滋腎安坤顆粒治療免疫性POI小鼠療效及對細胞因子IL-2、IL-6、TGF-β的影響＊

魏杜燃，彭 桃，魏紹斌，吳 揚，李茂雅，羅 丹

（1. 成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院 成都 610072；2. 成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 成都 610032）

早發(fā)性卵巢功能不全（Primary ovarian insufficiency，POI）是指女性40 歲前卵巢功能減退，以月經(jīng)異常，伴有促性腺激素升高和雌二醇降低為特征的一種臨床綜合征[1]。POI 患者常出現(xiàn)月經(jīng)異常，生育能力低下，甚至可引起骨質疏松、心血管疾病和認知下降等長期后遺癥[2]，嚴重影響患者的生活質量。目前西醫(yī)主要采用激素替代療法（HRT）緩解POI 低雌激素相關癥狀，但需長期用藥，而且其只能延緩卵巢功能的下降速度，不能逆轉卵巢功能下降[3]，遠期效果不佳。且長期的激素治療易增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌及血栓栓塞性疾病的發(fā)生風險[4]。中醫(yī)藥治療POI從整體出發(fā)，辨證論治，調(diào)經(jīng)助孕，其副作用小，患者接受性好，具有臨床應用和研究價值。

四川省名中醫(yī)魏紹斌教授基于30 多年的臨床診療經(jīng)驗，結合《傅青主女科》“經(jīng)水出諸于腎”及《臨證指南醫(yī)案》中言“女子以肝為先天”的理論，從肝腎辨治POI。魏教授認為POI 以肝腎陰虛、精血虧少為核心病機，在《景岳全書》歸腎丸的基礎上加減研制了院內(nèi)制劑滋腎安坤顆粒，用治POI 取得了確切的臨床療效。POI 的病因錯綜復雜，大多數(shù)POI 病例的原因仍然未知。據(jù)調(diào)查約5%-30%的POI患者有自身免疫性疾病，而卵巢是由環(huán)境或遺傳因素激活導致的自身免疫性疾病的常見靶點[5-6]，故自身免疫功能的異?？赡芘cPOI的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。因此本實驗通過建立免疫性POI小鼠模型，采用具有滋腎益肝，養(yǎng)血填精作用的滋腎安坤顆粒治療，初步探究其療效和作用機制，為中藥新藥的研發(fā)提供實驗研究的證據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

BALB/c 雌性小鼠，SPF 級，7-8 周齡，體質量18-22 g，均由成都達碩實驗動物技術有限公司提供并飼養(yǎng)。動物許可證號：SCXK（川）2020-030，倫理審查編號：2020DL-011。

1.2 藥物與試劑

滋腎安坤浸膏，處方含黃芪、黨參、熟地黃、當歸、山茱萸、鹽杜仲、菟絲子、枸杞子、淮山藥等，由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供（濃度1.175 g·mL-1）；戊酸雌二醇（規(guī)格：1 mg/片，進口藥品注冊證號：H20160679，國藥準字J20171038，Delpharm Lille SAS生產(chǎn)）。小鼠透明帶多肽粉末：小鼠透明帶3（ZP3）的第330-342 個氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR）（純度>95%，批號：271036，上海吉爾生化有限公司）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（批號：F5881、F5506，美國Sigma 公司）；雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）、抗苗勒管激素（AMH）、白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素6（IL-6）、轉化生長因子-β（TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（批號：ZC-38046、ZC-38059、ZC-38503、ZC-38059、ZC-37988、ZC-39042，上海茁彩生物科技有限公司）等。

1.3 儀器

JT-12S 自動組織脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；RS36型全自動染色機（常州派斯杰醫(yī)療設備有限公司）；酶標儀（美谷分子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）等。

2 方法

2.1 免疫性POI小鼠模型建立

取4 mg ZP3 透明帶多肽粉末溶于10 mL 雙蒸水，配成0.4 mg·mL-1溶液與弗氏完全佐劑按1∶1 配制成20 mL 免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1 配制成20 mL 免疫強化試劑[7]。小鼠適應性喂養(yǎng)7 天后，連續(xù)7 天陰道脫落細胞涂片觀察，篩選動情周期規(guī)律的小鼠隨機分為45 只造模和13 只空白對照組。每只造模小鼠于造模第1 天均取0.15 mL 免疫試劑腹部及雙后腳掌皮下多點注射，并于第14 天、第35 天取0.15 mL免疫強化試劑同法加強免疫。第三次皮下注射7 天后，連續(xù)10 天觀察小鼠動情周期，隨機取3 只模型組和3 只空白對照組小鼠雙側卵巢組織觀察其病理變化，判斷造模情況?？瞻讓φ战M小鼠同期使用等量生理鹽水皮下多點注射。

2.2 分組及給藥

將造模成功后的小鼠隨機分為模型組、滋腎安坤低劑量組、滋腎安坤高劑量組、戊酸雌二醇組各10只。根據(jù)體表面積比換算，以小鼠與人體藥物等效劑量倍數(shù)為9倍，滋腎安坤低、高劑量組每天給藥劑量分別為11 750 mg·kg-1（1 倍于臨床等效劑量）、23 500 mg·kg-1（2 倍于臨床等效劑量），戊酸雌二醇組每天給藥劑量為0.15 mg·kg-1（1 倍于臨床等效劑量）；模型組和空白對照組灌等量蒸餾水。各組同一時間段灌胃，每天1次，連續(xù)28天。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 一般情況

自造模第1天起每天觀察并記錄各組小鼠的精神狀態(tài)、食欲、毛發(fā)、活動情況等，1周稱1次體質量。

2.3.2 動情周期

各組均于灌胃治療第19 天起，每日9∶00 進行陰道涂片及巴氏染色，顯微鏡下觀察有核和角化的上皮細胞與白細胞的比例，判斷動情周期。

2.3.3 ELISA 法檢測血清E2、FSH、AMH、IL-2、IL-6、TGF-β水平

小鼠末次灌胃結束后禁食12 h，每組隨機選取8只小鼠眼眶靜脈叢采血，4℃冰箱靜置2 h，以3000 r·min-1低速離心15 min，取上層清液，凍存于-80℃冰箱待檢。檢測時嚴格按照按ELISA 試劑盒說明步驟操作，在450 nm 波長下測定小鼠血清中E2、FSH、AMH、IL-2、IL-6、TGF-β 吸光度值（OD 值），繪制標準曲線圖，計算E2、FSH、AMH、IL-2、IL-6、TGF-β濃度。

2.3.4 卵巢組織形態(tài)學觀察

小鼠采血后即取雙側卵巢，左側卵巢凍存于-80℃冰箱備用，右側卵巢置于10%甲醛固定12-24 h待檢，最后頸椎脫臼處死小鼠。將固定卵巢組織經(jīng)脫水、包埋、切片、HE 染色、鏡檢觀察卵巢組織最大切面的卵巢結構、各級卵泡數(shù)量、炎細胞浸潤等。40 倍鏡下觀察組織大體病變，采集100 倍和400 倍圖片，進一步觀察其更細微的病變。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)均使用均值±標準差（±s）表示，使用單因素方差分析，事后多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

空白對照組小鼠一般情況良好；造模小鼠逐漸精神欠佳、毛暗淡、反應淡漠、行動遲緩、雙后腳掌出現(xiàn)不同程度腫脹，體質量較空白對照組減輕；另在第1次注射免疫試劑后，有2只造模小鼠死亡。治療后，與模型組比較，滋腎安坤高劑量組和戊酸雌二醇組小鼠精神明顯好轉，毛發(fā)逐漸有光澤，活動變靈敏，雙足腫脹也明顯好轉；滋腎安坤低劑量組小鼠一般情況略有改善；各治療組體質量無明顯差異。

3.2 動情周期觀察

空白對照組小鼠動情周期為4-5 天，動情前期以有核上皮細胞為主，動情期以如“落葉狀”分布的角化細胞為主，動情后期可見角化細胞及白細胞，動情間期以白細胞為主。與空白對照組比較，模型組小鼠動情周期延長紊亂，其一次動情周期約為7-9天，且多停留在動情前期和后期，但相對不典型。與模型組比較，各治療組動情周期有所改善，其中滋腎安坤高劑量組和戊酸雌二醇組小鼠動情周期改善明顯，其一次動情周期約為5-7天（見圖1）。

圖1 空白對照組與模型組小鼠陰道細胞涂片

3.3 卵巢組織形態(tài)學觀察

空白對照組小鼠卵巢皮質和髓質清晰可辨，顆粒細胞排列整齊，可見各級正常發(fā)育的生長卵泡，閉鎖卵泡少。與空白對照組比較，模型組小鼠卵巢結構不清晰，間質內(nèi)出現(xiàn)不同程度炎性細胞浸潤，顆粒層細胞變性壞死；其生長卵泡減少，閉鎖卵泡增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。與模型組比較，各治療組小鼠卵巢組織間質內(nèi)炎細胞浸潤和顆粒層細胞變性壞死有改善趨勢，生長卵泡變多，閉鎖卵泡減少；其中滋腎安坤高劑量組生長卵泡增加明顯，戊酸雌二醇組閉鎖卵泡減少明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見表1，圖2）。

表1 小鼠生長卵泡及閉鎖卵泡計數(shù)（±s，n=6）

表1 小鼠生長卵泡及閉鎖卵泡計數(shù)（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

組別空白對照組模型組滋腎安坤低劑量組滋腎安坤高劑量組戊酸雌二醇組生長卵泡（個）7.83 ± 2.56 5.00 ± 1.41#5.33 ± 1.20 7.33 ± 2.68*5.33 ± 1.21閉鎖卵泡（個）21.00 ± 4.00 31.83 ± 4.83##30.33 ± 8.66 28.50 ± 7.84 23.17 ± 5.53*

圖2 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學比較（左×100,右×400）

3.4 滋腎安坤顆粒對免疫性POI 小鼠血清E2、FSH、AMH水平的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清E2、AMH 水平降低，F(xiàn)SH 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，各治療組E2、FSH、AMH水平均有好轉趨勢，其中滋腎安坤高劑量組和戊酸雌二醇組小鼠血清E2、AMH 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；滋腎安坤高劑量組小鼠血清FSH 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見表2）。

表2 小鼠血清E2、FSH、AMH水平（±s，n=8）

表2 小鼠血清E2、FSH、AMH水平（±s，n=8）

注：與空白對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

AMH濃度（ng·mL-1）3.00±0.14 2.71±0.11##2.81±0.14 2.92±0.19*2.95±0.19**組別空白對照組模型組滋腎安坤低劑量組滋腎安坤高劑量組戊酸雌二醇組E2濃度（pmol·L-1）48.46±2.54 42.61±4.20##45.17±2.97 46.27±2.30*46.69±3.63*FSH濃度（mIU·mL-1）55.10±2.73 62.95±4.61##59.68±2.76 58.91±3.93*59.77±3.80

3.5 滋腎安坤顆粒對免疫性POI 小鼠血清IL-2、IL-6、TGF-β水平的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-2、IL-6水平升高，TGF-β 水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，各治療組小鼠血清IL-2、IL-6、TGF-β 水平有改善趨勢。其中滋腎安坤低、高劑量組及戊酸雌二醇組血清IL-2水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；滋腎安坤高劑量組IL-6 水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；滋腎安坤高劑量組、戊酸雌二醇組TGF-β 水平上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見表3）。

表3 小鼠血清IL-2、IL-6、TGF-β水平（±s，n = 8）

表3 小鼠血清IL-2、IL-6、TGF-β水平（±s，n = 8）

注：與空白對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

TGF-β濃度（pg·mL-1）639.41±38.18 548.25±70.75##578.66±40.81 609.81±31.04*603.31±35.19*組別空白對照組模型組滋腎安坤低劑量組滋腎安坤高劑量組戊酸雌二醇組IL-2濃度（pg·mL-1）255.93±9.54 286.91±19.95##271.28±14.85*262.01±13.48**269.74±15.86*IL-6濃度（pg·mL-1）77.79±4.80 87.34±5.24##82.20±4.80 80.24±5.11*82.00±8.66

4 討論

POI 是指女子未到“七七”之年而出現(xiàn)天癸早竭，年未老而經(jīng)水先斷，可歸于祖國醫(yī)學中月經(jīng)過少、月經(jīng)后期、閉經(jīng)、不孕、經(jīng)水早斷等范疇。腎為先天之本，藏精，司元氣，天癸亦藏于腎中，天癸早竭，則多責之于腎?！端貑枴り庩枒蟠笳摗吩唬骸澳I生骨髓，髓生肝”，而女子以肝為先天，故腎藏精，肝藏血，精血相生，腎陰與肝陰相互滋養(yǎng)。若肝腎陰傷，腎精不充，精血匱乏，則可發(fā)展為天癸早竭。魏紹斌教授應用歸腎丸加減“異病同治”治療卵巢功能減退類疾病（腎虛精虧型）的臨床研究表明其可改善患者臨床癥狀，增加子宮體積，改善E2 和FSH 激素水平[8]。徐京曉等[9]發(fā)現(xiàn)歸腎丸聯(lián)合芬嗎通可有效改善卵巢功能減退患者促排卵效果，提高患者的性激素及AMH 水平，抑制炎性因子TNF-α 水平，且不良反應小。同時張圣江等[10]研究表明歸腎丸加減治療腎虛型卵巢儲備功能下降不孕癥，不僅可改善臨床癥狀及卵巢功能，還可提高妊娠率及免疫調(diào)節(jié)因子TGF-β 的表達。而滋腎安坤顆粒正是由歸腎丸化裁而來，方用黃芪、黨參益氣升陽，鼓舞氣血生化；熟地滋陰養(yǎng)血，益精填髓，為補血填精之良藥；當歸養(yǎng)血活血以調(diào)經(jīng)；山茱萸、杜仲、枸杞子、菟絲子等肝腎同補；輔以淮山藥等補后天以養(yǎng)先天，全方補而不滯，滋而不膩。諸藥合用，借其陰陽互化，精生血長之力，奏滋腎益肝，養(yǎng)血填精之效?，F(xiàn)代藥理研究表明，滋腎安坤顆粒中的藥物含有多糖類、黃酮類、植物甾醇類等成分，具有雌激素樣活性，并可抑制機體炎癥反應，調(diào)節(jié)免疫應答。如黃芪含有水溶性的黃芪多糖，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥等方面具有顯著的生物活性[11]；熟地黃水提物可以活化輔助性T 細胞，促進IL-2、IFN-γ 等細胞因子的產(chǎn)生，進而促進其相關抗體的產(chǎn)生，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[12]；菟絲子總黃酮具有較好的雌激素活性，可明顯促進性未成熟小鼠子宮增重，增加子宮內(nèi)膜厚度等，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸的紊亂狀態(tài)[13-14]。

動情周期異常是卵巢功能衰竭的顯著特征[15]，血清AMH、FSH、E2 水平也可作為評價小鼠卵巢功能的指標。其中E2 主要由卵巢顆粒細胞生成，可調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育以及成熟，增強發(fā)育卵泡對促性腺激素的敏感性，促優(yōu)勢卵泡形成；作為轉化生長因子β（TGFβ）家族成員之一的AMH 是由卵巢的竇前卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細胞合成并分泌，對卵泡的發(fā)育至關重要，可反映卵巢儲備功能，在臨床上常作為女性生育能力診斷和預后的標志物[16]。卵巢功能不全可見原始卵泡缺乏或不足、卵泡生長發(fā)育異常、卵泡提前耗竭等。POI 是病因復雜且進行性發(fā)展的疾病，機體發(fā)生自身免疫異常，產(chǎn)生抗透明帶抗體是導致POI 發(fā)病的一個重要原因[17]。故本實驗通過ZP3 建立免疫性POI 小鼠模型，檢測顯示其動情周期延長紊亂、血清FSH 濃度上升、血清AMH 和E2 濃度下降以及生長卵泡減少、閉鎖卵泡增多、炎細胞浸潤等與人類自身免疫性POI 的表現(xiàn)較為符合。本研究中各治療組小鼠生殖激素水平和卵巢形態(tài)均有改善，其中滋腎安坤高劑量組對小鼠生長卵泡和促卵泡激素的改善趨勢更為明顯。其表明滋腎安坤顆粒能夠在一定程度上改善免疫性POI 小鼠生殖激素水平和卵巢形態(tài)，提高卵巢儲備能力。

免疫性POI發(fā)生相關的細胞因子有腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（INF）及白細胞介素（IL）家族、轉化生長因子β（TGF-β）等[18]。其中IL-2 主要由活化的CD4+T 細胞產(chǎn)生，可誘導和激活機體多種免疫細胞發(fā)揮效應，是評價機體免疫功能的重要指標之一。而IL-6 作為一種促炎和調(diào)節(jié)免疫的多效能細胞因子，參與機體的炎癥反應和免疫應答。TGF-β 是一種有效的免疫抑制因子，通過影響細胞分化和細胞增殖而發(fā)揮作用[19]。另有研究表明輔助性T細胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）與POI的發(fā)生發(fā)展存在一定相關性，其表達的失衡可引發(fā)免疫調(diào)節(jié)紊亂以致卵巢組織破壞、衰竭[20]。進一步綜合分析發(fā)現(xiàn)，Th17 細胞和Treg細胞共享由TGF-β 介導的共同信號通路：在T 細胞抗原受體/共刺激信號及TGF-β 與IL-6 的刺激下可激活轉錄激活因子3（STAT3）進而誘導轉錄因子RAR 相關孤兒受體（ROR）γt的表達以驅動幼稚的CD4+T細胞分化為Th17 細胞，以引起自身免疫和炎癥；同時STAT3還通過下調(diào)叉頭轉錄因子蛋白3（Foxp3）的表達來抑制Treg 細胞分化；但在沒有促炎細胞因子的情況下，TGF-β 驅動CD4+T 細胞分化為具有負免疫調(diào)節(jié)功能的Treg細胞，產(chǎn)生抗炎細胞因子IL-10和TGF-β，以抑制免疫反應及維持免疫穩(wěn)態(tài)[21]。而IL-2 具有刺激傳統(tǒng)T細胞以促進免疫和維持Treg細胞以控制免疫的雙向調(diào)節(jié)作用[22]。其免疫效應與各種亞型免疫細胞所處的狀態(tài)，表面IL-2R 的類型和強度、IL-2 的來源和濃度等相關[23]。如低劑量的IL-2 在Treg 細胞發(fā)育中不可或缺，通過調(diào)節(jié)STAT5 通路和Foxp3 表達來維持Treg 細胞擴增和功能抑制免疫，而高劑量的IL-2 同時可激活幼稚T 細胞和NK 細胞促進免疫[24]。在本研究中模型組小鼠血清IL-2、IL-6 水平顯著升高，TGF-β水平顯著降低；而滋腎安坤顆粒高劑量組IL-2、IL-6水平明顯下降，TGF-β 水平上升，且有優(yōu)于戊酸雌二醇組的趨勢。由此推測，免疫性POI 的發(fā)生發(fā)展可能與IL-2、IL-6 以及TGF-β 的表達具有相關性，一定程度上體現(xiàn)了現(xiàn)代免疫學所指出的免疫失衡是疾病的根本原因；而滋腎安坤顆?？赡芡ㄟ^影響IL-2、IL-6、TGF-β 水平，在免疫和炎癥之間取得平衡，從而降低免疫性POI小鼠卵巢炎性反應，調(diào)節(jié)免疫紊亂，對卵巢起到保護作用。

綜上所述，滋腎安坤顆?？筛纳泼庖咝訮OI 小鼠血清生殖激素和IL-2、IL-6、TGF-β 水平，降低卵巢炎性反應，調(diào)節(jié)免疫紊亂，提高卵巢儲備能力，發(fā)揮對卵巢的保護作用。但是該實驗中滋腎安坤顆粒尚未達到逆轉卵巢功能下降的效果，提示POI 應注重未病先防，既病防變；同時可考慮延長治療時間，以進一步提高療效?？紤]到POI 患者發(fā)病多為育齡期女性，其生育能力的改善對患者至關重要，而中醫(yī)藥具有調(diào)經(jīng)助孕種子的優(yōu)勢，故有必要進一步研究其對遠期妊娠率的影響。由于中藥是通過多成分、多靶點、多通路調(diào)控疾病，以達到整體系統(tǒng)的治療，加之POI的發(fā)病因素復雜，不僅局限于卵巢炎性反應、免疫功能紊亂，因此，針對其他病因的中醫(yī)藥作用靶點和療效機制還有待進一步的實驗研究以探索和證實。