò)與其形成更穩(wěn)定的Bcl-2和Bax異源二聚體來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[5]。

線粒體在細(xì)胞存亡機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力源，參與細(xì)胞的基本功能，包括ATP 的產(chǎn)生、Ca2+的調(diào)節(jié)、ROS 的產(chǎn)生和清除，此外，還參與了caspase 蛋白家族的激活。因此，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激在很大程度上也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6-7]。例如，erastin樣化合物X1 可通過(guò)誘導(dǎo)ROS 增加，線粒體膜電位下降從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8]；此外，pPolyHb 通過(guò)調(diào)節(jié)PINK1-Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬途徑保護(hù)心肌H9C2 細(xì)胞免受缺血再灌注損傷[9]；亦有報(bào)道稱(chēng)酮康唑可通過(guò)下調(diào)COX-2，誘導(dǎo)PINK1 積累和Parkin的線粒體易位，最終激活肝癌細(xì)胞中的線粒體自噬[10]。到目前為止，有越來(lái)越多的證據(jù)表明PINK1/Parkin 可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬來(lái)清除受損或功能障礙的線粒體[11-12]。因此，線粒體自噬是移除受損線粒體的質(zhì)量控制方式。

Meta 分析證實(shí)中醫(yī)藥治療可有效提高TNBC患者5 年生存率降低TNBC 的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率[13]。NCTD 是皰狀甲蟲(chóng)中分離出的斑蝥素的合成去甲基類(lèi)似物[14]。與斑蝥素相比，NCTD 降低了原有的毒性，基本消除了不良反應(yīng)，抗腫瘤作用增強(qiáng)；此外，NCTD 對(duì)癌腫瘤細(xì)胞的毒性明顯高于正常細(xì)胞；因此，NCTD 在腫瘤治療中更具吸引力，目前已用于肝癌、食管癌、胃癌以及白血病的臨床治療[15]；此外，NCTD 也可以通過(guò)靶向miR-873/CDK3 調(diào)節(jié)ERα 信號(hào)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移達(dá)到治療的目的[16]，然而NCTD 在治療乳腺癌方面鮮有報(bào)道。

本研究旨在證明NCTD 通過(guò)PINK1/Parkin 信號(hào)通路誘導(dǎo)線粒體自噬，引起自噬小體蓄積，最終導(dǎo)致MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡的機(jī)制，以期為NCTD在治療TNBC的應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

NCTD（北京百靈威科技有限公司）；磷酸化MEK1/2 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；cyclin B1、p-21、CDK1、磷酸化乙酰輔酶A 羧化酶、磷酸化CDK1（英國(guó)Abcam 公司）；Jun、p-53、JNK、磷酸化JNK、GAPDH、CDC25C、山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；磷酸化AMPKa1-T183/AMPKa2-T1728（武漢愛(ài)博泰克生物公司）；抗p-ERK1/2 抗體，LC3α/β 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司）；Annexin V FITC/PI 試劑盒、JC-1檢測(cè)試劑盒、ROS 檢測(cè)試劑盒，RIPA 高效裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、1 × 蛋白磷酸酶抑制劑、BCA蛋白分析試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Lipofectamine 3000（美國(guó)Invitrogen 公司）；細(xì)胞線粒體提取試劑盒（中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀 器

酶標(biāo)儀（奧地利Tecan Austria GmbH 公司）；光學(xué)顯微鏡（意大利Optika 公司）；熒光顯微鏡（德國(guó)Leica Microsystems CMS GmbH 公司）；FACSCanto II 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson 公司）；共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（德國(guó)Jena公司）。

1.3 細(xì) 胞

三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞來(lái)源于（江蘇凱基生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞在含有10%血清以及1%雙抗（最終濃度為青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）的L-15 完全培養(yǎng)基中，置5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70% ～80%時(shí)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用L-15完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至每毫升7.5 × 104個(gè)。取96 孔板，設(shè)置只有培養(yǎng)基的空白對(duì)照組、對(duì)照組和處理組，每組3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞懸液200 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁。吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞加入NCTD 的終濃度為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μmol/L，空白對(duì)照組和對(duì)照組分別加入新鮮的L-15完全培養(yǎng)基，各孔均加入200 μL，培養(yǎng)48 h 后吸除培養(yǎng)基，每孔加入含10% CCK-8 試劑的完全培養(yǎng)基100 μL，37 ℃，5% CO2條件下繼續(xù)孵育2 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm 波長(zhǎng)處的吸收度。計(jì)算去甲斑蝥素作用于細(xì)胞48 h 后的各組的抑制率。抑制率=[1-(Atest-Ablank)/(Acontrol-Ablank)] × 100%。

2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用L-15 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至每毫升100 個(gè)。取6 孔板，設(shè)置對(duì)照組和處理組，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 ～ 4 d，每2天換液1次。吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞加入NCTD 的終濃度為20、50、80 μmol/L，對(duì)照組則加入新鮮的L-15 完全培養(yǎng)基，各孔均加入2 mL，培養(yǎng)48 h 后吸除培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基2 mL，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)15 d 左右，每2 天換液1 次。待細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)群落時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次，加入組織固定液，每孔700 μL，室溫靜置15 min；吸棄固定液，PBS 清洗2 次，加入1%結(jié)晶紫染色溶液，每孔1 mL，室溫靜置15 min；PBS 清洗至孔中無(wú)多余結(jié)晶紫染色液殘留，將6 孔板置于陰涼通風(fēng)處使之揮發(fā)多余水分，待板底徹底干燥后即可拍照。進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

2.4 Hoechst 33258 熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用L-15 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至每毫升1.0 × 104個(gè)。取6孔板，設(shè)置對(duì)照組和處理組，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁。吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞加入NCTD 的終濃度為20、50、80 μmol/L，對(duì)照組加入新鮮的L-15 完全培養(yǎng)基，各孔均加入2 mL，培養(yǎng)48 h 后吸除培養(yǎng)基。PBS 清洗3 次，固定液（甲醇-乙酸，3∶1）固定15 min；吸棄固定液，于避光條件下用Hoechst 33258（10 μg/mL）染色10 min；吸除染液，PBS 清洗3 次。最后用PBS 1mL浸潤(rùn)細(xì)胞，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用L-15 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至每毫升2.5 × 105個(gè)。取6 孔板，設(shè)置對(duì)照組和處理組，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞完全貼壁。吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞加入NCTD 的終濃度為20、50、80 μmol/L，對(duì)照組加入新鮮的L-15 完全培養(yǎng)基，各孔均加入2 mL，培養(yǎng)48 h 后吸除培養(yǎng)基。胰酶消化，離心收集細(xì)胞沉淀，結(jié)合緩沖液重懸，每孔500 μL。根據(jù)Annexin V-FITC/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)指示，各管先加入FITC（5 μL）孵育10 min，再加入PI（5 μL）孵育5 min。染色結(jié)束，立即上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)用該試劑盒檢測(cè)自噬抑制劑對(duì)凋亡的影響時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、50 μmol/L NCTD 處理組、50 μmol/L NCTD + 抑制劑組，其余操作步驟與上述相同。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用L-15 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至每毫升2.5 × 105個(gè)。取6 孔板，設(shè)置對(duì)照組和處理組，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞完全貼壁。吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞加入NCTD的終濃度為20、50、80 μmol/L，對(duì)照組加入新鮮的L-15完全培養(yǎng)基，各孔均加入2 mL，培養(yǎng)48 h 后吸除培養(yǎng)基。胰酶消化，離心收集細(xì)胞沉淀，染料（完全培養(yǎng)基:1 × JC-1染料緩沖液=1∶1）重懸，每管500 μL，37 ℃避光孵育20 min。離心沉淀細(xì)胞，JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，完全培養(yǎng)基500 μL 重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位的變化。每個(gè)樣本中均收集10 000個(gè)細(xì)胞用于檢測(cè)分析，紅色/綠色熒光強(qiáng)度之比用于表示線粒體膜電位變化。

2.7 透射電子顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬體變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

于100 mm培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，密度為每皿6 ×105個(gè)，設(shè)置對(duì)照組和處理組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁。吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞用NCTD（終濃度為50 μmol/L）處理6 h，12 h；對(duì)照組加入新鮮L-15 完全培養(yǎng)基，各皿均加入5 mL。培養(yǎng)48 h 后吸除液體，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，保證收集細(xì)胞數(shù)量為每組1 × 105～ 1 × 106個(gè)。離心收集細(xì)胞沉淀，沿管壁緩慢加入固定液（注意防止將細(xì)胞團(tuán)塊吹散）1 mL，4 ℃冰箱過(guò)夜。取出細(xì)胞，吸棄固定液，0.1 mol/L PBS 清洗兩遍，第1 遍約15 min，第2遍于4 ℃冰箱過(guò)夜。再次取出細(xì)胞，0.1 mol/L PBS清洗1遍，約15 min，吸棄PBS，加入適宜體積的1%鋨酸，置4 ℃冰箱固定90 min，每隔20 min 晃動(dòng)容器，使細(xì)胞充分接觸細(xì)胞團(tuán)塊。固定完畢后，棄去固定液，0.1 mol/L PBS 清洗3 次，每次15 min。接著用50%乙醇脫水，4 ℃處理15 min；70%乙醇脫水，4 ℃處理3 h；80%乙醇脫水，室溫處理15 min；95%乙醇脫水，室溫處理15 min；無(wú)水乙醇脫水，室溫處理15 min，重復(fù)3 次。丙酮置換2 次，共計(jì)15 min，注意避免組織暴露在空氣中；丙酮-浸透劑（2∶1），室溫1 h；丙酮-浸透劑（1∶2），室溫2 h；純浸透劑，35 ℃恒溫箱內(nèi)開(kāi)蓋浸透（防止細(xì)胞團(tuán)塊漂浮在液面）。包埋樣品；梯度升溫37 ℃，12 h；45 ℃，12 h；60 ℃，24 h。樣品準(zhǔn)備完畢后用透射電鏡拍攝自噬小體即可。

2.8 轉(zhuǎn)染mCherry-EGFP-LC3檢測(cè)細(xì)胞自噬流變化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

于40 mm 培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，密度為每皿6 ×105個(gè)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞完全貼壁，轉(zhuǎn)染mCherry-EGFP-LC3質(zhì)粒。具體操作如下。

準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染混合液，A 液：Opti-MEM 125 μL，Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑7 μL；B 液：Opti-MEM 125 μL，DNA 4 μg，P3000 試劑8 μL。配制好A，B液以后，等體積混勻，室溫靜置15 min。將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸除，加入無(wú)雙抗培養(yǎng)基1.5 mL，再加入AB 混合液，輕輕混勻，于培養(yǎng)箱（37 ℃，CO2）中培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)染完成后，將MDA-MB-231 細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用L-15 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至每毫升1.0 × 105個(gè)，接種到共聚焦小皿上（每皿1 mL），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁。吸除培養(yǎng)基，加入終濃度為50 μmol/L NCTD，給藥6 h 或12 h 后移除藥液。PBS 清洗2 遍，加入適量4%細(xì)胞固定液，固定15 min。吸除固定液，PBS 清洗2 遍，加入DAPI 染液，室溫孵育6 min。吸除DAPI 染液，PBS 洗滌3次，每次5 min。最后加入剛好沒(méi)過(guò)細(xì)胞的少量PBS，置于激光共聚焦下拍片即可。

2.9 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 細(xì)胞消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。于100 mm 培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，密度為每皿6 × 105個(gè)，設(shè)置對(duì)照組和處理組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞完全貼壁。

提取細(xì)胞總蛋白：吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞加入NCTD（終濃度為20、50、80 μmol/L），對(duì)照組加入新鮮L-15 完全培養(yǎng)基，各皿均加入5 mL。培養(yǎng)48 h 后吸除液體，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min；細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清液。

提取線粒體蛋白及胞漿蛋白：吸除培養(yǎng)基，處理組細(xì)胞加入NCTD（終濃度50 μmol/L），對(duì)照組加入新鮮L-15 完全培養(yǎng)基，各皿均加入5 mL。培養(yǎng)48 h 后吸除液體，消化、離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照細(xì)胞線粒體提取試劑盒指示提取線粒體蛋白和胞漿蛋白。

根據(jù)BCA 蛋白分析試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)節(jié)一致，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳90 V，30 min；120 V，1 h。電轉(zhuǎn)210 mA，120 min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST 清洗2 遍，4 ℃一抗孵育過(guò)夜；一抗孵育結(jié)束后，TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育40 min；結(jié)束后，TBST 洗膜3 次，使用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以來(lái)表示。使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用了單因素方差分析（One-Way ANOVA）或T 檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算統(tǒng)計(jì)差異，并在采用單因素方差分析后，進(jìn)行Tukey 事后檢驗(yàn)，P＜ 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 NCTD 對(duì)人MDA-MB-231 細(xì)胞存在細(xì)胞毒性作用

為評(píng)估NCTD 是否具有抗乳腺癌的作用，用不同濃度NCTD （10 ～ 100 μmol/L）處理MDA-MB-231 細(xì)胞，檢測(cè)NCTD 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞毒性作用。如圖1-A 所示，NCTD 處理后MDA-MB-231 細(xì)胞的存活率降低。此外，克隆形成減少也證實(shí)NCTD 顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖（圖1-B），提示NCTD 對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。為進(jìn)一步檢測(cè)NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制，用Hoechst 33258 染色分析NCTD 是否誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡。如圖1-C所示，細(xì)胞經(jīng)NCTD處理后，均出現(xiàn)典型的凋亡小體、染色質(zhì)濃縮、核膜溶解、細(xì)胞質(zhì)皺縮等特征，這一現(xiàn)象初步表明NCTD 可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。隨后，使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析了NCTD 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響。如圖1-D所示：不同濃度NCTD 處理后，MDA-MB-231 細(xì)胞總凋亡比例分別為：8.2%、18.1%以及22.7%。綜上所述，NCTD 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞存在生長(zhǎng)抑制作用，且可誘導(dǎo)其凋亡。

Figure1 Toxicity of norcantharidin (NCTD) on MDA-MB-231 cells

3.2 NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改變

為了探究NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。如圖2-A 所示，MDA-MB-231 細(xì)胞在用NCTD 處理48 h 以后，Bcl-2，MCL-1 表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)升高，且呈劑量依賴(lài)性。此外，經(jīng)NCTD 處理以后，凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-9，cleaved-caspase-3 以及cleaved-PARP/PARP 表達(dá)水平升高（圖2-B）。蛋白免疫印跡法證明NCTD 通過(guò)改變凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

Figure2 Effects of NCTD on the expression of apoptosis-related proteins

3.3 NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞線粒體功能障礙

線粒體膜電位丟失是細(xì)胞死亡過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)JC-1 染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同濃度NCTD 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞線粒體膜電位的影響。

凋亡引發(fā)的線粒體膜電位的降低表現(xiàn)為紅色/綠色熒光強(qiáng)度的降低。如圖3-A所示：與對(duì)照組相比，MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)不同濃度NCTD 處理48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)高綠色和低橙色的熒光，初步表明NCTD 可以降低MDA-MB-231 細(xì)胞的線粒體膜電位。此外，如圖3-B 所示，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證明NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞線粒體膜電位降低，且呈劑量依賴(lài)性。NCTD 引起線粒體膜電位的去極化，提示其可能與MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡有關(guān)。為了探究NCTD 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞線粒體功能的影響，本研究進(jìn)一步測(cè)量了NCTD 處理的MDAMB-231 細(xì)胞的線粒體ROS 水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比， NCTD處理組細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生更多的ROS（圖3-C）。綜上所述，該實(shí)驗(yàn)證明NCTD 能夠引發(fā)MDA-MB-231細(xì)胞的線粒體功能損害。

Figure3 Effects of NCTD on mitochondrial dysfunction

3.4 NCTD 通過(guò)PINK1/Parkin 信號(hào)通路誘導(dǎo)線粒體自噬

本研究通過(guò)透射電鏡觀察各組細(xì)胞中自噬特異性結(jié)構(gòu)的數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L NCTD分別處理12 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞質(zhì)中可以觀察到清晰的自噬泡（圖4-A）。隨后，本研究分析了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NCTD顯著促進(jìn)LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II，同時(shí)自噬體形成相關(guān)蛋白Atg5 的表達(dá)也升高（圖4-B），提示NCTD處理后的細(xì)胞可能發(fā)生自噬。已有研究表明Parkin 的線粒體易位是線粒體自噬的標(biāo)志[17]，因此本研究檢測(cè)了NCTD處理的細(xì)胞中Parkin的線粒體易位情況，觀察到NCTD 處理的MDA-MB-231 細(xì)胞的線粒體富含Parkin 蛋白（圖4-C）。鑒于PINK1/Parkin信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體自噬中的關(guān)鍵調(diào)控作用[18]，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了NCTD 處理對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞中PINK1 表達(dá)的影響，如圖4-D所示，NCTD 處理增加了MDA-MB-231 細(xì)胞中PINK1 的表達(dá)。綜上所述，本研究提出NCTD 增強(qiáng)線粒體Parkin 募集，通過(guò)PINK1/Parkin 信號(hào)通路促進(jìn)線粒體自噬誘導(dǎo)MDA-MB-231凋亡。

3.5 NCTD誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬流阻滯

NCTD 已被證明能誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞發(fā)生自噬，本研究旨在通過(guò)mCherry-EGFP-LC3 報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)一步觀察NCTD 處理的MDA-MB-231 細(xì)胞中自噬流的狀態(tài)。該融合蛋白在自噬小體階段呈mCherry+EGFP+，在自噬溶酶體階段中呈mCherry+EGFP-。如圖5-A 所示，隨著NCTD 處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中自噬小體數(shù)量明顯增加，而自噬溶酶體數(shù)量逐漸減少，表明NCTD 可能通過(guò)促進(jìn)自噬小體的形成調(diào)控MDA-MB-231 細(xì)胞自噬?？紤]到與自噬特異性底物p62 結(jié)合的泛素化蛋白可通過(guò)自噬小體-自噬溶酶體途徑降解[19-21]，因此，本研究檢測(cè)了p62 和泛素化蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與LC3-II 表達(dá)積累相一致，p62 表達(dá)水平和線粒體蛋白的泛素化水平在NCTD 處理的MDA-MB-231 細(xì)胞中升高（圖5-B，圖5-C），進(jìn)一步證明自噬溶酶體數(shù)量減少，MDA-MB-231細(xì)胞自噬通量受損。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究提出NCTD 通過(guò)促進(jìn)自噬小體的形成和抑制自噬溶酶體形成的來(lái)調(diào)控MDAMB-231細(xì)胞自噬。

Figure5 Effect of NCTD on autophagy flow in MDA-MB-231cells

3.6 NCTD 引發(fā)自噬小體積累導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探究NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的自噬調(diào)控機(jī)制，本研究選取自噬抑制劑CQ 和3-MA，聯(lián)合應(yīng)用NCTD，檢測(cè)它們對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。CQ 能夠破壞自噬小體與溶酶體融合并導(dǎo)致自噬小體積累，而3-MA 主要抑制自噬啟動(dòng)和自噬小體形成。MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的流式分析結(jié)果顯示NCTD 聯(lián)合使用CQ 可以顯著加重NCTD 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖6-A）；相反，NCTD 聯(lián)合使用3-MA 顯著降低了NCTD 處理后MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡（圖6-B）；該結(jié)果進(jìn)一步證明了自噬小體的積累在NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡過(guò)程中的調(diào)控作用。綜上所述，NCTD 通過(guò)啟動(dòng)線粒體自噬和阻止自噬小體-溶酶體融合誘導(dǎo)自噬小體積累,導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

Figure6 NCTD leads to apoptosis by inducing the accumulation of autophagosomes

4 討 論

本研究證實(shí)NCTD 可誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞自噬小體蓄積，并最終誘導(dǎo)其凋亡。本研究首次分析了NCTD 處理后細(xì)胞自噬依賴(lài)性凋亡的分子機(jī)制，為MDA-MB-231 細(xì)胞的治療提供了理論依據(jù)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，NCTD 可抑制人腎小球系膜細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞和人口腔鱗狀癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[22-24]。為評(píng)價(jià)NCTD 是否具有抗乳腺癌的作用，本實(shí)驗(yàn)首先分析了NCTD 對(duì)MDAMB-231 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)NCTD 處理后MDA-MB-231 細(xì)胞的存活率降低，克隆形成減少，證實(shí)NCTD 可以顯著抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在因素之一[25]。在本研究中，MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)NCTD 處理后凋亡細(xì)胞比例增加，并且凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化明顯，提示NCTD 可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力源，參與細(xì)胞的基本功能，包括ROS的產(chǎn)生和清除、細(xì)胞凋亡以及caspase家族的激活等，對(duì)細(xì)胞的存活起著至關(guān)重要的作用。因此，線粒體功能障礙在很大程度上與衰老、腫瘤、年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性和代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[26]。同時(shí)研究表明，ROS的增加會(huì)導(dǎo)致線粒體的破壞，線粒體膜電位降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27-28]。在本實(shí)驗(yàn)中，NCTD 處理的MDA-MB-231 細(xì)胞中線粒體膜電位下降，并伴有線粒體ROS生成增加，該結(jié)果提示NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡與線粒體功能障礙密切相關(guān)。

線粒體自噬是線粒體質(zhì)量控制的一種形式，用于去除功能不佳的線粒體[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，PINK1/Parkin 信號(hào)通路是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體自噬的關(guān)鍵信號(hào)通路[18]。其中，活化的Parkin 作為線粒體自噬信號(hào)的“增強(qiáng)子”，擴(kuò)大自噬信號(hào)，促進(jìn)受損線粒體的降解；PINK1作為受損線粒體的分子傳感器，觸發(fā)線粒體自噬的起始信號(hào)，并將Parkin 向受損的線粒體募集[17]。本研究發(fā)現(xiàn)MDAMB-231 細(xì)胞經(jīng)NCTD 處理后，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量自噬特異性結(jié)構(gòu)；此外，高表達(dá)的自噬相關(guān)標(biāo)志物（LC3-II/LC3-I，Atg5 和PINK1）以及Parkin 的線粒體易位進(jìn)一步證實(shí)了NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞的線粒體自噬。

自噬的誘導(dǎo)通常被認(rèn)為是營(yíng)養(yǎng)物再循環(huán)和細(xì)胞毒性物質(zhì)清除的適應(yīng)性和細(xì)胞保護(hù)性機(jī)制，在不同生理狀態(tài)下可以抑制或刺激細(xì)胞凋亡[[30]。通常情況下，自噬通量的形成是實(shí)現(xiàn)自噬的必要前提[31-32]。而自噬通量阻斷誘導(dǎo)的自噬小體蓄積可作為一種新的調(diào)節(jié)方式參與細(xì)胞凋亡，其典型特征是P62和泛素化蛋白表達(dá)增加[33-35]。本研究發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231 細(xì)胞經(jīng)NCTD 處理后，自噬通量阻斷，自噬小體蓄積，并且出現(xiàn)較高的凋亡率。此外，P62的表達(dá)水平和線粒體蛋白的泛素化水平也升高。結(jié)合上述結(jié)果說(shuō)明NCTD 可以抑制MDAMB-231 細(xì)胞中自噬小體與溶酶體的融合，并最終導(dǎo)致自噬小體蓄積。

然而，本研究還存在一定的研究局限性。本研究所使用的mCherry-GFP-LC3 報(bào)告質(zhì)粒不能指示線粒體自噬流水平，故無(wú)法明確NCTD 誘導(dǎo)的線粒體自噬與自噬體累積之間的聯(lián)系。此外，對(duì)于NCTD 在三陰性乳腺癌中的抗腫瘤作用，僅在一種人TNBC 細(xì)胞MDA-MB-231 中進(jìn)行了評(píng)價(jià)；同時(shí)，該研究缺少NCTD 的動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，因此，本課題組將在后續(xù)同類(lèi)型研究中進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)方案。基于上述發(fā)現(xiàn)，本研究認(rèn)為NCTD 是通過(guò)引起細(xì)胞中自噬小體積累從而誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡。隨后，通過(guò)聯(lián)合使用自噬抑制劑來(lái)驗(yàn)證假設(shè)。3-MA 能抑制自噬啟動(dòng)和自噬小體形成，而CQ 能夠破壞自噬小體與溶酶體融合并導(dǎo)致自噬小體積累。在本研究中，3-MA 降低了NCTD誘導(dǎo)的凋亡，而CQ 的聯(lián)合使用顯著促進(jìn)了NCTD誘導(dǎo)的凋亡，該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了NCTD 誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡與自噬小體的積累相關(guān)。該研究結(jié)果為NCTD 在TNBC 治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。