不同葉片病害癥狀桃Lhcb基因的克隆與表達(dá)分析

張子萌 楊麗娟 盧美光 李世訪

摘要：以我國(guó)健康山毛桃和不同癥狀的油桃葉片為試驗(yàn)材料，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)基因克隆獲得編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的Lhcb基因全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期揭示不同桃品種Lhcb基因序列差異及其表達(dá)與功能，豐富Lhcb基因的序列信息，探究Lhcb基因表達(dá)與不同葉片病害癥狀間的關(guān)系?？寺～@得山毛桃、無(wú)癥狀及花葉癥狀油桃的Lhcb基因全長(zhǎng)序列，分別命名為L(zhǎng)hcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3，全長(zhǎng)均為1 925 bp，與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上登錄的桃Lhcb-Pp1基因（1 912 bp）相比，在1 593 nt處多出10個(gè)堿基。全長(zhǎng)包括1個(gè)804 bp（編碼267個(gè)氨基酸）的開(kāi)放閱讀框、CAAT-signal和TATA box等作用元件。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，獲得的3個(gè)目的基因序列與李屬植物的基因序列聚為1組。蛋白質(zhì)分析結(jié)果表明，桃Lhcb蛋白的相對(duì)分子量為 28 332.17 u，理論等電點(diǎn)為5.30，是親水性蛋白；其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由53% α-螺旋、33%無(wú)規(guī)卷曲和24%跨膜螺旋組成，無(wú)β-折疊結(jié)構(gòu)。對(duì)無(wú)癥狀及花葉癥狀油桃樣品中Lhcb基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，通過(guò)半定量RT-PCR和RT-qPCR，結(jié)果表明，與無(wú)癥狀樣品相比，花葉油桃中Lhcb轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平較低，Lhcb基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)。

關(guān)鍵詞：桃；Lhcb基因；基因克?。换虮磉_(dá)；蛋白分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.621.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-S662.11302（2023）11-0035-08

收稿日期：2022-11-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：CARS-30-3-01）。

作者簡(jiǎn)介：張子萌（1998—），女，河北保定人，碩士研究生，主要從事果樹(shù)病毒學(xué)研究。E-mail：zimeng980809@163.com。

通信作者：盧美光，博士，研究員，主要從事果樹(shù)病毒學(xué)研究。E-mail：mglu@ippcaas.cn。

桃樹(shù)是我國(guó)非常重要的落葉核果類(lèi)果樹(shù)，屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus），在世界范圍內(nèi)被普遍引種、栽培。山毛桃（Prunus davidiana Franch）耐寒、耐旱且具有發(fā)達(dá)的根系，是黃土丘陵和北方實(shí)質(zhì)山區(qū)自然分布的樹(shù)種。油桃（Prunus persica cv. nectarina）是桃的變種，由于其采摘食用便利，商品性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益高^［1］，故其在桃產(chǎn)業(yè)中所占比重逐年增大。與薔薇科其余木本植物（如李、櫻桃）相比，桃的基因組較小（230 Mbp），且童期僅為2～3年，因此桃可作為薔薇科植物研究中的模式基因組物種^［2］。

捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白在高等植物的光合作用中發(fā)揮著重要功能，其與光合反應(yīng)體系中的有機(jī)色素分子連接形成復(fù)合體，將光能信號(hào)迅速傳遞到光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）、光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）的反應(yīng)中心，推動(dòng)光合反應(yīng)的進(jìn)行^［3］。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白復(fù)合體在PSⅠ和PSⅡ中均存在，PS Ⅱ-LHCⅡ［the light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins （LHC Ⅱ） associated with photosystem Ⅱ （PS Ⅱ）］主要包括1個(gè)三聚體和3個(gè)單體蛋白，三聚體分別由Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3基因編碼，3個(gè)單體蛋白則分別由 Lhcb4（CP29）、Lhcb5（CP24）和Lhcb6（CP26）基因編碼^［4］。目前，已有許多植物的Lhcb基因被克隆，如豌豆^［5］、矮牽牛^［6］、擬南芥^［7］、番茄^［8］、小麥^［9］、花椰菜^［10］、毛竹^［11］、長(zhǎng)白松^［12］等。據(jù)報(bào)道，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白也參與了植物抗逆、環(huán)境適應(yīng)性等方面的調(diào)節(jié)。例如，Zhang等在研究2種生態(tài)型東南景天Lhcb2基因在鎘、鋅脅迫下的表達(dá)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，鎘、鋅脅迫處理能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草中該基因的表達(dá)量^［13］。Petit等對(duì)殺菌劑脅迫后葡萄光合作用相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)光合作用的降低伴隨著PS Ⅱ的psbP1（PsbP subunit of photosystem Ⅱ）基因、PSⅠ的cab基因［chlorophyll a/b-binding （Cab） proteins］的抑制表達(dá)，使得光合作用受到影響，但沒(méi)有觸發(fā)任何植物防御反應(yīng)^［14］。

本研究基于大田溫室中具有不同病害癥狀的油桃葉片（無(wú)癥狀和花葉）樣品的sRNA和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選獲得桃中與光合作用密切相關(guān)的Lhcb基因。雖然目前在NCBI中已登錄1條桃（Prunus persica cv. Stark Earlilo）Lhcb基因（Lhcb-Pp1）全序列，但是未見(jiàn)對(duì)其相關(guān)序列和功能研究的報(bào)道。因此，本研究以Lhcb-Pp1基因?yàn)槟０?，分別設(shè)計(jì)5′、3′端和特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增我國(guó)山毛桃與油桃中不同表型葉片的Lhcb基因序列；利用BioEdit、MEGA 7.0、Phyre2、SWISS MODEL及ExPASy-ProtParam等軟件/在線工具對(duì)獲得的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用半定量RT-PCR、RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)具有不同病害癥狀的油桃樣品中Lhcb基因的表達(dá)量差異。研究結(jié)果能解析不同桃品種相關(guān)Lhcb基因的序列差異及油桃Lhcb基因與花葉癥狀的相關(guān)性，從而為植物病害防治研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山毛桃種子于2021年3月份購(gòu)自浙江杭州，于4 ℃黑暗冷藏至少2個(gè)月后進(jìn)行消毒、去殼、播種得到實(shí)生苗；油桃葉片樣品（S01、S03）品種來(lái)源為中油4號(hào)，于2017年5月采自管理與栽培條件一致的遼寧省大連市大田溫室，其中S01為無(wú)癥狀，S03為花葉。采集的新鮮葉片經(jīng)液氮處理后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?，后續(xù)試驗(yàn)于2021年12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白Lhcb基因的克隆與測(cè)序 植物總RNA的提取和引物設(shè)計(jì)：使用多糖、多酚植物總RNA提取試劑盒提取植物總RNA，并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中已登錄的桃Lhcb-Pp1基因序列（登錄號(hào)L36064.1）設(shè)計(jì)引物（表1），對(duì)Lhcb基因進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增。5′、3′端全長(zhǎng)擴(kuò)增引物（Full-F/R）預(yù)期擴(kuò)增出大小為 1 912 nt 左右的目的基因全序列及5′或3′端部分片段。另設(shè)計(jì)3′端序列擴(kuò)增引物（5′-991F），預(yù)期目的片段擴(kuò)增大小為900 nt左右。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，詳見(jiàn)表1。

RT-PCR擴(kuò)增：以植物總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；用Q5 High-Fidelity 2X Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

目的基因片段的克隆和測(cè)序：PCR目的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化。將純化產(chǎn)物連接至pTOPO-Blunt克隆載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)鑒定后，挑選陽(yáng)性克隆送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。用BioEdit^［15］軟件對(duì)克隆測(cè)序得到的序列進(jìn)行拼接，獲得Lhcb基因全長(zhǎng)序列。

1.2.2 序列分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已登錄的桃Lhcb-Pp1基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列（登錄號(hào)：AAA50310.1），用BioEdit軟件對(duì)“1.2.1”節(jié)擴(kuò)增到的基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析其序列的差異。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 為了確定所得Lhcb基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系，除供試樣品Lhcb基因外，從NCBI上下載桃、杏、梅、甜櫻桃、月季、白梨、蘋(píng)果、野草莓、蓖麻、大麻、大豆、野大豆、美花煙草、擬南芥、雷公藤、胡楊、茶、油茶、銀白楊、蓮、向日葵、核桃、山核桃、木薯、橄欖、葡萄的Lhcb基因及其編碼的蛋白序列，在BioEdit中進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA 7.0^［16］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建選擇General Time Reversible model和Gamma Distributed（G）模式運(yùn)行程序，采用最大似然法（maximum likelihood，ML），Bootstrap值設(shè)為1 000次。

1.2.4 Lhcb蛋白的理化性質(zhì)分析 為了明確不同植物L(fēng)hcb蛋白之間的親緣關(guān)系是否和其理化性質(zhì)相關(guān)，用ExPASy-ProtParam^［17］（https：//www.expasy.org/resources/protparam）對(duì)桃和其他物種的Lhcb蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.2.5 Lhcb蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 利用Phyre2在線工具^［18］（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對(duì)桃中的Lhcb蛋白進(jìn)行分析。先輸入蛋白序列，再預(yù)測(cè)Lhcb蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并以Pea Light-Harvesting Complex（PDB ID：2bhw）為模型，用Swiss Model在線工具（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，用Swiss-PDB Viewer軟件查閱其三維結(jié)構(gòu)^［19］。

1.2.6 半定量RT-PCR及RT-qPCR技術(shù) 將油桃樣品的RNA定量2 μg后再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋20倍后可用作模板。以TEF2（translation enlongation factor 2，翻譯延伸因子2）^［20］為內(nèi)參基因，以桃轉(zhuǎn)錄本PRUPE_ppa0100 15 mg基因序列設(shè)計(jì)特異引物。半定量RT-PCR：將得到的cDNA分別按1 ∶2、1 ∶20、1 ∶200的比例稀釋?zhuān)琍CR反應(yīng)使用2×Taq PCR MasterMix試劑盒進(jìn)行。引物 Lhcb-F：5′-AACCGCATCCAAGTCCA-3′，Lhcb-R：5′-CTCAAGTTCTCAGGCTCAC-3′。RT-qPCR：用含有 SYBR GreenⅠ的 TransStart Green qPCR SuperMix試劑盒配制反應(yīng)體系，在MyGo Pro Real-Time PCR System （IT-IS Life Science Ltd.，UK）上進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。引物qLhcb-F：5′-CTCTTACCTCACTGGAGAATT-3′，qLhcb-R：5′-ATACAGCCTCACCGAACT-3′，每個(gè)qPCR反應(yīng)設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白Lhcb基因的克隆與序列分析

利用5′、3′端全長(zhǎng)擴(kuò)增引物Full-F/R，通過(guò) RT-PCR 擴(kuò)增、克隆測(cè)序得到山毛桃全序列與油桃S01 5′端1 047 bp、3′端1 400 bp的片段及S03 5′端1 047 bp的部分序列。通過(guò)3′端擴(kuò)增引物5′-991F、3′-Full-R擴(kuò)增，獲得S03 3′端889 bp的片段。最終通過(guò)克隆、序列拼接與測(cè)序，獲得S01、S03的完整序列。山毛桃、油桃S01、S03的Lhcb基因分別命名為L(zhǎng)hcb-Pd1、Lhcb-Ppn1、Lhcb-Ppn3（圖1）。

序列分析結(jié)果表明，Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3基因全長(zhǎng)1 925 bp，包括1個(gè)804 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），可編碼267個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼PSⅡ-LHC Ⅱ，Type1，非編碼區(qū)中包含 CAAT-signal、TATA box等作用元件。與 Lhcb-Pp1序列（基因全長(zhǎng)1 912 bp）相比，明顯的差異是克隆的3個(gè)目的基因序列在1 593 nt處均有10 bp堿基（CAGTCTGCAG）的插入（圖2），在266 nt處有G插入，在1 278、1 303 nt處有A插入（圖2）。但是與Lhcb-Pp1基因編碼區(qū)（位置：337～1 140 nt）的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其編碼的氨基酸高度保守，相似性為100%。此外，將得到的目的基因在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)100余種植物的Lhcb基因中，只在杏（登錄號(hào)：AP019299.1）中發(fā)現(xiàn)相同的10 bp堿基插入（圖中未顯示），其他物種并未發(fā)現(xiàn)相同堿基插入。

2.2 Lhcb基因及其編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

將Lhcb-Pd1、Lhcb-Ppn1和Lhcb-Ppn3全長(zhǎng)基因與模式植物擬南芥的Lhcb1全長(zhǎng)基因進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，3條目的基因核苷酸全序列與擬南芥Lhcb1的5條基因序列的一致性都較低，為34.6%～39.8%，但其編碼區(qū)的蛋白編碼核苷酸序列的一致性較高，為67.4%～67.9%，氨基酸序列一致性為87.8%～88.1%；李屬代表植物如甜櫻桃、梅、杏等與桃目的基因編碼蛋白編碼氨基酸序列的一致性為96.3%～98.6%，不同桃品種之間的Lhcb基因同源性較高，其所編碼的蛋白編碼氨基酸序列一致性可達(dá)100%。上述結(jié)果表明，雖然不同物種相應(yīng)的Lhcb基因親緣關(guān)系不同，但是其編碼的蛋白質(zhì)在進(jìn)化上還是相對(duì)保守的。

對(duì)不同物種Lhcb基因編碼核苷酸序列和編碼蛋白的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，從桃中克隆到的3條基因與大多數(shù)李屬植物的基因聚在一起，親緣關(guān)系最近；與擬南芥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與序列比對(duì)結(jié)果一致；對(duì)不同桃品種而言，山毛桃、桃和油桃單獨(dú)聚在李屬植物遺傳組的1個(gè)亞組上（圖3）。

2.3 不同物種Lhcb蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

不同物種Lhcb蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，毛桃與油桃Lhcb蛋白的理化性質(zhì)一致。由表2可知，除月季、向日葵外，其余物種Lhcb蛋白的氨基酸殘基數(shù)為261～269個(gè)，相對(duì)分子量為27 700.74～28 633.67 u，理論等電點(diǎn)為5.10～6.33，大多數(shù)為親水性蛋白；不同植物的Lhcb蛋白理化性質(zhì)較一致，但也有差異，如擬南芥Lhcb1中的5個(gè)蛋白大都為疏水蛋白，可能是由氨基酸非保守域序列的差別造成的。

2.4 桃Lhcb蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)分析

用Phyre2對(duì)桃Lhcb蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Lhcb主要由53% α-螺旋、33%無(wú)規(guī)卷曲和24%跨膜螺旋組成，無(wú)β-折疊結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度為100%。以Pea Light-Harvesting Complex（LHC；PDB ID：2bhw）為模型，用Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的同源建模，結(jié)果表明，桃Lhcb與Pea LHC的氨基酸序列相似性為94%，二者具有相似的三維結(jié)構(gòu)。桃Lhcb蛋白的空間結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，其主要由3條鏈組成，包括α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（圖4）。與模式植物擬南芥相比，桃Lhcb蛋白的整體三維結(jié)構(gòu)與擬南芥S-LHCⅡ、M-LHCⅡ的三維結(jié)構(gòu)均相似，這些結(jié)構(gòu)也是捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的典型空間結(jié)構(gòu)，是其行使生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，也表明LHCⅡ蛋白在進(jìn)化上相當(dāng)保守。

2.5 半定量RT-PCR、RT-qPCR對(duì)油桃中Lhcb基因表達(dá)量的分析

圖5-A的半定量RT-PCR結(jié)果表明，隨著模板量的逐漸減少，S01、S03中內(nèi)參基因的量均無(wú)顯著差異，但S03中Lhcb基因的量表現(xiàn)為降低趨勢(shì)，當(dāng)cDNA含量稀釋200倍時(shí)，S01樣品中仍能見(jiàn)較亮的Lhcb擴(kuò)增條帶，而S03樣品中已基本看不見(jiàn)擴(kuò)增條帶。圖5-B的RT-qPCR結(jié)果也表明，S03花葉樣品中的Lhcb基因表達(dá)量明顯下調(diào)，S01樣品中的Lhcb基因表達(dá)量是S03的40倍左右（圖5-B）。以TEF2為內(nèi)參基因，通過(guò)半定量RT-PCR、RT-qPCR檢測(cè)油桃無(wú)癥狀（圖5-C）和花葉葉片（圖5-D的Lhcb基因表達(dá)量差異，獲得一致結(jié)果。由試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，S03樣品中花葉癥狀的出現(xiàn)與Lhcb基因表達(dá)量的下調(diào)密切相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

在光合作用和植物抗逆的過(guò)程中，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白都發(fā)揮著重要作用。本研究以我國(guó)山毛桃、油桃為供試樣品進(jìn)行Lhcb的全基因克隆，獲得了不同桃品種和不同癥狀樣品的Lhcb全基因序列，預(yù)測(cè)其編碼PS Ⅱ-LHCⅡ，Type1。序列分析結(jié)果表明，與NCBI中提交的桃品種Stark Earlilo的Lhcb基因相比，獲得的3條Lhcb全基因的序列均在1 593 nt非編碼區(qū)多出了10 bp堿基的插入，說(shuō)明我國(guó)不同桃品種的Lhcb基因序列與NCBI中提交的桃品種存在差異，但獲得的目的基因編碼的Lhcb蛋白是高度保守的。經(jīng)過(guò)對(duì)NCBI中不同物種的Lhcb基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)只在杏中可以比對(duì)到插入的這10個(gè)堿基，而有研究發(fā)現(xiàn)，早在1992年，馬鋒旺等就已進(jìn)行桃與杏的雜交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)雜交組合有一定的親和性^［21］。在我國(guó)目前的果園中，果樹(shù)混種的現(xiàn)象十分普遍，難以避免桃杏之間的雜交，筆者推測(cè)，本研究中目的基因組DNA多出10個(gè)堿基可能與品種起源有關(guān)。

在模式植物擬南芥中，Lhcb1基因編碼PSⅡ-LHC Ⅱ（Type1蛋白），包含5條Lhcb1亞型基因（lhcb1.1、lhcb1.2、lhcb1.3、lhcb1.4、lhcb1.5）^［4］。對(duì)本研究獲得的目的基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，李屬植物的Lhcb蛋白大多為親水蛋白，而擬南芥Lhcb1中的5個(gè)蛋白大多為疏水蛋白。由于擬南芥Lhcb1基因編碼的蛋白質(zhì)中含有1段高度疏水序列即“通用LHC基序”（ELINGRLAMLGFLGFLVPELIT），而此序列并未在李屬植物中比對(duì)到，因此推測(cè)李屬植物和擬南芥Lhcb1蛋白的疏水性可能由氨基酸非保守域序列的差別造成^［22］。在擬南芥中，LHCⅡ蛋白中的幾個(gè)三聚體組件可以在特定位置同時(shí)與PSⅡ核心復(fù)合體結(jié)合，根據(jù)它們與PSⅡ二聚體核心（C2）的相對(duì)位置及與PSⅡ-LHCⅡ相互作用的強(qiáng)度，創(chuàng)造了4個(gè)不同的LHCⅡ類(lèi)別：強(qiáng)（S）、中（M）、松散（L）和裸露（N），其中較為常見(jiàn)的是S-LHCⅡ、M-LHCⅡ，S-LHCⅡ是lhcb1.3的產(chǎn)物，M-LHCⅡ?yàn)閘hcb1.4的產(chǎn)物^［22-23］，而桃Lhcb蛋白整體的三維結(jié)構(gòu)與S-LHCⅡ、M-LHCⅡ的三維結(jié)構(gòu)相似，這是捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的典型空間結(jié)構(gòu)，表明LHCⅡ蛋白在進(jìn)化上比較保守。

在田間條件下，桃花葉癥狀普遍發(fā)生，通常由缺素或病毒侵染引發(fā)。有研究表明，Lhcb基因普遍參與光能的捕獲與傳遞、葉片發(fā)育及各種脅迫應(yīng)答，如干旱脅迫、鹽脅迫、激素信號(hào)及病原脅迫^［24-25］。筆者用半定量RT-PCR、RT-qPCR技術(shù)對(duì)不同表型油桃樣品進(jìn)行Lhcb基因表達(dá)的差異分析，結(jié)果表明，花葉癥狀的油桃樣品PSⅡ-LHCⅡ，1型Lhcb基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。筆者通過(guò)對(duì)無(wú)癥狀及花葉油桃樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，均檢測(cè)到桃潛隱花葉類(lèi)病毒（PLMVd）^［26］，這是一種由335～351 nt 組成的環(huán)狀RNA分子^［27］，用不同的PLMVd序列分離物侵染桃樹(shù)后會(huì)有不同表型，被侵染的植株一般表現(xiàn)為不同癥狀的花葉、白化、延遲發(fā)芽等，有些表現(xiàn)為無(wú)癥狀的潛隱性侵染^［28］。筆者也發(fā)現(xiàn)了由PLMVd侵染引發(fā)的花葉癥狀的報(bào)道^［29］，與本研究樣品的花葉表型一致。此外，在本研究中，油桃無(wú)癥狀及花葉葉片樣品采集于相同管理?xiàng)l件和栽培環(huán)境的田間溫室，由此可以初步推測(cè)，花葉癥狀的產(chǎn)生可能與PLMVd侵染導(dǎo)致PSⅡ-LHCⅡ 1型Lhcb基因表達(dá)量下調(diào)有關(guān)，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。Lhcb蛋白為光合作用中的重要功能蛋白，其生理功能復(fù)雜，占光合膜中近50%的色素和約1/3的蛋白質(zhì)。Lhcb在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，因此對(duì)其研究也逐漸增多^［30］。LHC蛋白作為自然界最豐富的膜蛋白之一，目前關(guān)于Lhc基因的測(cè)序分析在一些模式植物中已較完善，在毛竹、金銀花、橡膠樹(shù)、景天、李屬植物等物種中，有少數(shù)LHC蛋白相關(guān)的基因被克隆測(cè)序，但對(duì)桃Lhcb基因的研究未見(jiàn)報(bào)道。此外，已有報(bào)道顯示，植物L(fēng)hcb基因的表達(dá)與非生物協(xié)迫有關(guān)，但對(duì)其與植物病原侵染的關(guān)系研究較少。因此，本研究對(duì)桃不同品種和不同病害癥狀的Lhcb基因的克隆與表達(dá)分析不僅有助于豐富Lhcb基因的序列信息，而且可為木本李屬植物栽培及病害防治等提供重要的參考依據(jù)。

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