多黏菌素E甲磺酸鈉的色譜指紋圖譜與質(zhì)量一致性研究

李 宣，黃敏文，周 杰，袁耀佐，杭太俊

（1江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，南京 210019；2國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥物雜質(zhì)譜研究重點實驗室，南京 210019；3中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210009；4正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，連云港 222062）

隨著全球耐藥問題的日益嚴(yán)峻，多黏菌素類藥物成為臨床上治療嚴(yán)重革蘭氏陰性耐藥菌感染的最后一道防線[1]，同時也被WHO 列為最高優(yōu)先至關(guān)重要的抗微生物藥物。多黏菌素E 甲磺酸鈉（colistimethate sodium，CMS）與其他類抗生素或抗菌藥不會產(chǎn)生交叉耐藥性，是當(dāng)前治療多重耐藥銅綠假單胞菌及其他革蘭氏陰性菌引起感染的首選藥物。目前多黏菌素E 甲磺酸鈉在國外使用廣泛，在歐洲、美國、日本、泰國[2]等相繼上市，在國內(nèi)，江蘇正大天晴藥業(yè)首先進(jìn)行仿制并獲得了國家藥品監(jiān)督管理局的上市批準(zhǔn)。

多黏菌素E 甲磺酸鈉是多黏菌素E (polymyxin E，colistin)發(fā)生不同程度甲磺酸化后的半發(fā)酵半合成化合物，多黏菌素E 本身為一種混合物，其成分較復(fù)雜，主要組分為多黏菌素E1 和E2，因此CMS主要組分為多黏菌素E1 甲磺酸鈉（CMS E1）和多黏菌素E2甲磺酸鈉（CMS E2）。原研原料藥與國產(chǎn)仿制藥在發(fā)酵及提取純化工藝、合成工藝、純化分離等諸多方面存在不同，為了考察兩者質(zhì)量一致性，進(jìn)一步確保藥物安全性與有效性，需建立質(zhì)量一致性評價方法及指標(biāo)，加強(qiáng)對該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

EP10.3[3]、USP43[4]和JP18[5]均收載了多黏菌素E甲磺酸鈉，僅EP控制了組分和有關(guān)物質(zhì)。然而多黏菌素E甲磺酸鈉為復(fù)雜組分抗生素，除了EP收載的6 個特定組分（CMS E1ASM8、CMS E1ASM6、CMS E1ASM4、CMS E2ASM8、CMS E2ASM6、CMS E2ASM4）之外，還有近百個結(jié)構(gòu)相似和理化性質(zhì)相似的組分，這些組分同樣具有抗菌效果?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)受方法開發(fā)難度所限，僅選擇控制了六個指標(biāo)性組分的相對含量以及來源于多黏菌素E1和多黏菌素E2 組分的總含量，然而這種代表性組分的選擇是存在一定隨機(jī)性的，無法涵蓋所有組分的具體情況，因而也缺乏療效相關(guān)性。

對復(fù)雜組分抗生素的質(zhì)量一致性評價，如何選擇合適的方法進(jìn)行全面評價一直是一個難點。以本文研究對象多黏菌素E甲磺酸鈉為例，僅以幾個指標(biāo)性組分而忽略近百個其他組分來判斷仿制藥與原研藥的一致性是不充分的。為了彌補歐洲藥典對多黏菌素E 甲磺酸鈉眾多組分及有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與歸屬研究的不足，本研究在EP10.3 描述的色譜條件基礎(chǔ)上，建立了二維液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫的方法，首次成功地實現(xiàn)了對組分及有關(guān)物質(zhì)的研究。通過所建立的方法快速高效地推定了CMS 中99 個化合物的結(jié)構(gòu)，對組分及有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了較為全面深入的研究。通過對多黏菌素E 甲磺酸鈉中的成分峰進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推定及來源歸屬，確定其組分峰有47 個。若將每個組分峰的含量進(jìn)行逐一對比，雖然數(shù)據(jù)更加全面，但是對于動輒近百個組分的復(fù)雜抗生素而言，工作量較大，需要結(jié)合其他更為整體、準(zhǔn)確的評價手段，因此，本研究引入了指紋圖譜。

在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域廣泛采用的指紋圖譜技術(shù)，是中藥常用的質(zhì)量控制手段[6-8]。指紋圖譜能較為全面地反映復(fù)雜組分藥物及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價。相似度評價軟件可以對樣品指紋圖譜和對照指紋圖譜進(jìn)行整體比較獲得相似度結(jié)果，進(jìn)而進(jìn)行一致性評價。目前常用的相似度評價軟件是國家藥典委員會發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，該軟件采用自主編程，利用夾角余弦算法，將指紋圖譜導(dǎo)入軟件，表征各樣品間相似程度，進(jìn)而評價不同產(chǎn)地中藥質(zhì)量[9]。相似度范圍從0 到1，數(shù)值越大表明樣品間相似程度越高，該評價系統(tǒng)操作簡便且結(jié)果可靠。

多黏菌素E 甲磺酸鈉具有眾多且復(fù)雜的彼此相似的有效組分，與中藥具有類似的特點，僅通過測定6 個特征組分的含量并不能全面反映多黏菌素E甲磺酸鈉的質(zhì)量，建立全面系統(tǒng)的特征性指紋圖譜也是一種進(jìn)行質(zhì)量評價的有效手段?；诖怂悸罚狙芯繉⑻卣鹘M分的含量與指紋圖譜相似度評價相結(jié)合，能夠更為準(zhǔn)確地對不同來源的多黏菌素E甲磺酸鈉樣品進(jìn)行質(zhì)量一致性評價。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

無水磷酸氫二鈉（美國Aladdin 公司，色譜純）；50%氫氧化鈉溶液（Thermo Fisher Scientific 公司，色譜純）；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）（德國Merck公司）；多黏菌素E甲磺酸鈉原料藥（A企業(yè)：Xellia 公司的進(jìn)口原研原料藥，批號為A1680958；B 企業(yè)：江蘇正大天晴有限公司的國產(chǎn)仿制原料藥，批號為11121011），多黏菌素E 甲磺酸鈉制劑（江蘇正大天晴有限公司：無菌灌裝制劑，批號210927148；凍干制劑，批號190405115；Xellia 公司：批號190201，批號190202，批號190203），Milli-Q超純水（美國Millipore公司）。

1.2 儀 器

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters 公司），Milli-Q 超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；XS205 萬分之一電子天平（美國Mettler Toledo公司）。

2 方 法

2.1 色譜條件

采用Acquity UPLC?Peptide CSH C1（82.1 mm ×150 mm，1.7 μm）色譜柱，以磷酸鹽緩沖液（7.8 g/L磷酸二氫鈉，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.4）-乙腈（19∶1）為流動相A，磷酸鹽緩沖液-乙腈（1∶1）為流動相B，流速為0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序見表1。

Table1 Gradient elution program

2.2 溶液配制

供試品溶液的制備：分別取多黏菌素E甲磺酸鈉原料藥（原研原料藥/仿制原料藥）20 mg，加水0.5 mL溶解，用甲醇稀釋至10 mL。

2.3 組分含量測定

取原研原料藥供試品溶液及仿制原料藥供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，按面積歸一化法計算各組分峰的含量。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 取同一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，采用峰面積歸一化法，考察6 個特定組分峰的相對保留時間和峰面積百分比。

2.4.2 重復(fù)性 制備供試品溶液5份，按“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣分析，采用峰面積歸一化法，考察6個特定組分峰的相對保留時間和峰面積百分比。

2.4.3 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別于0、4、6、8、24 h 進(jìn)樣（進(jìn)樣室溫度：7 ℃），考察6 個特定組分峰的相對保留時間和峰面積百分比。

2.5 指紋圖譜的采集及相似度分析

記錄原研原料藥與仿制原料藥的色譜圖，將所有峰進(jìn)行積分，導(dǎo)出cdf 數(shù)據(jù)文件，采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對色譜圖進(jìn)行匹配，將色譜圖導(dǎo)入軟件，多點校正進(jìn)行全譜圖匹配，參數(shù)設(shè)置為峰面積占總峰面積的0%以上的峰參與匹配，且時間窗寬度設(shè)置為0.05，計算色譜圖的相似度。

3 結(jié) 果

3.1 指標(biāo)性組分含量對比

多黏菌素E 甲磺酸鈉是多黏菌素E 中含量較高的兩種成分——多黏菌素E1 和多黏菌素E2 經(jīng)甲磺酸化后由于取代基數(shù)量和位置不同而產(chǎn)生的一系列衍生物，主要分為多黏菌素E1 甲磺酸鈉峰群和多黏菌素E2 甲磺酸鈉峰群。根據(jù)EP 相關(guān)規(guī)定，多黏菌素E 甲磺酸鈉中來源于多黏菌素E1 和多黏菌素E2 的峰歸屬于組分，其他則歸為有關(guān)物質(zhì)。本研究通過建立二維液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，同時對比多黏菌素E1 甲磺酸鈉和多黏菌素E2 甲磺酸鈉對照品色譜圖中化合物的保留時間，確定多黏菌素E 甲磺酸鈉中歸屬于組分的峰有47 個（圖1）。結(jié)合擬合出的多黏菌素E 甲磺酸鈉組分峰色譜圖，考察原研原料藥與仿制原料藥中組分峰的含量（面積歸一化法），并計算組分純度（歸屬于多黏菌素E1 和多黏菌素E2 所有組分含量之和）。

Figure1 Fitting chromatogram of 47 peaks of colistimethate sodium (CMS)

由表2 可見，原研原料藥和仿制原料藥6 個指標(biāo)性組分峰含量以及組分純度均滿足EP 要求，仿制原料藥的組分純度略高于原研原料藥，6 個指標(biāo)性組分中，仿制原料藥中帶有8 個取代基（CMS E2ASM8、CMS E1ASM8）和6 個取代基（CMS E2ASM6、CMS E1ASM6）的組分峰含量較原研原料藥略高，帶有4 個取代基（CMS E2ASM4、CMS E1ASM4）的組分含量較原研原料藥略低，推測是由于兩者在發(fā)酵及純化工藝、合成工藝、純化分離方法等方面存在的不同所致。雖存在一定差異，但差異較小，且除此之外，指標(biāo)性組分個數(shù)均一致，通過指標(biāo)性組分含量的對比可以從細(xì)節(jié)上判斷兩者質(zhì)量的一致性。

3.2 指紋圖譜方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 精密度 同一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，6 個特定組分峰的相對保留時間的RSD 在0.05% ～ 0.10%，峰面積百分比的RSD 在1.97% ～2.95%，方法精密度良好。

3.2.2 重復(fù)性 5份供試品溶液進(jìn)樣分析，6個特定組分峰相對保留時間的RSD 均小于1%，峰面積百分比的RSD均小于3%，方法重復(fù)性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性 供試品溶液24 h（進(jìn)樣室溫度：7 ℃）穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，隨著時間增加各組分峰面積百分比變化較大，提示供試品應(yīng)臨用新制。

3.3 用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算色譜圖的相似度

3.3.1 相似度考察 將色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，點擊多點校正，進(jìn)入校正狀態(tài)，有助于減少不同譜圖中同一色譜峰保留時間的誤差后，進(jìn)行全譜圖匹配，結(jié)果顯示仿制原料藥中色譜峰保留時間、峰形與原研原料藥中的色譜峰相匹配的峰約有近百個（圖2）。

Figure2 Matching results of all peaks in the chromatograms of the original and imitated API (S1: Original API, S2: Imitation API)

3.3.2 相似度結(jié)果分析 將原研原料藥與仿制原料藥色譜圖中所有色譜峰進(jìn)行匹配，時間窗寬度設(shè)為0.05，由軟件計算仿制相似度。若以原研原料藥作為參比，則仿制原料藥相似度計算結(jié)果為0.986，即從宏觀角度來看原研原料藥與仿制原料藥色譜圖相似度很高。

3.4 一致性評價結(jié)果

相似度結(jié)果范圍從0 到1，數(shù)值越大表明樣品間相似程度越高。原研原料藥與仿制原料藥色譜圖相似度較高，但僅從指紋圖譜的宏觀相似度做判斷具有一定的局限性，需要結(jié)合指標(biāo)性組分含量對比結(jié)果，才能彌補對成分含量控制的不足。指標(biāo)性組分含量測定結(jié)果顯示，原研原料藥與仿制原料藥間差異較小，因此綜合來看，原研原料藥與仿制原料藥質(zhì)量基本一致，所存在的較小差異可能是由于二者在發(fā)酵及純化工藝、合成工藝、純化分離方法等方面存在的不同所致。

4 評價方法的應(yīng)用

4.1 同一企業(yè)不同生產(chǎn)工藝對比分析

多黏菌素E 甲磺酸鈉制劑生產(chǎn)工藝主要有兩種：凍干及無菌灌裝。B企業(yè)同時擁有兩種生產(chǎn)工藝的制劑（無菌灌裝制劑：S1；凍干制劑：S2），現(xiàn)對不同生產(chǎn)工藝制劑的質(zhì)量進(jìn)行對比分析。運用相似度法進(jìn)行質(zhì)量一致性評價（圖3），若以S1作為參比，相似度結(jié)果為0.989，兩者色譜圖相似度高，色譜圖中組分峰數(shù)量色譜行為一致，沒有引入新的雜質(zhì)。但指標(biāo)性組分含量對比分析（表2）結(jié)果顯示，峰面積（%）存在一定的差異。相比凍干制劑，無菌灌裝制劑組分純度較高，而且?guī)в?個、6個取代基的化合物峰面積（%）略高，而帶有4 個取代基的化合物峰面積（%）較低，表明生產(chǎn)工藝的不同對制劑各組分含量有一定的影響。

Figure3 Matching results of all peaks in the chromatograms of the Sterile filling and freeze-dry (S1: Sterile filling, S2: freeze-dry)

4.2 批間穩(wěn)定性的考察

為了考察樣品的批間穩(wěn)定性，取A 企業(yè)的3批制劑（批號190201，S1；批號190202，S2；批號190203，S3）進(jìn)行分析。運用相似度法進(jìn)行質(zhì)量一致性評價（圖4），若以S1 作為參比，S2、S3 的相似度結(jié)果為0.999。指標(biāo)性組分含量對比分析（表2）也結(jié)果顯示各峰數(shù)量及組分純度基本一致，且各組分峰面積（%）差距幾乎沒有差異，表明該企業(yè)制劑間具有較好的批間穩(wěn)定性，生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定。3批制劑間具有良好的穩(wěn)定性。

5 討 論

5.1 組分測定方法的選擇

本研究所采用的組分測定方法是在EP10.3規(guī)定色譜條件的基礎(chǔ)上稍微加以修改后的。在EP10.3 標(biāo)準(zhǔn)中，系統(tǒng)適用性中要求CMS E1ASM4與RRT 2.37 的色譜峰（與CMSE1ASM4 相鄰）的峰谷比 ≥ 1.2，但EP10.3 規(guī)定的色譜條件下，較難滿足系統(tǒng)適用性要求。通過改變流動相的pH（從pH 6.5 調(diào)至pH 6.4），提高了分離度，滿足了系統(tǒng)適用性要求。優(yōu)化后的色譜條件具有更好的分離能力，有效改善了目標(biāo)組分峰及有關(guān)物質(zhì)峰的分離效果，使組分/有關(guān)物質(zhì)峰的定量更加準(zhǔn)確，測定結(jié)果更加可靠，明顯優(yōu)于 EP 的方法。

5.2 起始物料多黏菌素E

多黏菌素E 本身為一種混合物，其成分較復(fù)雜，目前已知其至少包含多黏菌素E1、多黏菌素E2、多黏菌素E3 等不少于30 種化合物[10]，而多黏菌素E 甲磺酸鈉也是這些成分中的胺基發(fā)生不同程度的磺甲基化之后形成的混合物。有文獻(xiàn)[11]報道，多黏菌素E1和多黏菌素E2在抑菌活性上無明顯差別，但二者混合物比單一成分的活性低，主要是因為二者會相互競爭血漿蛋白結(jié)合位點，影響游離藥物濃度，進(jìn)而影響藥動學(xué)性質(zhì)，同時還發(fā)現(xiàn)多黏菌素E1 對腎臟的毒性比多黏菌素E2 嚴(yán)重。多黏菌素E甲磺酸鈉是一種無活性、毒性較低的多黏菌素E的前體藥物，在體內(nèi)水解為活性形式的多黏菌素E發(fā)揮作用[12-13]。

5.3 國內(nèi)外原料藥的制備差異

本研究所用的多黏菌素E 甲磺酸鈉原研原料藥的制備方法是由甲醛先與多黏菌素E 的5 個伯氨基形成Schiff 堿，然后再與過量的亞硫酸氫鈉加成反應(yīng)生成CMS。而國內(nèi)仿制原料藥在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，將硫酸多黏菌素E 加水溶解，向其中加入甲醛溶液，將二者進(jìn)行反應(yīng)；再向上述的反應(yīng)產(chǎn)物中加入亞硫酸氫鈉溶液，繼續(xù)反應(yīng)，采用超濾膜進(jìn)行分離純化。該方法具有低污染，低能耗，工藝簡單，重復(fù)性好，且所得產(chǎn)品的純度和活性很高的優(yōu)點。

5.4 復(fù)雜組分抗生素指標(biāo)峰的選擇

復(fù)雜組分抗生素存在大量組分峰和有關(guān)物質(zhì)峰，在進(jìn)行峰含量對比時，需要針對性地選擇特征性指標(biāo)峰，如被證明為主要起效成分的組分，或者是含量較高的主要組分。Xellia基于111個原料藥批次的數(shù)據(jù)，對分別帶有8、6 和4 個甲磺酸取代基的關(guān)鍵成分進(jìn)行了評價，僅提出了6 個特征峰（CMS E1ASM8、CSM E1ASM6、CMS E1ASM4、CMS E2ASM8、CMS E2ASM6、CMS E2ASM4），分別為多黏菌素E1 或多黏菌素E2 帶有8 個、6 個、4 個甲磺酸取代基。由于含有10個甲磺酸取代基的組分的不穩(wěn)定性及其保留時間太短受干擾較多，因此未對該峰進(jìn)行評價。由于CMS 的組分峰是相互依賴的（取代基多的組分含量減少會導(dǎo)致取代基少的組分含量增加)，因此對色譜圖中選定的6 個峰的評價將提供關(guān)于CMS 質(zhì)量及其與關(guān)鍵工藝參數(shù)和穩(wěn)定性的相關(guān)性的足夠信息[14]。在本研究中，選取了EP 中明確的6 個特征組分峰作為指標(biāo)峰，能夠提高一致性評價的效率。

5.5 相似度計算方法的選擇

相似度計算方法包括以下幾種：相關(guān)系數(shù)法、峰重疊率法（Nei 系數(shù)法）以及峰重疊率與共有峰強(qiáng)度結(jié)合法（改進(jìn)Nei系數(shù)法）、夾角余弦法等。相關(guān)系數(shù)法是使用向量之間的相關(guān)系數(shù)來反映樣品間的相似程度的方法[15]，取值范圍較寬，且對大峰缺失表現(xiàn)得比較敏感，而對小峰缺失問題不夠敏感。峰重疊率法（Nei 系數(shù)法）是根據(jù)待測樣品與對照品共有峰數(shù)來反映相似度的分析方法，只考慮到圖譜共有峰的數(shù)量問題，并未考慮共有峰其峰強(qiáng)度的影響[16]。峰重疊率與共有峰強(qiáng)度結(jié)合法（改進(jìn)Nei 系數(shù)法）通過比較特征曲線的相似程度來判斷中藥的真假、優(yōu)劣。此方法結(jié)合了峰強(qiáng)度信息，且無須對相對保留值數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化等預(yù)處理，但改進(jìn)后仍對小峰缺失敏感而相對大峰不夠敏感[17]。夾角余弦法是通過比較各向量之間的夾角余弦值來反映樣本的相似度的方，該方法數(shù)字概念簡單，數(shù)據(jù)處理過程簡便快捷，在定量計算兩張色譜指紋圖譜相似度方面有其優(yōu)勢。本研究采用的國家藥典委員會發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”即采用夾角余弦法的計算方法，是目前較為常用的相似度評價軟件。

5.6 評價方法的建立

復(fù)雜組分抗生素具有成分多樣性的特點，發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)并不局限于一種或少數(shù)幾種成分，而是多種指標(biāo)性成分藥理作用的有機(jī)統(tǒng)一，所以單指標(biāo)含量分析的質(zhì)量控制模式已不滿足現(xiàn)代多組分藥物質(zhì)量要求，多指標(biāo)含量分析的質(zhì)控模式逐漸被提出[18]。建立指紋圖譜，運用相似度評價軟件，對參比藥物和測試藥物的色譜圖進(jìn)行匹配并計算相似度，可以獲悉藥物的整體成分組成概貌，從宏觀上反映質(zhì)量的相似度。將指標(biāo)組分定量分析與指紋圖譜相似度評價相結(jié)合，從定性和定量兩個角度反映藥物化學(xué)組成信息，較之單一的測定更為全面準(zhǔn)確。

5.7 該評價方法的意義

本研究建立了UPLC 指紋圖譜相似度計算結(jié)合6 個指標(biāo)性組分含量測定的方法，對多黏菌素E甲磺酸鈉進(jìn)口原研原料藥和國產(chǎn)仿制原料藥進(jìn)行了質(zhì)量一致性評價，該評價結(jié)果與仿制藥生產(chǎn)企業(yè)的研究結(jié)果一致，彼此相互佐證。該方法全面可靠，不僅可以用于原料藥之間的質(zhì)量一致性考察，還可以用于制劑與原料藥之間的質(zhì)量差異分析，為復(fù)雜組分藥物的質(zhì)量評價提供了思路，具有一定的指導(dǎo)和推廣意義。