上皮性卵巢癌組織中CircITGB6、CircPBX3 的表達(dá)變化及意義

張艷，韓建秋，田靜，王露，邢雅玲，趙明飛，郝麗慧

1 天津泰達(dá)醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300000；2 天津市第一中心醫(yī)院婦產(chǎn)科；3 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科

卵巢癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤。2020 年全球卵巢癌發(fā)病數(shù)達(dá)31.4 萬(wàn)例，死亡達(dá)20.7 萬(wàn)例［1］。卵巢癌中以上皮性卵巢癌（EOC）最為常見(jiàn)，占所有病理類(lèi)型的90%。目前EOC 的治療以手術(shù)聯(lián)合化療為主，但臨床仍會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)與進(jìn)展［2-3］。環(huán)狀RNA（Circ）是具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型非編碼RNA 分子，具有保守性、高穩(wěn)定性、組織特異性等特點(diǎn)，廣泛參與宮頸癌、卵巢癌等婦科惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是理想的腫瘤標(biāo)志物［4-5］。CircITGB6 又稱(chēng)為hsa_circ_0056856，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)功能的新的環(huán)狀RNA 分子，在銀屑病［6］、非小細(xì)胞肺癌［7］等疾病中異常表達(dá)上調(diào)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。CircPBX3 又稱(chēng)為hsa_circ_0004804，近年來(lái)有學(xué)者在卵巢癌耐藥腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CircPBX3 表達(dá)上調(diào)，是潛在的卵巢癌預(yù)后相關(guān)腫瘤標(biāo)志物［8］。為此，我們檢測(cè)了EOC患者癌及癌旁正常組織中CircITGB6、CircPBX3 表達(dá)，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019 年2 月—2020 年2 月天津泰達(dá)醫(yī)院診治的80 例EOC 患者為研究對(duì)象（EOC組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均接受卵巢癌根治術(shù)，經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷為EOC；②首次診治，術(shù)前無(wú)放化療及免疫治療史；③臨床病歷資料完整；④患者及家屬能配合完成各項(xiàng)檢查，均已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠哺乳期女性；②合并其他惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、感染性疾病或自身免疫性疾病?；颊吣挲g28～79（62.47 ± 6.17）歲；病理類(lèi)型：漿液型50 例，非漿液型30 例；腫瘤最大徑：＞5 cm 者49 例，≤5 cm 者31 例；腫瘤FIGO 分期：Ⅰ、Ⅱ期44 例，Ⅲ期36 例；腫瘤分化程度：高中分化45 例，低分化35 例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36 例。所有EOC 患者出院后開(kāi)始進(jìn)行隨訪(fǎng)，電話(huà)或門(mén)診方式進(jìn)行，第1 年每3 個(gè)月1 次，第2～3 年每6 個(gè)月隨訪(fǎng)1次，連續(xù)隨訪(fǎng)3年。隨訪(fǎng)內(nèi)容為患者生存情況及生存時(shí)間。隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2023 年3 月1 日。隨訪(fǎng)終點(diǎn)為EOC患者發(fā)生死亡或隨訪(fǎng)時(shí)間結(jié)束。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（倫理編號(hào)：2023-0215）。

1.2 EOC 癌和癌旁正常組織中CircITGB6、CircPBX3檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)癌和癌旁正常組織（距離癌組織≥3 cm）中CircITGB6、CircPBX3表達(dá)。將組織于研缽中液氮研磨后，加入TRIzol 提取組織總RNA。紫外分光光度計(jì)（Narodrop2000，賽默飛公司）測(cè)定RNA 濃度，A260/A280介于2.8～2.1。以總RNA 為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系包括模板RNA 1 μL，4×gDNA wiper Mix 4 μL，ddH2O 15 μL；反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冷卻。Prime-ScriptTMgDNA wiper Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（7900HT實(shí)時(shí)PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司）檢測(cè)CircITGB6、CircPBX3 的相對(duì)表達(dá)量。引物由深圳華大基因科技有限公司設(shè)計(jì)合成。CircITGB6 正向引物：5' -GGAGAGGATGGTCAGCCCTA-3'，反向引物：5'-AGACCTGGGGAAAGGAGAGG-3'；CircPBX3正向引物：5'-GCCCTGTTTGAACTTCCTGTTT-3'，正向引物：5'-TTGTGGGTCATTTTGGAGGCT-3'；GAPDH 正向引物：5'-GCCCTGTTTGAACTTCCTGTT- 3'，反向引物：5'-GGTGCCTTGTGTCAGGTCC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，變性退火延伸共35 個(gè)循環(huán)。總體系20 μL，包括SYBR Premix Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，cDNA 1 μL 和ddH2O 7 μL。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算CircITGB6、CircPBX3 的相對(duì)表達(dá)量。分別以癌組織CircITGB6、CircPBX3 相對(duì)表達(dá)量的平均值3.17、4.02 為界，將EOC 患者分為CircITGB6高表達(dá)（CircITGB6≥3.17，n=39）和低表達(dá)（CircITGB6＜3.17，n=41），CircPBX3 高表達(dá)（CircPBX3≥4.02，n=38）和低表達(dá)（CircPBX3＜4.02，n=42）。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)性分布時(shí)以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。CircITGB6 與CircPBX3 之間的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析（Log-Rank檢驗(yàn)）分析CircITGB6、CircPBX3 表達(dá)對(duì)EOC 患者生存預(yù)后的影響。Cox 回歸模型分析影響EOC 患者預(yù)后的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織中CircITGB6、CircPBX3 表達(dá)比較 EOC 癌組織中CircITGB6、CircPBX3 相對(duì)表達(dá)量分別為3.17 ± 0.57、4.02 ± 0.62，癌旁正常組織中分別為1.06 ± 0.24、1.23 ± 0.32，EOC 癌組織中CircITGB6、CircPBX3相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織（t分別為30.515、35.766，P均＜0.05）。

2.2 EOC 癌組織中CircITGB6 與CircPBX3 表達(dá)相關(guān)性 EOC 癌組織中CircITGB6 與CircPBX3 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.685，P＜0.05）。

2.3 不同臨床病理特征EOC 患者癌組織中CircITGB6、CircPBX3 表達(dá)比較 腫瘤FIGO 分期Ⅲ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移EOC 癌組織中CircITGB6、CircPBX3相對(duì)表達(dá)量高于FIGO 分期Ⅰ、Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 癌組織CircITGB6、CircPBX3 表達(dá)與EOC 患者生存預(yù)后的關(guān)系 80例EOC患者隨訪(fǎng)期間，死亡27例，無(wú)失訪(fǎng)，3 年總體生存率為66.25%（53/80）。CircITGB6 高表達(dá)和低表達(dá)者3 年累積生存率分別為51.28%（20/39）、80.49%（33/41），CircITGB6 高表達(dá)者3 年累積生存率低于CircITGB6 低表達(dá)者（χ2=8.179，P＜0.05）。CircPBX3 高表達(dá)和低表達(dá)者3 年累積生存率分別為55.26%（21/38）、76.19%（32/42），CircPBX3 高表達(dá)者3 年累積生存率低于CircPBX3低表達(dá)者（χ2=5.763，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.5 影響EOC 患者預(yù)后的因素 單因素及多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CircITGB6 高表達(dá)、CircPBX3 高表達(dá)是影響EOC 患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

表2 單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果

表3 多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果

3 討論

卵巢癌是我國(guó)女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年全國(guó)新發(fā)病例達(dá)5.28 萬(wàn)例，死亡約2.5 萬(wàn)例［9］。EOC 是最常見(jiàn)的卵巢癌類(lèi)型，具有起病隱匿、惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)［10］。糖類(lèi)抗原125、癌胚抗原等是EOC 診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)的常用腫瘤標(biāo)志物，但二者均非EOC 特異性標(biāo)志物，在月經(jīng)期、子宮內(nèi)膜異位癥時(shí)也可升高，造成假陽(yáng)性結(jié)果［11］。

環(huán)狀RNA 是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯及蛋白質(zhì)結(jié)合等多種生物學(xué)功能［12］。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織或血清中環(huán)狀RNA 如hsa_circ_0003972、hsa_corc_0007288 等異常表達(dá)，有助于卵巢癌早期診斷及預(yù)后評(píng)估［13］。本研究中，EOC 癌組織中CircITGB6 表達(dá)上調(diào)，與不良臨床病理特征有關(guān)，提示CircITGB6參與EOC 的發(fā)生發(fā)展。EOC 中CircITGB6 表達(dá)升高與套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化機(jī)制異常有關(guān)。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 能誘導(dǎo)腫瘤中ITGB6 基因外顯子mRNA前體轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的部分重疊，上游內(nèi)含子和下游內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)反向剪切形成CircITGB6，導(dǎo)致CircITGB6 水平升高［12，14］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中CircITGB6 能與胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白2（IGF2BP2）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9 mRNA 相互作用，形成RNA 蛋白三聚體復(fù)合物，促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型極化，抑制腫瘤殺傷性CD8+T淋巴細(xì)胞的腫瘤殺傷效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，而應(yīng)用CircITGB6 反義寡核苷酸治療后，能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存率［15］。本研究中，CircITGB6 高表達(dá)是影響EOC 患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。分析其原因，一方面是CircITGB6 高表達(dá)的EOC 腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，手術(shù)難以達(dá)到最大限度減輕腫瘤負(fù)擔(dān)的治療效果，術(shù)后EOC 易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者不良預(yù)后。另一方面，CircITGB6 高表達(dá)的EOC 腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑化療治療的敏感性較差，化療后殘留腫瘤細(xì)胞也會(huì)導(dǎo)致EOC 患者的不良預(yù)后［15］。

CircPBX3 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)新的環(huán)狀RNA 分子。本研究中，EOC 癌組織中CircPBX3 表達(dá)升高，與腫瘤FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明CircPBX3 參與EOC 的發(fā)生發(fā)展。EOC 中CircPBX3 表達(dá)升高的機(jī)制可能與RNA 結(jié)合蛋白驅(qū)動(dòng)的環(huán)化機(jī)制異常有關(guān)。研究表明，RNA 結(jié)合蛋白能結(jié)合內(nèi)含子，拉近內(nèi)含子上游5'剪切位點(diǎn)和下游3'剪切位點(diǎn)之間的距離，促進(jìn)外顯子環(huán)化，促進(jìn)CircPBX3 等環(huán)狀RNA 的形成［16］。此外，卵巢癌腫瘤細(xì)胞中CircPBX3 表達(dá)升高能與IGF2BP2 相互作用，增加P 型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶mRNA 的穩(wěn)定性，抑制自噬介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 的降解，促進(jìn)腫瘤血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生［8，17］。本研究中，CircPBX3 高表達(dá)的EOC 患者生存預(yù)后較差，提示CircPBX3是新的EOC預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物。分析其原因，CircPBX3 高表達(dá)的卵巢癌腫瘤細(xì)胞銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白（ATP7A）表達(dá)上調(diào)，ATP7A 由高爾基體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，能外排銅離子的同時(shí)，還能將鉑類(lèi)化療藥物排出細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤對(duì)鉑類(lèi)化療藥物耐藥性形成［8］。研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)ATP7A 的人卵巢癌細(xì)胞系OV-90、SK-OV-3 對(duì)順鉑、卡鉑及奧沙利鉑耐藥性較強(qiáng)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，EOC中CircITGB6 與CircPBX3 的表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者在EOC 中可能共同促進(jìn)EOC 的進(jìn)展。原因可能是CircITGB6 與CircPBX3 均能結(jié)合IGF2BP2，激活下游絲裂原活化蛋白激酶及磷脂酰肌醇3 激酶/Akt通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移［19-20］。因此，CircITGB6 與CircPBX3 可能在EOC 中發(fā)揮協(xié)同作用，但二者的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，EOC 中CircITGB6、CircPBX3 表達(dá)升高，與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，共同促進(jìn)EOC的惡性進(jìn)展。EOC 癌組織中CircITGB6、CircPBX3高表達(dá)EOC 患者生存預(yù)后較差，二者可能成為新的EOC患者預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物。