加減養(yǎng)精種玉湯通過Rictor/mTORC2通路改善大鼠卵巢儲備功能的機制研究

〔摘要〕 目的 探討加減養(yǎng)精種玉湯通過雷帕霉素不敏感性伴隨蛋白（rapamycin-insensitive companion of mTOR， Rictor）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2（mammalian targeting of rapamycin complex 2， mTORC2）通路改善大鼠卵巢儲備功能的作用機制。方法 準備動情周期正常的雌性SD大鼠32只，隨機選取其中8只作為空白組（等劑量生理鹽水灌胃），其余SD大鼠首次腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/mL后連續(xù)14 d腹腔注射8 mg/kg誘導卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve， DOR）模型。按隨機數(shù)字表法將造模成功的24只大鼠分為模型組（等劑量生理鹽水灌胃）、中藥組（加減養(yǎng)精種玉湯3.39 g/kg灌胃）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone， FSH）組（FSH 0.105 mg/kg灌胃）。記錄大鼠動情周期;HE染色觀察左側(cè)卵巢組織病理學變化并計算各組大鼠左側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)量;計算子宮、左側(cè)卵巢系數(shù);ELISA法測定FSH、黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、雌二醇（estradiol， E2）、抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）水平;Western blot檢測大鼠左側(cè)卵巢組織Rictor、mTORC2蛋白表達水平。結(jié)果 與空白組相比，模型組動情周期次數(shù)減少（Plt;0.05）;左側(cè)卵巢成熟卵泡少;左側(cè)卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)、左側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)量均降低（Plt;0.05，Plt;0.01）;血清AMH、E2降低（Plt;0.01），LH、FSH升高（Plt;0.01）;左側(cè)卵巢組織Rictor、mTORC2蛋白相對表達量升高（Plt;0.01）。與模型組比，中藥組及FSH組左側(cè)卵巢結(jié)構(gòu)改善，各級卵泡數(shù)量增加;左側(cè)卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)、左側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)量均上升（Plt;0.05）;血清AMH、E2升高（Plt;0.01），LH、FSH降低（Plt;0.01）;左側(cè)卵巢組織Rictor、mTORC2蛋白相對表達量降低（Plt;0.01）。結(jié)論 加減養(yǎng)精種玉湯能夠改善激素水平、調(diào)節(jié)卵巢卵泡細胞，從而起到改善DOR的作用，其機制可能與降低Rictor/mTORC2的表達有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 加減養(yǎng)精種玉湯;Rictor/mTORC2通路;卵巢儲備功能;動情周期;環(huán)磷酰胺誘導

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.08.002

Mechanism of modified Yangjing Zhongyu Decoction improving ovarian reserve function in rats through Rictor/mTORC2 pathway

LIU Yinglian， WANG Xian， ZHANG Wenlong， YUE Wen， ZHOU Xiazhi*

School of Chinese Medicine， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199， China

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of modified Yangjing Zhongyu Decoction （MYJZYD） on improving ovarian reserve function in rats through rapamycin-insensitive companion of mTOR （Rictor）/mammalian targeting of rapamycin complex 2 （mTORC2） pathway. Methods A total of 32 female SD rats with normal estrous cycle were included， eight of which were randomly selected as blank group （receiving equal dose of normal saline）， and the diminished ovarian reserve （DOR） model was induced in the remaining rats through an initial intraperitoneal injection of cyclophosphamide at 50 mg/ml followed by continuous intraperitoneal injections 8 mg/kg per day for 14 days. According to random number table method， 24 rats were divided into model group （receiving equal dose of normal saline）， Chinese medicine group （receiving MYJZYD 3.39 g/kg intragastric administration）， and follicle-stimulating hormone （FSH） group （receiving FSH 0.105 mg/kg intragastric administration）. The estrous cycle of rats was recorded， and the histopathological changes in the left ovary were observed by HE staining. The number of antral follicles in the left ovary of rats in each group was calculated， and the coefficients of uterus and the left ovary were calculated. Serum levels of FSH， luteinizing hormone （LH）， estradiol （E2）， and anti-Müllerian hormone （AMH） were measured by ELISA. The expression levels of Rictor and mTORC2 proteins in the left ovarian tissue of rats were determined by Western blot. Results Compared with the blank group， the model group showed a reduction in the number of estrous cycles （Plt;0.05）; the left ovarian structure was relatively disordered with fewer mature follicles; the left ovarian index， uterine index， and the number of antral follicles in the left ovary were all decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）， the serum AMH and E2 levels decreased （Plt;0.01）， while serum LH and FSH levels increased （Plt;0.01）. The relative expression levels of Rictor and mTORC2 proteins in the left ovarian tissue were higher （Plt;0.01）. Compared with the model group， the structure of the left ovary was improved and the number of follicles at all levels was significantly lower in the Chinese medicine group and FSH group. The left ovarian index， uterine index， and the number of antral follicles in the left ovary all increased （Plt;0.05）. Serum AMH and E2 levels increased （Plt;0.01）， while LH and FSH levels decreased （Plt;0.01）; the relative expression levels of Rictor and mTORC2 proteins in the left ovarian tissue were higher （Plt;0.01）. Conclusion MYJZYD can improve hormone levels， regulate ovarian follicle cells， thus playing a role in improving DOR. Its mechanism may be related to reducing the expression of Rictor/mTORC2.

〔Keywords〕 modified Yangjing Zhongyu Decoction; Rictor/mTORC2 pathway; ovarian reserve function; estrous cycle; cyclophosphamide induction

卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve， DOR）是指卵巢內(nèi)卵母細胞的數(shù)目減少和（或）質(zhì)量降低，伴抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）水平下降、竇卵泡數(shù)減少、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone， FSH）升高，表現(xiàn)為生育能力降低，但與年齡和月經(jīng)改變無關(guān)[1]。研究表明，在DOR基礎(chǔ)上“病欲發(fā)而有先兆”，即發(fā)展為早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency， POI），若未能盡早及時干涉則可在1～6年內(nèi)進一步惡化并發(fā)展成為卵巢早衰（premature ovarian failure， POF）[2]。而近年來，該發(fā)病率逐年上升[3]，DOR作為導致育齡女性發(fā)生不孕的主要致病因素，嚴重影響女性的生殖健康、心理健康以及生活質(zhì)量。因此，采取積極措施防治DOR，預防其發(fā)展成為POI或POF至關(guān)重要。

DOR的病因尚不明確，目前仍無確切有效的方法恢復卵巢功能，西醫(yī)在治療上主要采用激素補充療法，可改善臨床癥狀和恢復月經(jīng)周期，但慎用及禁忌證較多，且患者卵巢儲備功能及生育力改善效果并不明顯[4]。體外受精-胚胎移植成為有生育需求的DOR不孕患者主要的輔助生殖技術(shù)，但該類患者卵巢低反應率高，且獲卵率、優(yōu)胚率均低于卵巢功能正常女性，即使妊娠成功，但面臨高風險的流產(chǎn)率[5]。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)卵巢功能方面，有獨特的優(yōu)勢，具有增加卵巢血供、改善卵巢和子宮局部微環(huán)境的優(yōu)點，并通過多系統(tǒng)、多靶點調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢生殖軸，增加卵巢對促性腺激素的反應、提高卵巢組織雌激素受體含量以保護卵巢功能[6]。相比西醫(yī)治療存在的不良反應，中醫(yī)治療具有安全有效且療效穩(wěn)定的優(yōu)勢[7]。

中醫(yī)學認為，DOR的基本病機為腎陰虧虛、精血不足，在治療時，多以補腎陰、益精血為主[8]。養(yǎng)精種玉湯出自《傅青主女科·種子篇》[9]，為“種子十方”的第一方，具有補血生精的功效，主治身瘦血虛不孕。原方由熟地黃、當歸、白芍、山茱萸組成。經(jīng)過臨床醫(yī)師對養(yǎng)精種玉湯數(shù)百年的反復實踐，現(xiàn)已成為治療不孕癥的基礎(chǔ)方[10]。本研究以養(yǎng)精種玉湯為基礎(chǔ)方，結(jié)合臨床經(jīng)驗加減化裁，自擬加減養(yǎng)精種玉湯以奏滋腎陰、益精血之效。在體外研究發(fā)現(xiàn)，加減養(yǎng)精種玉湯含藥血清能有效啟動原始卵泡發(fā)育[11]。本課題組在前期研究中明確了加減養(yǎng)精種玉湯治療DOR的最佳濃度，發(fā)現(xiàn)其可能通過磷脂酰肌醇-3-羥基酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， AKT）信號通路增加生長卵泡數(shù)量，改善激素水平，從而延緩卵巢衰老進程[12]。基于此，為進一步揭示加減養(yǎng)精種玉湯治療DOR作用的分子機制，本研究擬從卵泡顆粒細胞雷帕霉素不敏感性伴隨蛋白（rapamycin-insen?sitive companion of mTOR， Rictor）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2（ma?mmalian targeting of rapamycin complex" 2，" mTORC2）信號通路觀察加減養(yǎng)精種玉湯如何調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢生殖軸平衡，進而改善卵巢功能的可能機制，為臨床研究提供基礎(chǔ)循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1" 實驗動物

5周齡SPF級SD雌性大鼠32只，體質(zhì)量160～200 g，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0011。按照國家標準嚙齒類實驗動物飼養(yǎng)，在（23±2） ℃恒定室溫、濕度40%～45%、12 h明暗交替環(huán)境下，實驗動物自由飲水、攝食。動物實驗獲海南醫(yī)學院倫理委員會審批（倫理審批號：HYLL-2021-056），所有操作均符合《實驗動物管理條件》要求。

1.2" 主要藥物與試劑

加減養(yǎng)精種玉湯：熟地黃10 g、當歸10 g、白芍10 g、山茱萸10 g、黃精20 g、葛根20 g、陳皮10 g、神曲10 g、菟絲子30 g、雞血藤20 g、香附10 g、甘草6 g，以上藥物的免煎顆粒均購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司（批號：191009、2203142、2009025、2112021、2211024、2211031、2312034、2313051、2313?052、2317066、2412017、2413022）。雌二醇（estradiol， E2）、FSH、大鼠黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、AMH ELISA試劑盒（上海泛柯生物科技有限公司，批號：F3450-B、F3441-B、F3499-B、F3095-B）;重組Anti-Rictor抗體、Anti-mTORC2抗體（美國Abcam公司，批號：ab219950、ab109081）。注射用FSH（寧波第二激素廠，規(guī)格：100 IU，批號：200919）;注射用環(huán)磷酰胺（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：0.1 g，國藥準字：H32020856，批號：20031825）。

1.3" 主要實驗儀器

高速冷凍離心機（長沙科威實業(yè)有限公司，型號：5418R）;超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號：CW-SJ-1FD）;電泳儀（上海天能科技有限公司，型號：EPS300）;接觸式無損定量成像儀（上海易孛特生命科學有限公司，型號：Touch lmager）;石蠟切片機（英國Shandon公司，型號：KD-2508）。

1.4" 造模及分組

大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、模型組、中藥組、FSH組，每組8只。除空白組外，其余各組正常動情周期的大鼠采用腹腔注射環(huán)磷酰胺造模[13]。首次負荷劑量50 mg/kg，隨后每天8 mg/kg連續(xù)腹腔注射14 d以誘導DOR大鼠模型。當50%大鼠出現(xiàn)動情期紊亂時，視為造模成功[14]。SD大鼠給藥劑量按照人與動物的藥量換算法進行計算[15]，F(xiàn)SH組灌胃劑量為0.105 mg/kg，中藥組加減養(yǎng)精種玉湯每天灌胃劑量參考前期實驗結(jié)果[12]的最佳干預濃度3.39 g/kg，空白組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.5" 取材

末次給藥后禁食不禁水12 h，大鼠以0.4%戊巴比妥（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉后稱取質(zhì)量，腹主動脈采血、處死，于冰上迅速取子宮、左側(cè)卵巢。全血樣本以4 ℃ 12 000 r/min離心10 min（離心半徑8.5 cm）后取上層血清，-80 ℃冰箱內(nèi)保存，左側(cè)卵巢采用4%多聚甲醛固定。

1.6" 檢測指標

1.6.1" 器官濕重及器官系數(shù)" 取子宮、左側(cè)卵巢，剔除表面脂肪組織，電子天平稱重后參照文獻[16]方法計算子宮、左側(cè)卵巢指數(shù)。子宮指數(shù)=子宮濕重（mg）/處死前大鼠體質(zhì)量（g）×100%;左側(cè)卵巢指數(shù)=左側(cè)卵巢濕重（mg）/處死前大鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.6.2" HE染色觀察左側(cè)卵巢組織病理學變化" 各組取材后，用多聚甲醛固定及蔗糖脫水后置于石蠟中包埋，將包埋大鼠左側(cè)卵巢的石蠟塊切成4 μm的切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，經(jīng)蘇木精初染5 min和伊紅復染4 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察左側(cè)卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6.3" ELISA檢測血清激素水平" 取出各組血清樣品置于冰上融化，于4 ℃離心機中12 000 r/min 離心20 min（離心半徑8.5 cm），取上清液。加入FSH、LH、E2、AMH標準品1 mL至標準管中，靜置10 min并充分溶解。進行2倍比稀釋，配制不同濃度的標準品。加樣封板后，37 ℃條件下溫育90 min，加酶后洗滌，每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，封板后置于37 ℃烘箱中溫育30 min。再次洗滌后加底物溶液，封板膜封板后置于37 ℃烘箱中溫育15 min進行顯色。加終止液終止反應，15 min內(nèi)在450 nm波長測量各孔的吸光度（OD值），繪出標準曲線和標準方程，計算每個樣本的濃度。

1.6.4" Western blot檢測左側(cè)卵巢組織Rictor和mTORC2的蛋白水平表達" 將左側(cè)卵巢組織按照實驗試劑說明書進行蛋白的提取、裂解得到組織總蛋白產(chǎn)物，并進行蛋白濃度測定、配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，在5%脫脂牛奶里加入PVDF膜在室溫下?lián)u床反應1 h，加一抗Rictor（稀釋比1∶500）、mTORC2（稀釋比1∶1 000），放置4 ℃冰箱孵育過夜，次日用1×TBST緩沖液沖洗5 min， 反復2次后加HRP，室溫輕搖1 h，沖洗10 min，反復2次;將PVDF膜浸泡于ECL中顯色，最后用Image J軟件對目的條帶進行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參照進行比對。

1.7" 統(tǒng)計方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0軟件分析，計量資料用“x±s”表示，多組比較采用單因素方差One-way ANOVA分析，組間多重比較采用LSD法，計數(shù)資料以“例（%）”表示，非等級技術(shù)資料用常規(guī)或矯正檢驗。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1" 加減養(yǎng)精種玉湯對DOR大鼠動情周期的影響

與空白組相比，模型組動情周期次數(shù)減少（Plt;0.05）。模型組動情3次、中藥組4次、FSH組4次，3組間比較未見差異（Pgt;0.05）。詳見表1。

2.2" 加減養(yǎng)精種玉湯對DOR大鼠左側(cè)卵巢、子宮指數(shù)和左側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)量的影響

與空白組相比，模型組左側(cè)卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)、左側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)量均降低（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組相比，中藥組、FSH組左側(cè)卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)、左側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)量升高（Plt;0.05）。詳見表2。

2.3" 加減養(yǎng)精種玉湯對造模前后DOR大鼠血清激素指標的影響

與空白組相比，模型組血清AMH、E2顯著降低（Plt;0.01），血清LH、FSH升高顯著升高（Plt;0.01）;中藥組、FSH組血清AMH、E2顯著高于模型組（Plt;0.01），血清LH、FSH顯著低于模型組（Plt;0.01）。詳見表3。

2.4" 加減養(yǎng)精種玉湯對DOR大鼠左側(cè)卵巢組織病理影響

空白組大鼠左側(cè)卵巢結(jié)構(gòu)清晰，左側(cè)卵巢內(nèi)可見正常卵泡。與空白組比較，模型組大鼠左側(cè)卵巢結(jié)構(gòu)成熟卵泡少，以初級卵泡和閉鎖卵泡居多;與模型組比較，中藥組、FSH組大鼠各級卵泡數(shù)量明顯增加，可見多個閉鎖卵泡，劑量組閉鎖卵泡和初級卵泡相對減少，形態(tài)接近空白組。詳見圖1。

2.5" 加減養(yǎng)精種玉湯對DOR大鼠左側(cè)卵巢組織Rictor和mTORC2的蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組Rictor、mTORC2蛋白表達量顯著升高（Plt;0.01）;中藥組、FSH組Rictor、mTORC2蛋白相對表達量顯著低于模型組（Plt;0.01）。詳見圖2、表4。

3 討論

養(yǎng)精種玉湯由熟地黃、山茱萸、白芍、當歸組成，行大補腎水、養(yǎng)血補肝之力，對腎虛血虧的不孕癥患者有顯著的治療效果。此方不特補血而純于填精，精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物，皆受孕之道也[17]。加減養(yǎng)精種玉湯主要由養(yǎng)精種玉湯化裁而來，在養(yǎng)精種玉湯原方基礎(chǔ)上減熟地黃、當歸、白芍、山茱萸四藥的用量，并加入黃精、葛根、陳皮、神曲、菟絲子、雞血藤、香附、甘草。其中黃精滋陰補血、補腎健脾;菟絲子補益肝腎、固精縮尿，二者相合可益氣而補腎陰;香附、雞血藤養(yǎng)血活血行氣;陳皮、神曲、甘草可健脾益氣;葛根以清熱生津，諸藥合用共奏滋腎陰、益精血之效。養(yǎng)精種玉湯現(xiàn)已成為治療不孕癥的基礎(chǔ)方劑，依據(jù)其加減治療DOR實際臨床療效較好，具有較高的研究價值[10]。

現(xiàn)代研究證實，養(yǎng)精種玉湯對治療DOR有獨特的效果，李宛靜等[18-19]通過分析DOR模型大鼠RNA-m6A修飾，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精種玉湯能通過上調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶3、α酮戊二酸依賴雙加氧酶等水平，從而影響細胞自噬，改善激素水平、卵巢功能，起到治療DOR的效果。李敏艷[20]通過臨床試驗也證明了養(yǎng)精種玉湯可通過改善LH、FSH水平，從而促進卵泡發(fā)育與成熟，并增強排卵作用。同時，加減養(yǎng)精種玉湯作為中藥方劑，相較于FSH等激素補充療法，具有成本低、毒副作用小、致癌風險小等優(yōu)勢，在臨床治療中，可以考慮作為FSH的替代藥物進行DOR的治療[21]。

研究結(jié)果表明，相對于模型組，中藥組與FSH組的DOR大鼠AMH、E2激素水平明顯增高，而LH、FSH激素水平明顯降低，提示加減養(yǎng)精種玉湯可以有效改善DOR大鼠激素水平。同時，相對于模型組，中藥組與FSH組的DOR大鼠左側(cè)卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)、左側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)量均得到改善，其中左側(cè)卵巢指數(shù)接近空白組，并且通過病理組織觀察可見中藥組、FSH組的DOR的大鼠各級卵泡數(shù)量明顯增加，多個閉鎖卵泡，劑量組閉鎖卵泡和初級卵泡相對減少，形態(tài)接近空白組，提示加減養(yǎng)精種玉湯可以顯著的改善DOR大鼠生殖系統(tǒng)與左側(cè)卵巢組織。

目前，已應用于臨床的卵泡激活相關(guān)通路主要有人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因/PI3K/AKT通路、Hippo通路與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian targeting of rapamycin， mTOR）通路[22]。mTOR是一種調(diào)節(jié)細胞生長與增殖的絲氨酸/蘇氨酸激酶，也是mTORC1和mTORC2的關(guān)鍵亞基。mTORC1參與了卵泡激活過程中顆粒細胞的活動，而mTORC2與卵泡生長發(fā)育及存活相關(guān)[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，Rictor誘導卵泡細胞大量凋亡的同時，能抑制卵泡中P13K信號通路的活性，同時能抑制mTORC2在卵子發(fā)育和成熟、卵泡凋亡閉鎖、卵巢功能的表達[25]?？梢姡琑ictor作為mTORC2中的核心組分，Rictor/mTORC2信號通路在多種細胞的增殖、代謝、凋亡等過程中都發(fā)揮重要的作用[26]。然而Rictor/mTORC2信號通路在DOR方面的研究相對較少，本項實驗結(jié)果表明，模型組的Rictor、mTORC2蛋白表達量顯著增高，相反，中藥組的DOR大鼠Rictor、mTORC2蛋白表達量顯著低于模型組，提示加減養(yǎng)精種玉湯可能通過降低Rictor/mTORC2信號通路的表達，從而調(diào)節(jié)卵巢卵泡細胞調(diào)亡水平及卵巢儲備功能，進而改善DOR。

綜上所述，加減養(yǎng)精種玉湯可以通過降低Rictor/mTORC2的表達，從而有效的改善DOR的生殖系統(tǒng)，提高AMH、E2激素水平，降低FSH、LH激素水平，增加各級卵泡細胞數(shù)量，調(diào)節(jié)卵巢卵泡細胞凋亡水平，恢復卵巢功能及形態(tài)，起到治療DOR的作用。加減養(yǎng)精種玉湯作為中藥復方，其多功效、多靶點、配伍協(xié)同機制還有待進一步。本研究為后續(xù)深入研究加減養(yǎng)精種玉湯治療DOR提供了前期實踐基礎(chǔ)。

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〔收稿日期〕2024-03-23

〔基金項目〕海南省自然科學基金高層次人才項目（821RC565）;海南省衛(wèi)生健康科技創(chuàng)新聯(lián)合項目（WSJK2024MS164）。

〔通信作者〕*周夏芝，女，碩士，副教授，E-mail：xiazhi08@163.com。