參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性的作用機(jī)制研究＊

黃海福，付艷麗，符必謙，賴思思

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院 深圳 518000；2. 深圳市中醫(yī)腫瘤醫(yī)學(xué)中心 深圳 518000）

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)第六大常見癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。HCC 因發(fā)病率高、惡性程度高、強(qiáng)侵襲與轉(zhuǎn)移、預(yù)后差而廣受關(guān)注[2]。2018 年全球肝癌發(fā)病人數(shù)達(dá)到84.1 萬人，死亡人數(shù)高達(dá)78.2 萬人，其中HCC占肝癌病例的75%-85%[3]。近年來，HCC 的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)持續(xù)上升，在治療方面，主要為局部和系統(tǒng)治療，包括經(jīng)動(dòng)脈放射栓塞、化療栓塞或消融治療及靶向免疫治療等[4-5]。中醫(yī)藥在治療HCC 方面具有較好的療效[6]，國(guó)醫(yī)大師、著名中醫(yī)腫瘤學(xué)家周岱翰教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)立了具有健脾養(yǎng)肝、軟堅(jiān)消癥之效的經(jīng)典抗肝癌方藥——“參桃軟肝方”，重視整體治療觀念，組方藥性平和、攻補(bǔ)適中、補(bǔ)正不留瘀、活血不傷正，集“扶正、化瘀、軟堅(jiān)、生新”和保護(hù)、干預(yù)、調(diào)節(jié)于一體。在臨床中發(fā)現(xiàn)其具有改善肝功能、抑制肝癌、延長(zhǎng)肝癌患者的生存期等功效[7]，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確。故本研究主要探討了參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性的作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2株購于中科院細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑

參桃軟肝片由西洋參10 g、桃仁15 g、當(dāng)歸6 g、大黃10 g、丹參20 g、仙鶴草20 g、牛黃1 g 組成，飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供。胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM（含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基）高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素溶液（Penicillin-streptomycin solution，PS）、胰酶細(xì)胞消化液（含酚紅）購于HyClone 公司；四甲基噻唑藍(lán)（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（LDH Assay Kit）購自Sigma 公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、磷酸酶抑制劑片劑（PhosStop）、苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl luorid，PMSF）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、極超敏增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（Enhanced chemiluminescence，ECL）化學(xué)發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE 電泳液、Western blot 轉(zhuǎn)膜液、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）購自碧云天公司；RNA 提取試劑盒、互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DN，cDNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、反應(yīng)混合物（Master Mix）等Real-time PCR試劑購自Roche公司。

1.3 儀器

CO2 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱ESCO（CCL-170B-8）、A2 型二級(jí)生物安全柜ESCO Airstream（AC2-8S1）、酶標(biāo)儀TECAN（M200 PRO）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司（XD-2000A）、冷凍離心機(jī)Hettich（MIKRO 200R）、電泳儀BIO-RAD（PowerPac Basic）、電轉(zhuǎn)儀BIORAD（170-3940）、化學(xué)發(fā)光成像儀GE Healthcare（AM600），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Roche（LC96），梯度PCR儀Gene Atlas（G02），去離子水儀Milli-Q（Direct 8）。

1.4 參桃軟肝方的提取

取西洋參10 g、桃仁15 g、當(dāng)歸6 g、大黃10 g、丹參20 g、仙鶴草20 g 加入10 倍（810 mL）Mili-Q 水大火燒開后轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，倒出藥液。加入8倍（720 mL）Mili-Q水大火燒開后轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，合并煎液，加入人工牛黃1 g 溶解，用濾紙過濾得濾液。將濾液用1000 r/min-1離心15 min 后，取上清。將上清用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，氮吹吹干，最終得到藥物重量為24.665 g，得率為34.739%，保存于-20℃冰箱。稱取100 mg參桃軟肝方水提物，加入1 mL DMSO溶解，制成100 mg·mL-1母液備用，在文章均稱為參桃軟肝方。

1.5 乙醇沉淀法分離參桃軟肝方醇提上清和沉淀

將參桃軟肝方水提物加入乙醇至75%，放入4℃冰箱混勻提取過夜。將參桃軟肝方提取液1000 r/min-1離心15 min 后，取上層為參桃軟肝方醇提上清，下層為參桃軟肝方醇提沉淀，分別將參桃軟肝方上清和沉淀氮吹干，用DMSO溶解上清和沉淀，在文章均稱為參桃軟肝方醇提上清和沉淀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)人肝癌細(xì)胞HepG2的活性

將人肝癌細(xì)胞HepG2 在含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞按照1×104個(gè)/皿接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別按照空白對(duì)照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）或按照空白對(duì)照組、參桃軟肝方（1000 μg·mL-1）組、參桃軟肝方（1000 μg·mL-1）+不同濃度抑制劑組、不同濃度抑制劑組進(jìn)行加藥，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄去上清，每孔加入新鮮配制的MTT溶液（5 mg·mL-1）20 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，在搖床上輕輕搖晃5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的各實(shí)驗(yàn)組的吸光度（OD490），計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。

2.2 LDH 活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)人肝癌細(xì)胞HepG2 的LDH釋放

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2，按照1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別按照空白對(duì)照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）干預(yù)24 h，取細(xì)胞上清進(jìn)行LDH釋放檢測(cè)。

2.3 Real-time PCR 檢測(cè)人肝癌細(xì)胞HepG2 中IL-1β基因的mRNA表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2，按照1×105個(gè)/皿接種于直徑6 cm 的培養(yǎng)皿中，按照空白對(duì)照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）干預(yù)24 h。用TRIzol 提取總RNA，測(cè)RNA 的濃度。使用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在Light Cycle 96 real-time PCR 平臺(tái)，采用SYBGREEN PCR Master Mix 試劑盒，檢測(cè)IL-1β 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因mRNA 表達(dá)，引物序列為：IL-1β（前引物5’-CACGATGCACCTGTACGATCA-3’，后引物5’-GTTGCTCCATATCCTGTCCCT-3’）、GAPDH（前引物5’-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’，后引物5’-GACTCCACGACGTACTCAGC-3’）。將IL-1β 基因的mRNA 表達(dá)水平歸一化至內(nèi)參基因GAPDH。用雙ΔCt法計(jì)算IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)。

2.4 Western blot 檢測(cè)人肝癌細(xì)胞HepG2 中Cleavaged Caspase-1、Akt、ERK、P-ERK、Caspase-3、PARP、Bcl2、Bax蛋白表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2 按照1×105個(gè)/皿接種于6cm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 后，按照空白對(duì)照組、參桃軟肝方不同濃度組（100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1）分別干預(yù)24 h。提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。加入上樣緩沖液（Loading buffer）后于95℃蛋白變性5 min。以20 μg 的蛋白量分別進(jìn)行電泳，電泳完畢后進(jìn)行，按照0.25 A，1 h將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后，將轉(zhuǎn)好的膜放入5%脫脂奶粉封閉液中封閉4 h，取出用PBST 清洗3 次，每次5 min。用特異性的一抗Cleavaged Caspase-1 或Akt 或ERK 或P-ERK 或Caspase-3 或PARP 或Bcl2 或Bax 或GAPDH，1:1000 稀釋后，于4℃孵育過夜。第2 天將PVDF 膜取出PBST 清洗3 次，每次5 min，放入對(duì)應(yīng)的二抗，常溫孵育2 h 后磷酸緩沖液+聚山磷脂-20（Phosphate buffered saline+tween-20，PBST）清洗3 次，每次5 min，最后將PVDF 膜放入顯影液中（A 液∶B 液=1∶1），放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影以及拍照。使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上，使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）或t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，當(dāng)P<0.05 時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 參桃軟肝方對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響

如圖1所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組，細(xì)胞活性分別降為92.61%±5.06%、60.06%±8.03%、36.31%±4.04%，其中300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。以上結(jié)果表明，隨著參桃軟肝方濃度的增加，人肝癌細(xì)胞HepG2 活性的抑制率顯著升高，并具有濃度依賴性。說明參桃軟肝方能有效抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的活性。

圖1 參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性

3.2 參桃軟肝方對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 乳酸脫氫酶（LDH）釋放的影響

細(xì)胞LDH 的釋放，是衡量細(xì)胞毒性的重要指標(biāo)。如圖2所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組，細(xì)胞LDH 的釋放含量分別為空白對(duì)照組的1.08±0.02、1.12±0.02、1.85±0.42 倍，其中1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以上結(jié)果表明，高濃度參桃軟肝方能促進(jìn)人肝癌細(xì)胞HepG2中LDH 的釋放，對(duì)人肝癌細(xì)胞具有一定的毒性作用。

圖2 參桃軟肝方促進(jìn)人肝癌細(xì)胞HepG2中LDH釋放

3.3 參桃軟肝方對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 焦亡標(biāo)志物IL-1β和Cleavaged Caspase-1表達(dá)的影響

如圖3所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組下調(diào)IL-1β基因的mRNA 表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組降低Cleavaged Caspase-1 的蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以上結(jié)果表明，高濃度參桃軟肝方能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 焦亡標(biāo)志物IL-1β 和Cleavaged Caspase-1 的表達(dá)。說明參桃軟肝方降低肝癌細(xì)胞活性，很可能通過阻斷細(xì)胞焦亡過程起作用的。

圖3 參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2焦亡標(biāo)志物IL-1β和Clevaged Caspase-1的表達(dá)

3.4 參桃軟肝方對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 中Akt/ERK 信號(hào)通路的影響

如圖4所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組，降低Akt 蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而ERK 及其磷酸化表達(dá)未見明顯變化。以上結(jié)果表明，參桃軟肝方能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 中Akt 信號(hào)傳導(dǎo)，而不影響ERK及其磷酸化。說明抑制Akt蛋白表達(dá)及其信號(hào)傳導(dǎo)是參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性的重要分子機(jī)制。

圖4 參桃軟肝方對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中ERK和Akt蛋白表達(dá)的影響

3.5 參桃軟肝方對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2 凋亡信號(hào)通路的影響

如圖5所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方干預(yù)組上調(diào)Caspase3蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而PARP、Bcl2、Bax 蛋白表達(dá)量未見明顯改變。以上結(jié)果表明，參桃軟肝方很可能激活人肝癌細(xì)胞HepG2中Caspase3 依賴的凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)Caspase 3蛋白表達(dá)是參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性的重要分子機(jī)制。

圖5 參桃軟肝方對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中Caspase3、PARP、Bcl2、Bax蛋白表達(dá)的影響

3.6 凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK 信號(hào)通路抑制劑對(duì)參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響

如圖6所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，1000 μg·mL-1參桃軟肝方能有效抑制細(xì)胞活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。但加入不同濃度的凋亡抑制劑Z-VAD（5、10、20、40 μmol·L-1），自噬抑制劑Wortmanin（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（2.5、5、10、20 μmol·L-1），細(xì)胞壞死抑制劑Necrostatin-1（10、20、40、80 μmol·L-1），PI3K 抑制劑LY294002（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），Akt抑制劑Akti（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），MEK 抑制劑MEKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），JNK 抑制劑JNKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1）后，對(duì)參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 活性沒有顯著的影響。以上結(jié)果表明，參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞活性，很可能與細(xì)胞凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死及PI3K/Akt/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)無關(guān)。

3.7 參桃軟肝方醇提上清和沉淀對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響

為了進(jìn)一步研究參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性的有效成分，通過乙醇沉淀的方法，分離了參桃軟肝方醇提上清和沉淀。如圖7 所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1l、3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清干預(yù)組，對(duì)細(xì)胞活性的成活率分別為96.75%±15.51%、82.10%±21.25%、80.97%±5.05%、46.42%±6.55%，其中3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清干預(yù)組與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。100 μg·mL-1、300 μg·mL-1、1000 μg·mL-1、3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提沉淀干預(yù)組，細(xì)胞活性分別降為100.12%±9.89%、90.34%±4.42%、87.71%±15.82%、45.20%±4.91%，其中3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提沉淀干預(yù)組與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以上結(jié)果表明，3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清和沉淀對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2活性的抑制率達(dá)到50%左右，參桃軟肝方在1000 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞活性就降到50%左右，說明參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞的活性優(yōu)于參桃軟肝方醇提上清和沉淀。

圖7 參桃軟肝方醇提上清和沉淀抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性

3.8 凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK 信號(hào)通路抑制劑對(duì)參桃軟肝方醇提上清和沉淀抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響

如圖8所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提上清能有效抑制細(xì)胞活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但加入不同濃度的凋亡抑制劑Z-VAD（5、10、20、40 μmol·L-1），自噬抑制劑Wortmanin（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（2.5、5、10、20 μmol·L-1），細(xì)胞壞死抑制劑Necrostatin-1（10、20、40、80 μmol·L-1），PI3K 抑制劑LY294002（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），Akt抑制劑Akti（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），MEK 抑制劑MEKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），JNK 抑制劑JNKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1）后，對(duì)參桃軟肝方醇提上清抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性沒有顯著的影響。

圖8 凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK信號(hào)通路抑制劑對(duì)參桃軟肝方醇提上清抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響

如圖9所示，在人肝癌細(xì)胞HepG2上，與空白對(duì)照組相比，3000 μg·mL-1參桃軟肝方醇提沉淀能有效抑制細(xì)胞活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。但加入不同濃度的凋亡抑制劑Z-VAD（5、10、20、40 μmol·L-1），自噬抑制劑Wortmanin（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（2.5、5、10、20 μmol·L-1），細(xì)胞壞死抑制劑Necrostatin-1（10、20、40、80 μmol·L-1），PI3K 抑制劑LY294002（0.25、0.5、1、2 μmol·L-1），Akt抑制劑Akti（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），MEK 抑制劑MEKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1），JNK 抑制劑JNKi（0.1、0.3、1、3 μmol·L-1）后，對(duì)參桃軟肝方醇提沉淀抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性沒有顯著的影響。

圖9 凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK信號(hào)通路抑制劑對(duì)參桃軟肝方醇提沉淀抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響

以上結(jié)果表明，參桃軟肝方醇提上清和沉淀抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞活性，很可能與細(xì)胞凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死及PI3K/Akt/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)無關(guān)。

4 討論

HCC 是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[8]。肝癌起病隱匿，潛伏期長(zhǎng)、惡性程度高、生存期短、生存質(zhì)量差、且治療棘手素有“癌中之王”之稱[9]。HCC 的發(fā)生與乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、酒精或進(jìn)食含黃曲霉素的食物等暴露接觸高度相關(guān)[10-11]。另外，肥胖、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病與非酒精性脂肪性肝病也被逐漸成為HCC的危險(xiǎn)因素[12-13]。HCC五年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)50%-80%，而五年生存率低于5%[14-15]。目前，對(duì)于肝癌患者主要采取外科手術(shù)、肝動(dòng)脈栓塞化療、微創(chuàng)治療、分子靶向治療等方法，雖然近年來診斷和治療技術(shù)取得較大發(fā)展，但因其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，肝癌患者的5年生存率仍較低[16-17]。

近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷進(jìn)展，在腫瘤治療方面，中醫(yī)藥聯(lián)合手術(shù)、放療、化療、分子靶向及免疫治療，可以改善癥狀，減少治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存期[18-19]?，F(xiàn)代研究顯示，中藥可以調(diào)節(jié)微環(huán)境中各類免疫細(xì)胞，從而改善腫瘤免疫的微環(huán)境，增強(qiáng)抗腫瘤作用，許多中藥復(fù)方通過多途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功效[20-21]。因此，從中醫(yī)藥中發(fā)掘治療腫瘤轉(zhuǎn)移的有效方藥意義重大。肝為剛臟，主升主動(dòng)、主疏泄，喜條達(dá)而惡抑郁，肝藏血，體陰而用陽。國(guó)醫(yī)大師、著名中醫(yī)腫瘤學(xué)家周岱翰教授認(rèn)為，本病發(fā)生的病因病機(jī)是因邪毒內(nèi)聚，肝失疏泄，致肝氣郁滯，郁而化火，郁火內(nèi)灼，耗傷陰血，使肝陰耗損，肝血不藏而妄行，肝旺克脾則脾氣虛損，肝損及腎則腎水虧枯[22]。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)“參桃軟肝方”具有改善肝功能、抑制肝癌、延長(zhǎng)肝癌患者的生存期等功效，但其具體作用機(jī)制尚不明確[23-24]。

研究發(fā)現(xiàn)參桃軟肝方能顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 的活性及LDH 的釋放，增加細(xì)胞毒性，對(duì)肝癌細(xì)胞具有較好地殺傷作用。經(jīng)過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，參桃軟肝方通過下調(diào)Akt 蛋白的表達(dá)，上調(diào)Caspase3的表達(dá)。因此，參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性的機(jī)制很可能是依賴于Akt 的下調(diào)和Caspase3 的激活。而Akt 和Caspase3 廣泛參與了細(xì)胞的程序性死亡。細(xì)胞程序性死亡是一種保守的細(xì)胞自殺進(jìn)化過程，對(duì)真核生物的發(fā)展和完整性至關(guān)重要，與多種疾病有關(guān)，包括發(fā)育障礙、免疫缺陷、自身免疫疾病、神經(jīng)退行性變和癌癥[25]。細(xì)胞程序性死亡的傳統(tǒng)方式主要有凋亡、自噬、壞死性凋亡，新發(fā)現(xiàn)的有細(xì)胞焦亡和鐵死亡等[26]。研究發(fā)現(xiàn)參桃軟肝方降低人肝癌細(xì)胞HepG2中焦亡標(biāo)志物IL-1β 和Clevaged Caspase-1 的表達(dá)，說明參桃軟肝方降低肝癌細(xì)胞活性，很可能不是通過促進(jìn)細(xì)胞焦亡，而是抑制細(xì)胞焦亡。進(jìn)一步選用細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD、自噬抑制劑Wortmanin、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1、細(xì)胞壞死抑制劑Necrostatin-1 對(duì)參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性進(jìn)行干預(yù)，探討不同類型細(xì)胞程序性死亡在參桃軟肝方抗肝癌中的扮演的角色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Z-VAD、Wortmanin、Ferrostatin-1、Necrostatin-1對(duì)參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活性無影響，說明參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性很可能與細(xì)胞凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死無關(guān)。

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路通過多種細(xì)胞機(jī)制調(diào)控多種生物過程，與細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡有著密切的聯(lián)系，共同調(diào)控細(xì)胞程序性死亡[27]。在腫瘤疾病中，通過調(diào)控MAPK 信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的生存能力和遷移能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[28]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是一個(gè)脂質(zhì)激酶酶的大家族，當(dāng)PI3K 被激活后，進(jìn)一步催化磷酸化磷脂酰肌醇（PIP2）和磷脂酰肌醇3（PIP3），可啟動(dòng)下游信號(hào)通路如Akt的激活，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、自噬和凋亡[29-30]。PI3K/Akt是最常見的致癌信號(hào)通路之一，MAPK 信號(hào)通路也在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中發(fā)揮重要作用[31]。而參桃軟肝方抑制了PI3K/Akt/MAPK 信號(hào)通路中核心信號(hào)分子Akt 的表達(dá)，說明阻斷PI3K/Akt/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)很可能是參桃軟肝片抑制肝癌細(xì)胞活性的重要機(jī)制分子之一。因此，進(jìn)一步選用PI3K/Akt 及MAPK 相關(guān)信號(hào)通路的抑制劑，檢測(cè)其對(duì)參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LY294002、Akti、MEKi、JNKi 等PI3K/Akt/MAPK 相關(guān)抑制劑對(duì)參桃軟肝方抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 活性的沒有明顯影響，參桃軟肝方抑制肝癌細(xì)胞活性很可能與PI3K/Akt/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)不是直接相關(guān)可能是通過AKT 相關(guān)的其他調(diào)控的上下游起作用的。

目前，中醫(yī)藥抗腫瘤研究多集中在中藥單藥、單藥提取物、單體成分等方面，而中藥復(fù)方對(duì)于抗腫瘤的研究較少。中藥復(fù)方具有復(fù)雜的活性成分及作用靶點(diǎn)，在抗腫瘤治療中對(duì)增加現(xiàn)有治療的療效、減輕毒副作用、調(diào)節(jié)免疫力等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。參桃軟肝方主要由西洋參、桃仁、當(dāng)歸、大黃，丹參、仙鶴草、人工牛黃組成，通過傳統(tǒng)水提得到參桃軟肝方，為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其有效組分，通過乙醇沉淀法，將總體物分離成兩部分，即醇提上清和沉淀，發(fā)現(xiàn)參桃軟肝方醇提上清和沉淀能抑制肝細(xì)胞活性。凋亡、自噬、鐵死亡、細(xì)胞壞死抑制劑及PI3K/Akt/MAPK信號(hào)通路的抑制劑同樣對(duì)醇提上清和沉淀抑制人肝癌細(xì)胞活性無明顯影響。說明參桃軟肝方傳統(tǒng)水提總提物抑制肝癌細(xì)胞活性的作用優(yōu)于醇提上清和沉淀。提示，參桃軟肝方的醇提上清和沉淀對(duì)抗肝癌作用可能存在協(xié)同作用。

本研究局限性有兩點(diǎn)：第一是沒能找到參桃軟肝方抑制Akt 信號(hào)的上下游相關(guān)因子，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制；第二是沒能發(fā)現(xiàn)參桃軟肝方抗肝癌的主要活性成分，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，明確主要活性成分，為參桃軟肝方的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

因此，得出以下結(jié)論：參桃軟肝方具有抑制肝癌細(xì)胞活性抗肝癌的作用，其作用機(jī)制可能與自噬、壞死性凋亡等程序性死亡方式無關(guān)；參桃軟肝方抑制Akt 蛋白表達(dá)和促進(jìn)Caspase3 蛋白表達(dá)，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)不是通過經(jīng)典PI3K/Akt/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制細(xì)胞活性，我們推測(cè)可能是通過Akt 的其他上下游蛋白起作用的；參桃軟肝方降低焦亡標(biāo)志物IL-1β和Cleavaged Caspase 1 表達(dá)，很可能阻斷細(xì)胞焦亡過程。另外，本研究發(fā)現(xiàn)參桃軟肝方比醇提上清和沉淀抗肝癌活性好，其醇提上清和沉淀很可能存在協(xié)同抗肝癌的作用。