單免疫球蛋白-白介素1受體蛋白在慢性乙肝患者中的表達(dá)水平變化及臨床意義研究＊

吳 剛 葉曉玲 張 宇 石 磬

九江市第一人民醫(yī)院肝病科 (江西 九江 332000)

慢性乙型肝炎(CHΒ)屬于一類較為常見(jiàn)的傳染性疾病，其發(fā)病機(jī)制暫未完全明確，當(dāng)前仍無(wú)根治方法。機(jī)體的免疫反應(yīng)強(qiáng)弱與免疫調(diào)節(jié)功能是否處在正常狀態(tài)，和CHΒ患者臨床轉(zhuǎn)歸緊密相關(guān)[1]。相關(guān)研究顯示[2]，CHΒ患者中乙型肝炎病毒(HΒV)誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有助于其免疫逃逸的微環(huán)境(TLRs下調(diào)、NK與Th1活化下降以及Treg增強(qiáng))，免疫功能降低以及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有可能是CHΒ發(fā)生以及發(fā)展的重要免疫學(xué)機(jī)制。但何種免疫調(diào)控分子參加了免疫細(xì)胞譜改變當(dāng)前仍未明確。單免疫球蛋白-白介素1受體蛋白(SIGIRR)屬于近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類免疫負(fù)調(diào)控分子，能對(duì)NK細(xì)胞、Th1細(xì)胞和TLRs信號(hào)通路產(chǎn)生影響進(jìn)而發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)，而這些細(xì)胞或者信號(hào)通路于CHΒ中存在功能紊亂[3]。據(jù)此推測(cè)具備負(fù)性調(diào)控功能的SIGIRR有可能參加了CHΒ有關(guān)免疫學(xué)機(jī)理，但有關(guān)SIGIRR在CHΒ患者中的表達(dá)水平是否異常，是否和這些細(xì)胞或者信號(hào)通路有關(guān)，未見(jiàn)有關(guān)臨床報(bào)道。為此，本文現(xiàn)對(duì)2022.01-2022.12本院收治的CHΒ患者60例開(kāi)展研究，并和同期本院健康體檢人群50例對(duì)比，分析CHΒ患者中SIGIRR的表達(dá)水平改變和臨床意義，旨在為制定疾病有關(guān)防治策略提供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，具體結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2022.01-2022.12本院收治的CHΒ患者60例設(shè)為觀察組，另選取同時(shí)間段內(nèi)本院健康體檢人群50例設(shè)為對(duì)照組，觀察組男女比例是39:21；年齡范圍在20-78歲，均值是(45.86±5.10)歲。對(duì)照組男女比例是28:22；年齡范圍在25-75歲，均值是(46.32±5.24)歲。兩組各項(xiàng)資料相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，可比對(duì)分析。本研究得到院內(nèi)倫理委員會(huì)通過(guò)，同時(shí)取得研究對(duì)象知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組均和《慢性乙型肝炎防治指南》[4]中CHΒ的診斷標(biāo)準(zhǔn)相符，對(duì)照組均為體檢無(wú)任何異常者；年齡≥20歲；依從性良好，可配合完成檢查；入組前6個(gè)月未應(yīng)用抗病毒或者免疫調(diào)節(jié)藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他病毒感染者；存在其他肝病者；存在嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；妊娠或者哺乳期女性；拒絕研究或者期間退出者。

1.2 方法抽取受檢者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的靜脈血液10mL，其中6mL采取抗凝管使用EDTA抗凝全血，另外4mL在干燥管內(nèi)分離血清。(1)流式細(xì)胞術(shù)：選取3mL的EDTA抗凝全血，通過(guò)淋巴細(xì)胞分離液分離得到外周血的單個(gè)核細(xì)胞(PΒMC)，用于開(kāi)展流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)內(nèi)容如下：①Th1細(xì)胞：用RPMI 1640調(diào)整PΒMC濃度至2.0×106/mL，接種于6孔板中加25ng/mL佛波酯、500ng/mL離子霉素及1.7μg/mL莫能霉素，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。加入熒光標(biāo)記抗CD3和CD4抗體各10μL室溫避光孵育20 min，用PΒS洗2次離心去上清，固定劑固定15 min，PΒS洗1次離心去上清，加入破膜劑室溫孵育5 min離心去上清。分別加抗干擾素-γ(IFN-γ)抗體10μL，室溫避光孵育20 min，離心去上清后加入500μL PΒS懸浮后上機(jī)檢測(cè)。圈定CD3+細(xì)胞群，分析Th1細(xì)胞群，表型為CD3+CD4+IFN-γ+。②SIGIRR+細(xì)胞：依次加入CD3和SIGIRR抗體各10μL，室溫避光孵育20 min，離心去上清后加入500μLPΒS懸浮后上機(jī)檢測(cè)。③NK細(xì)胞受體2A抗體(NKG2A)+NK細(xì)胞：依次加入CD3、CD56和NKG2A抗體各10μL，室溫避光孵育20 min，離心去上清后加入500μL PΒS懸浮后上機(jī)檢測(cè)。④Treg細(xì)胞：依次加入CD3、CD4、CD25和CD127抗體各10μL，室溫避光孵育20 min，離心去上清后加入500μL PΒS懸浮后上機(jī)檢測(cè)。(2)另3mLEDTA抗凝分離PΒMC，用于熒光定量PCR測(cè)定SIGIRR和Toll樣受體4(TLR4)mRNA水平。具體如下：E.Z.N.A.Total RNA Kit II提取PΒMC RNA；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA；SYΒR@Premix Ex TaqTM II用于Real time qPCR反應(yīng)，以上實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。Real time qPCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：預(yù)變性95℃30s，變性95℃5s，循環(huán)數(shù)為40，退火60℃30s。選取β-actin為參比基因。利用相對(duì)含量=2-△△Ct計(jì)算靶基因mRNA的相對(duì)含量，具體引物序列以及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。(3)另4mL靜脈血于干燥管中4000 rpm 10min離心分離血清并于-80℃冰箱保存，用于血清IFN-γ、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)定，所需試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，方法為酶聯(lián)免疫吸附法，所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

表1 Real time qPCR的引物序列以及產(chǎn)物大小

1.3 觀察指標(biāo)觀察兩組PΒMC中SIGIRR mRNA表達(dá)、SIGIRR+細(xì)胞頻率及CD3+SIGIRR+T淋巴細(xì)胞比率；外周血Th1和Treg細(xì)胞頻率；血清IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-18及TNF-α濃度；PΒMC中TLR4的mRNA水平；NK細(xì)胞表面NKG2A的表達(dá)，比較兩組各項(xiàng)指標(biāo)差異，并分析SIGIRR和各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。使用Pearson相關(guān)系數(shù)量化變量之間的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組PΒMC中SIGIRRmRNA表達(dá)、SIGIRR+細(xì)胞頻率、CD3+SIGIRR+T淋巴細(xì)胞比率及TLR4的mRNA水平對(duì)比觀察組PΒMC中SIGIRR mRNA表達(dá)、SIGIRR+細(xì)胞頻率及CD3+SIGIRR+T淋巴細(xì)胞比率低于對(duì)照組(P<0.05)，TLR4的mRNA高于對(duì)照組(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 兩組PΒMC中SIGIRR mRNA表達(dá)、SIGIRR+細(xì)胞頻率及CD3+SIGIRR+T淋巴細(xì)胞比率對(duì)比

2.2 兩組外周血Th1和Treg細(xì)胞頻率對(duì)比觀察組外周血Th1和Treg細(xì)胞頻率高于對(duì)照組(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 兩組外周血Th1和Treg細(xì)胞頻率對(duì)比

2.3 兩組血清IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-18及TNF-α濃度對(duì)比觀察組血清IFN-γ、IL-10及IL-18濃度低于對(duì)照組(P<0.05)，IL-6及TNF-α高于對(duì)照組(P<0.05)，詳見(jiàn)表4。

表4 兩組血清IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-18及TNF-α濃度對(duì)比(pg/mL)

2.4 兩組NK細(xì)胞表面NKG2A的表達(dá)水平相比觀察組NK細(xì)胞表面NKG2A的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，詳見(jiàn)表5。

表5 兩組NK細(xì)胞表面NKG2A的表達(dá)水平相比

2.5 SIGIRR和各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性SIGIRR和TLR4的mRNA、Th1細(xì)胞頻率、Treg細(xì)胞頻率、IL-6、TNF-α、NK細(xì)胞表面NKG2A表達(dá)水平之間均為負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，和IFN-γ、IL-10、IL-18水平之間均為正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，詳見(jiàn)表6。

表6 SIGIRR和各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

HΒV感染屬于急性或者慢性肝病的一類常見(jiàn)原因，成人感染者中有5-10%能演變成CHΒ，若肝臟損傷未得到有效控制，會(huì)發(fā)展成危及生命安全的肝硬化、肝癌或者肝衰竭，導(dǎo)致患者死亡[5-6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，HΒV屬于一類非致細(xì)胞病變有關(guān)病毒，肝細(xì)胞感染該病毒并復(fù)制繁殖不會(huì)直接引起肝細(xì)胞損傷，但HΒV基因能整合至宿主肝細(xì)胞染色體內(nèi)，機(jī)體經(jīng)特異性體液與細(xì)胞反應(yīng)反應(yīng)以及非特異免疫反應(yīng)將HΒV清除，該過(guò)程能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)以及肝細(xì)胞受損。HΒV急性感染機(jī)體內(nèi)占據(jù)主導(dǎo)的為固有免疫以及適應(yīng)性免疫活化產(chǎn)生促炎微環(huán)境將病毒清除，但演變成慢性感染后，HΒV通過(guò)機(jī)體免疫負(fù)性調(diào)控機(jī)制例如Treg等以抑制病毒特異免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)針對(duì)病毒的免疫耐受[9-10]。慢性感染產(chǎn)生免疫微環(huán)境為CHΒ患者進(jìn)展成肝硬化甚至肝癌的主要因素[11]。因此，免疫反應(yīng)強(qiáng)弱以及免疫功能是否正常，和CHΒ患者的臨床轉(zhuǎn)歸存在緊密聯(lián)系，積極探討CHΒ有關(guān)免疫發(fā)病機(jī)制十分必要。

SIGIRR屬于近年來(lái)觀察到的TIR有關(guān)超家族成員，于機(jī)體內(nèi)較多組織以及器官中存在表達(dá)[12]。因結(jié)構(gòu)和其他的TIR有關(guān)超家族成員不同，SIGIRR特殊性于炎癥和免疫反應(yīng)內(nèi)起到負(fù)性調(diào)控作用，保持TIR超家族介導(dǎo)的下游信號(hào)通路平衡[13-14]。SIGI于各類炎癥免疫細(xì)胞內(nèi)表達(dá)廣泛，炎癥狀態(tài)下，該類指標(biāo)的水平往往降低[15-16]。相關(guān)研究顯示[17-18]，SIGIRR能對(duì)Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞以及TLRs信號(hào)通路產(chǎn)生影響，進(jìn)而起到免疫抑制效果，這些細(xì)胞或者信號(hào)通路于CHΒ中呈現(xiàn)功能紊亂狀態(tài)。據(jù)此我們推測(cè)具備負(fù)性調(diào)控功能的SIGIRR有可能參加CHΒ免疫學(xué)機(jī)理。本文研究顯示：觀察組PΒMC中SIGIRR mRNA表達(dá)、SIGIRR+細(xì)胞頻率及CD3+SIGIRR+T淋巴細(xì)胞比率均低于對(duì)照組(P<0.05)，這和有關(guān)研究中的結(jié)果一致。觀察組TLR4的mRNA、外周血Th1及Treg細(xì)胞頻率、血清IL-6及TNF-α和NK細(xì)胞表面NKG2A的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，血清IFN-γ、IL-10及IL-18濃度均低于對(duì)照組(P<0.05)。SIGIRR和TLR4的mRNA、Th1細(xì)胞頻率、Treg細(xì)胞頻率、IL-6、TNF-α、NK細(xì)胞表面NKG2A表達(dá)水平之間為負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，和IFN-γ、IL-10、IL-18水平之間為正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。上述結(jié)果顯示CHΒ患者的SIGIRR表達(dá)處在異常狀態(tài)，能直接影響到機(jī)體的免疫功能。推測(cè)作用機(jī)制是SIGIRR表達(dá)下降，會(huì)負(fù)反饋性導(dǎo)致TLR4活化，促進(jìn)NK細(xì)胞表面NKG2A和IL-6及TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平升高，導(dǎo)致IFN-γ、IL-10及IL-18等抗炎細(xì)胞因子下降，最終引發(fā)免疫抑制。

綜上所述，CHΒ患者SIGIRR表達(dá)水平異常，且和免疫功能紊亂有關(guān)。CHΒ患者的SIGIRR低表達(dá)能直接或者間接活化TLR4，上調(diào)NK細(xì)胞表面NKG2A和IL-6及TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)，下調(diào)IFN-γ、IL-10及IL-18等細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。但本文依舊有不足的地方，如納入的樣本數(shù)不多，樣本來(lái)源較為單一，且有關(guān)SIGIRR在不同進(jìn)展階段CHΒ患者中的作用和臨床意義還需日后繼續(xù)分析。