高產(chǎn)磷脂酶D 的蠟樣芽孢桿菌誘變篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

王天一 劉 歡 王 芳 鄧 利

(北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029)

引 言

磷脂酶D(phospholipase D,PLD,EC 3.1.4.4.)屬于磷酸二酯酶超家族成員,可作用于甘油磷脂類物質(zhì)中的磷酰氧鍵(P—O)。 PLD 具有水解活性和轉(zhuǎn)酯?；钚?前者可以催化甘油磷脂類物質(zhì)生成磷脂酸和羥基化合物,后者可以催化磷脂酰膽堿(PC)與各類羥基化合物反應(yīng),產(chǎn)生稀有磷脂(如磷脂酰絲氨酸)[1]。 因此,PLD 在食品保健品[2-3]、醫(yī)藥[4]等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

PLD 廣泛存在于動(dòng)物[5]、植物[6]及微生物[7]中,其主要生理功能是參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞膜生成[8]。 微生物來源的PLD 具有較好的轉(zhuǎn)酯?；芰洼^廣泛的底物專一性[9],目前已經(jīng)有多種產(chǎn)PLD 的微生物被分離出來,如鏈霉菌[10]、棒狀桿菌[11]、沙門氏菌[12]、假單胞菌[13]和蠟樣芽孢桿菌[14]等。 其中,鏈霉菌屬PLD 的轉(zhuǎn)酯活性尤為突出[15],但其生長緩慢,生產(chǎn)周期較長(約為3 ～7 d)。而蠟樣芽孢桿菌的產(chǎn)酶速度快,抗逆性強(qiáng),可利用多種底物,是一種新型的PLD 生產(chǎn)菌株,并且其生長速度快,生產(chǎn)周期短(約48 h),具有較大的生產(chǎn)潛力。 代書玲等[16]首次從香油作坊的土壤中篩選出一株產(chǎn)PLD 的蠟樣芽孢桿菌,經(jīng)條件優(yōu)化,培養(yǎng)8 h后該菌株的產(chǎn)酶量達(dá)到4.21 U/mL。 徐銀鳳[17]從土壤中篩選出一株以蛋黃為唯一碳源的蠟樣芽孢桿菌(Bacillussp.P1),培養(yǎng)3 d 后PLD 的酶活性達(dá)到0.43 U/mL。 Zhao 等[14]研究了蠟樣芽孢桿菌ZY12的產(chǎn)酶性質(zhì),發(fā)現(xiàn)只有在特定物質(zhì)誘導(dǎo)且無單糖存在的情況下,該菌株才能產(chǎn)生PLD。

目前,蠟樣芽孢桿菌的PLD 產(chǎn)量與鏈霉菌還有一定差距,產(chǎn)酶條件尚有待進(jìn)一步優(yōu)化。 本研究以野生蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereusCICC 20551)為出發(fā)菌株,采用紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法對(duì)其進(jìn)行誘變,篩選出一株高產(chǎn)PLD 的蠟樣芽孢桿菌,并對(duì)其誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

蠟樣芽胞桿菌(B.cereusCICC 20551),購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,生物危害程度為四類,屬于通常情況下不會(huì)引起人類或動(dòng)物疾病的微生物。

1.1.2 試劑

膽堿氧化酶(12 U/mg)、過氧化物酶(250 U/mg),美國Sigma 公司;卵磷脂(PC 含量＞60%),上海生工生物工程股份有限公司;卵磷脂(PC 含量＞10%)、卵磷脂(PC 含量＞90%),上海源葉生物科技有限公司;甘油磷酰膽堿(GPC)(純度98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蛋黃卵磷脂(PC含量＞98%)、卵磷脂(PC 含量＞95%)、蛋黃粉(試劑級(jí)),北京索萊寶科技有限公司;硫酸二乙酯(DES)、蛋白胨、酪蛋白胨、魚蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、微晶纖維素、木糖、木聚糖,均為試劑級(jí),北京化工廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L,酵母浸粉10 g/L,NaCl 5 g/L。

蛋黃分離培養(yǎng)基 NaCl 3 g/L,CaCl21 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,蛋黃10 g/L,瓊脂15 g/L。

菌種復(fù)篩培養(yǎng)基 NaCl 3 g/L,CaCl21 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,蛋黃50 g/L。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖10 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏1 g/L,NaCl 3 g/L,CaCl21 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV759 型紫外可見分光光度計(jì),聚創(chuàng)科技有限公司;HWS-80 型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海豫明儀器有限公司;TJZH 型超凈工作臺(tái),北京天宇有限公司;Multiskan FC 型酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司;HZQX100 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱,蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TGL-16 型高速臺(tái)式離心機(jī),上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋黃液的制備

將完整雞蛋浸泡于75%乙醇中15 min,在超凈臺(tái)中取出后吹干,分離蛋黃,用鑷子將卵黃膜挑去,將蛋黃液置于無菌的50 mL 離心管中備用。 用于配制培養(yǎng)基時(shí),滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃以下,加入制備的蛋黃液,振蕩混勻,備用。

1.3.2 蠟樣芽孢桿菌的培養(yǎng)與發(fā)酵

挑取單菌落于4 mL LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng),在37 ℃下培養(yǎng)8 h 后,將對(duì)數(shù)期的種子液以2%的接種量接入到含50 mL 菌種復(fù)篩培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,于37 ℃、200 r/min 下振蕩培養(yǎng)72 h,每6 h 取樣,將樣品于13 000 r/min 離心5 min后取上清作為粗酶液,測定PLD 酶活性。

1.3.3 PLD 酶活性測定

采用酶聯(lián)比色法檢測PLD 活性。 向Tris-HCl緩沖液(0.02 mol/L,pH=7.2)中加入1% Triton X-100 和0.1 mol/L CaCl2制成底物緩沖液,溶解7 g/L的蛋黃卵磷脂(PC 含量＞98%)制成底物溶液。 向1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液中加入0.1 mol/L EDTA,調(diào)節(jié)pH =8 制成反應(yīng)終止液,向Tris-HCl 緩沖液(0.1 mol/L,pH=8)中加入0.15%苯酚和0.125%4-氨基安替比林制成顯色液。 取400 μL 底物緩沖液和100 μL 底物溶液,加入10 μL 稀釋后的粗酶液,于37 ℃反應(yīng)10 min,立即加入200 μL 反應(yīng)終止液并煮沸5 min,冷卻后加入100 μL 顯色液、10 μL膽堿氧化酶溶液(25 U/mL)和5 μL 過氧化物酶溶液(10 U/mL),反應(yīng)3 h 后,于25 ℃在505 nm 波長處使用酶標(biāo)儀測定吸光度,按照下式計(jì)算PLD 的酶活性。

式中:A為PLD 的酶活性,U/mL;ρ為氯化膽堿的質(zhì)量濃度,mg/mL,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到;M為氯化膽堿的摩爾質(zhì)量,g/mol;t為發(fā)酵時(shí)間,min;N為樣品的稀釋倍數(shù)。

酶活性定義:在上述條件下,以蛋黃卵磷脂(PC含量＞98%)為底物,每分鐘釋放1 μmol 膽堿的PLD 的量為1 個(gè)酶活單位(U)。

使用0.2 ～1.0 mg/mL 的氯化膽堿溶液代替粗酶液,在上述條件下反應(yīng)并測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1 所示。 結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi),氯化膽堿的質(zhì)量濃度與吸光度之間的線性關(guān)系良好。

圖1 氯化膽堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of choline chloride

1.3.4 菌種的誘變

采用紫外線及硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法對(duì)出發(fā)菌B.cereusCICC 20551 進(jìn)行誘變。 首先,采用紫外線對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理。 紫外燈預(yù)熱30 min,取對(duì)數(shù)生長期的菌液稀釋后涂布于含有蛋黃分離培養(yǎng)基的平板中,在距離紫外燈40 cm 處分別垂直照射0、5、10、15、20、25、30、35 s 后,立即關(guān)閉紫外燈,避光培養(yǎng)12 h。 以紫外線照射后的平板為實(shí)驗(yàn)組,未經(jīng)照射的平板為對(duì)照組,根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組菌落數(shù)的比值,計(jì)算不同紫外線照射時(shí)間下的細(xì)菌致死率,以確定最適的誘變時(shí)間。 若菌落產(chǎn)生PLD,則可以水解培養(yǎng)基中的蛋黃形成透明圈[17],將具有透明圈的菌落挑取至含有2 mL 菌種復(fù)篩培養(yǎng)基的48 孔板中,在37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)48 h,于13 000 r/min 離心5 min 后取上清作為粗酶液,使用本文建立的高效篩選方法測定PLD 活性,以篩選出產(chǎn)酶效果較好的突變菌。

以紫外線誘變篩選后的最優(yōu)突變體為出發(fā)菌,于4 mL LB 培養(yǎng)基中在37 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,取一定量的菌體,用0.1 mol/L 的磷酸緩沖液(pH=7.0)稀釋至103cfu/mL,在含有4 mL 菌液的試管中,加入80 μL DES 的乙醇溶液(DES 與乙醇的體積比為1∶1),在37 ℃搖床中分別處理10、20、30、40、50、60 min 后,立即加入200 μL 25%硫代硫酸鈉溶液,振蕩2 min,取100 μL 涂布于蛋黃分離培養(yǎng)基平板中,于37 ℃培養(yǎng)14 ～16 h,計(jì)算致死率,以確定最適的誘變時(shí)間。 計(jì)算最適誘變時(shí)間下透明圈直徑與菌落直徑的比值,挑取比值較大的菌落至含有2 mL菌種復(fù)篩培養(yǎng)基的48 孔板中,在37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)48 h,于13 000 r/min 離心5 min 后取上清作為粗酶液,使用本文建立的高效篩選方法測定PLD活性。

1.3.5 PLD 酶活性高效篩選方法的建立

在產(chǎn)磷脂酶菌株的篩選方式上,通常采用蛋黃分離平板與硼砂蛋黃牛津杯法相結(jié)合的方式[18]。首先,利用菌株產(chǎn)生的PLD 酶在蛋黃分離培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈的現(xiàn)象,篩除不能產(chǎn)酶的菌株。 然后,利用透明圈直徑比較各菌落的產(chǎn)酶效率。 考慮到透明圈直徑通常受菌落形狀、菌體生長速度等因素的影響較大,因此將篩選的菌落進(jìn)行培養(yǎng),取發(fā)酵液置于含有硼砂蛋黃固體培養(yǎng)基的牛津杯中,使固體培養(yǎng)基產(chǎn)生形狀規(guī)則的透明圈,進(jìn)而根據(jù)透明圈大小初步篩選出產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株。 使用該方法進(jìn)行了大量的菌落篩選,但效果不明顯,分析其原因主要有兩點(diǎn):(1)發(fā)酵液中酶活性與細(xì)胞中酶濃度有直接關(guān)系,而透明圈大小只能反映發(fā)酵液中的酶活性,無法兼顧細(xì)胞的生長情況;(2)由于磷脂酶A、C 和D都可以水解磷脂產(chǎn)生透明圈,因此透明圈直徑與PLD 活性的相關(guān)性較差。 此外,傳統(tǒng)的篩選方法還存在實(shí)驗(yàn)流程繁瑣、篩選通量及效率不高等問題。

為了解決以上問題,本文在酶聯(lián)比色法的基礎(chǔ)上,建立了PLD 酶活性的高效篩選方法。 PLD 水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生游離的膽堿,膽堿經(jīng)膽堿氧化酶氧化后產(chǎn)生H2O2,再經(jīng)Trinder 反應(yīng)生成紅色醌亞胺化合物,該物質(zhì)在505 nm 波長下有最大吸光度[19]。當(dāng)體系中膽堿氧化酶過量時(shí),膽堿一經(jīng)產(chǎn)生就立即顯色,在一定時(shí)間內(nèi)吸光度與PLD 酶活性呈正相關(guān),根據(jù)這一原理,本文建立了高效的PLD 酶活性篩選方法。 相比酶聯(lián)比色法,該方法省去了加反應(yīng)終止液、煮沸后加顯色劑等步驟,且通量大,可在96孔板內(nèi)直接反應(yīng),經(jīng)酶標(biāo)儀掃描后可直觀地定性比較不同菌株的產(chǎn)酶能力(圖2)。

圖2 96 孔板的酶活熱力圖Fig.2 Thermogram of enzyme activity on a 96-well plate

按照表1 的反應(yīng)體系將各溶液加入96 孔板,立即置于37 ℃的環(huán)境中5 min,使用酶標(biāo)儀在25 ℃、505 nm 波長下檢測吸光度,根據(jù)吸光度大小篩選出產(chǎn)酶效果較好的突變菌,然后按照式(1)計(jì)算其PLD 活性,從而篩選出酶活性最高的突變菌株。

表1 PLD 酶活性高效篩選的反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for efficient screening of PLD enzyme activity

1.3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

為了提高PLD 產(chǎn)量,對(duì)篩選出的產(chǎn)酶效果較好的突變菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。 使用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基,保持其他條件不變,通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶時(shí)600 nm 波長下的光密度(OD600)、誘導(dǎo)物的種類及添加量、氮源和碳源的種類和添加量進(jìn)行考察。在37 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)48 h,于13 000 r/min離心5 min 后取上清作為粗酶液,使用酶聯(lián)比色法測定PLD 酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 蠟樣芽胞桿菌的產(chǎn)PLD 性能

對(duì)出發(fā)菌B.cereusCICC 20551 的產(chǎn)PLD 性能進(jìn)行了測定,結(jié)果如圖3 所示。 可以看出,在發(fā)酵6 h 后菌株的PLD 活性迅速上升,54 h 時(shí)酶活性達(dá)到最大(0.32 U/mL)。 繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間,酶活性緩慢下降。 出發(fā)菌株的最大產(chǎn)酶量遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果(3.2 U/mL)[16],表明該菌株的產(chǎn)酶能力較弱,后續(xù)需要對(duì)其進(jìn)行誘變篩選以提高菌株的PLD活性。

圖3 出發(fā)菌B.cereus CICC 20551 的PLD 酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.3 Changes of PLD enzyme activity of B.cereus CICC 20551 with fermentation time

2.2 紫外線和硫酸二乙酯的最適誘變時(shí)間

對(duì)野生菌進(jìn)行誘變處理是獲得高產(chǎn)性能的常見手段,紫外線誘變和硫酸二乙酯誘變是常用的誘變方法。 當(dāng)采用單一誘變手段時(shí),菌株對(duì)誘變條件易產(chǎn)生耐受性,導(dǎo)致誘變效果不佳,而復(fù)合誘變將兩種誘變方法先后使用,具有協(xié)同效應(yīng),相比單一誘變方法更有優(yōu)勢[20]。 因此,本研究采取紫外線誘變與硫酸二乙酯誘變相結(jié)合的方法,即物理誘變與化學(xué)誘變相結(jié)合的復(fù)合誘變方法對(duì)蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行誘變處理。

為了確定紫外線的最佳照射時(shí)間,將紫外線以固定的距離垂直照射涂布蠟樣芽孢桿菌的蛋黃分離平板,考察照射時(shí)間與細(xì)菌致死率的關(guān)系,結(jié)果如圖4(a)所示。 可以看出,蠟樣芽孢桿菌的致死率隨著照射時(shí)間的增加而增大,在20 s 時(shí)致死率達(dá)到83%,35 s 時(shí)致死率達(dá)到100%。 考慮到80%左右的致死率通常位于菌株產(chǎn)生較多正突變的區(qū)間,本文選擇20 s 作為紫外誘變篩選的照射時(shí)長。 為了確定硫酸二乙酯DES 的最佳處理時(shí)間,使用DES 對(duì)菌液處理不同時(shí)間,計(jì)算細(xì)菌致死率,結(jié)果如圖4(b)所示?？梢钥闯?致死率隨著DES 處理時(shí)間的增加而增大,在30 min 時(shí)致死率達(dá)到79.8%,在60 min 時(shí)致死率接近100%,本文選取30 min 作為DES 誘變處理的時(shí)間。

圖4 不同誘變方法下B.cereus 的致死率隨處理時(shí)間的變化Fig.4 Change of death rate of B.cereus with treatment time under different mutagenesis methods

2.3 蠟樣芽孢桿菌的誘變篩選結(jié)果

采用本文建立的PLD 酶活性高效篩選方法,對(duì)紫外線誘變后的菌落進(jìn)行篩選,共得到約50 批、2 400 個(gè)菌落,從中篩選出一株P(guān)LD 酶活性提升較大的突變株:S6-U6,其PLD 酶活性達(dá)到0.45 U/mL,較出發(fā)菌株提高了40.6%,部分突變菌株的篩選結(jié)果如表2 所示。 以突變株S6-U6 為出發(fā)菌株,進(jìn)行了DES 復(fù)合誘變,共篩選出約10 批、480 個(gè)菌落,經(jīng)過多批次篩選,得到一株高產(chǎn)PLD 的突變株:S6-UD46,其PLD 酶活性達(dá)到0.52 U/mL,較突變株S6-U6 提高了約15.6%,部分突變菌株的篩選結(jié)果如表3 所示。

表2 紫外線誘變后部分菌株的酶活性Table 2 Enzyme activities of some strains after ultraviolet mutagenesis

表3 DES 誘變后部分菌株的酶活性Table 3 Enzyme activities of some strains after DES mutagenesis

將原始菌株B.cereusCICC 20551 和突變菌株S6-UD46 在菌種復(fù)篩培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如圖5 所示。 可以看出,突變菌株S6-UD46 在培養(yǎng)48 h 時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最大(0.52 U/mL),相比原始菌株(0.32 U/mL)提高了62.5%,并且突變菌株產(chǎn)酶量達(dá)到最大的時(shí)間(48 h)比原始菌株(54 h)提前了6 h。 為了考察突變菌株S6-UD46 的傳代穩(wěn)定性,取原代菌株第48 h 的發(fā)酵液,以2%的接種量轉(zhuǎn)接至新的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,取第48 h 的發(fā)酵液樣品,測定其PLD 活性,每48 h 轉(zhuǎn)接1 次,分析轉(zhuǎn)接10 代后酶活的變化,結(jié)果如圖6 所示。 可以看出,該突變菌株經(jīng)過10 代的傳代后產(chǎn)酶能力沒有明顯變化,每一代的產(chǎn)酶能力都較為穩(wěn)定,PLD 酶活性僅在0.50 ～0.54 U/mL 的區(qū)間內(nèi)小幅波動(dòng),表明該突變菌株的產(chǎn)酶能力較為穩(wěn)定。

圖5 突變菌株S6-UD46 與出發(fā)菌株的PLD 活性曲線對(duì)比Fig.5 Comparison of PLD activity curves between the mutant strain S6-UD46 and the original strain

圖6 突變菌株S6-UD46 的傳代穩(wěn)定性Fig.6 Generation stability of the mutant strain S6-UD46

2.4 突變菌株S6-UD46 的發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 OD600

有研究表明,蠟樣芽孢桿菌ZY12 產(chǎn)PLD 需要磷脂類物質(zhì)的誘導(dǎo)[14]。 本課題組在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),所篩選出的突變株S6-UD46 在含有磷脂類物質(zhì)的培養(yǎng)基中才能檢測到較高的PLD 活性,即該菌的產(chǎn)酶機(jī)制為誘導(dǎo)產(chǎn)酶。 通常菌株的生長與產(chǎn)酶并不是完全耦合的,對(duì)于需要誘導(dǎo)產(chǎn)酶的菌株,過早加入誘導(dǎo)劑可能會(huì)加重菌株的代謝負(fù)擔(dān),導(dǎo)致生物量下降;而過晚加入誘導(dǎo)物質(zhì),培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)即將消耗完全,導(dǎo)致菌株的生長代謝趨于停滯,不利于產(chǎn)酶。

為了確定突變菌株S6-UD46 誘導(dǎo)產(chǎn)酶的最佳時(shí)機(jī),通過測定菌液OD600,選取對(duì)數(shù)生長期的前、中、后3 個(gè)時(shí)期,分別在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50 g/L 蛋黃液誘導(dǎo)產(chǎn)酶,使用酶聯(lián)比色法測定發(fā)酵48 h 時(shí)不同OD600下的PLD 酶活性,結(jié)果如圖7 所示。 可以看出,隨著加入蛋黃誘導(dǎo)時(shí)菌體量的增大,PLD 酶活性出現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在OD600為4時(shí)加入蛋黃,PLD 酶活性達(dá)到最大。

圖7 在不同OD600下加入50 g/L 蛋黃對(duì)PLD 活性的影響Fig.7 Effect of adding 50 g/L yolk at different OD600 on PLD activity

2.4.2 誘導(dǎo)物種類及添加量

不同誘導(dǎo)物對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響有所不同,將含磷脂的不同誘導(dǎo)物以50 g/L 的添加量加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)突變菌株S6-UD46 產(chǎn)酶,并測定PLD 活性,結(jié)果如圖8 所示。 可以看出,除蛋黃粉外,其余含磷脂的物質(zhì)都對(duì)菌株產(chǎn)酶產(chǎn)生了一定的誘導(dǎo)作用,其中卵磷酯(PC 含量＞90%)的誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果最好,PLD 酶活性可達(dá)2.6 U/mL。 值得注意的是,甘油磷酸膽堿GPC 也獲得了較好的誘導(dǎo)效果,GPC 具有磷酸二酯鍵和膽堿基團(tuán),但其不屬于傳統(tǒng)磷脂(甘油磷脂)物質(zhì),這可能表明蠟樣芽孢桿菌來源的PLD 具有較廣泛的底物特異性。 GPC 溶于水的性質(zhì)使其比磷脂類的乳濁液更適合后續(xù)酶的分離純化,值得進(jìn)一步研究。 而添加蛋黃粉幾乎未測得酶活,可能是在蛋黃粉的加工過程中破壞了磷脂結(jié)構(gòu),使其失去了誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力。

圖8 誘導(dǎo)物種類對(duì)PLD 活性的影響Fig.8 Effects of different inducers on PLD activity

誘導(dǎo)物的添加量對(duì)細(xì)胞生長及產(chǎn)酶同樣有重要影響。 根據(jù)上述結(jié)果,選擇的最佳誘導(dǎo)物為卵磷脂(PC 含量＞90%),為了探究卵磷脂的最適添加量,在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入10 ～80 g/L 的卵磷脂(PC 含量＞90%),培養(yǎng)48 h 后比較菌株的產(chǎn)酶效果,結(jié)果如圖9 所示。 可以看出,在添加量為10 g/L 時(shí)卵磷脂就得到了較好的誘導(dǎo)效果,隨著添加量的增加,PLD 活性逐漸增大,在卵磷脂添加量為40 g/L 時(shí)PLD 活性達(dá)到最大(2.8 U/mL)。 當(dāng)添加量超過50 g/L 后,PLD 活性急劇下降,在發(fā)酵液中出現(xiàn)了結(jié)塊現(xiàn)象,這可能是由于培養(yǎng)基過于黏稠,影響了菌體的生長。

圖9 卵磷脂(PC 含量＞90%)添加量對(duì)PLD 活性的影響Fig.9 Effect of addition amount of lecithin (PC content ＞90%) on PLD activity

2.4.3 氮源種類及添加量

氮源提供微生物生長所需的最基本營養(yǎng)因子,是菌體合成蛋白質(zhì)所必需的原料。 在誘導(dǎo)產(chǎn)酶時(shí)40 g/L 的卵磷酯(PC 含量＞90%)既作為誘導(dǎo)物質(zhì)又作為氮源,這極大提升了PLD 的酶活性。 蠟樣芽孢桿菌可以利用多種氮源,為了篩選出產(chǎn)PLD 的最適氮源,在添加卵磷脂的基礎(chǔ)上,本研究比較了5 種有機(jī)氮源(蛋白胨、酪蛋白胨、魚蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏)和2 種無機(jī)氮源(尿素和硫酸銨)的產(chǎn)酶效果。 將發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源(蛋白胨和牛肉膏)分別替換為10 g/L 上述氮源,測定菌株培養(yǎng)48 h 時(shí)的PLD 酶活性,結(jié)果如圖10 所示。 可以看出,在使用牛肉膏作為氮源時(shí),PLD 的酶活性最高,達(dá)到2.9 U/mL。 牛肉膏含有多種氨基酸、無機(jī)鹽、糖以及含氮的肌肉提取物,可以滿足蠟樣芽孢桿菌生長和產(chǎn)酶的需求。 而無機(jī)氮源未能取得很好的產(chǎn)酶效果,這可能是由于無機(jī)氮源中缺乏必要的輔因子和氨基酸。

圖10 氮源種類對(duì)PLD 活性的影響Fig.10 Effect of different nitrogen sources on PLD activity

為了探究牛肉膏的添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶效果的影響,分別在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10、20、30、40、50 g/L 的牛肉膏,發(fā)酵48 h 時(shí)取樣,測定PLD 酶活性,結(jié)果如圖11 所示。 可以看出,牛肉膏的添加量對(duì)PLD 酶活性的影響較小,在添加20 g/L 牛肉膏時(shí)PLD 酶活性達(dá)到最大(3.11 U/mL),繼續(xù)增加牛肉膏的添加量,酶活性有所降低。

圖11 牛肉膏添加量對(duì)PLD 活性的影響Fig.11 Effect of addition amount of beef extract on PLD activity

2.4.4 碳源種類及添加量

碳源既作為構(gòu)成細(xì)胞的骨架,也能為菌體生產(chǎn)提供能源。 為了探究不同碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、微晶纖維素、木糖和木聚糖)對(duì)突變菌株S6-UD46 發(fā)酵產(chǎn)PLD 的影響,將發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源替換為10 g/L 上述碳源,在培養(yǎng)48 h 時(shí)取樣,測定PLD 酶活性,結(jié)果如圖12 所示?？梢钥闯?許多碳源都取得了較好的產(chǎn)酶效果,其中蔗糖的PLD 酶活性為3.22 U/mL,略高于葡萄糖。此外,S6-UD46 可以利用木糖進(jìn)行發(fā)酵,表明其具有木糖代謝途徑,但不能利用木聚糖,原因可能是其產(chǎn)木聚糖酶的水平較低。

圖12 碳源種類對(duì)PLD 活性的影響Fig.12 Effect of different carbon sources on PLD activity

為了探究了蔗糖的添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶效果的影響,分別在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5、10、15、20、30、40 g/L 的蔗糖作為碳源,發(fā)酵48 h 時(shí)取樣,測定PLD 酶活性,結(jié)果如圖13 所示。 可以看出,當(dāng)蔗糖添加量為 10 g/L 時(shí) PLD 的酶活性最大(3.22 U/mL),是優(yōu)化前(0.52 U/mL)的6.19 倍。繼續(xù)增大碳源濃度,產(chǎn)酶量沒有明顯變化,這可能是因?yàn)檎崽菨舛仍龃蟾淖兞税l(fā)酵液的滲透壓,影響了細(xì)胞生長和產(chǎn)酶效率。

圖13 蔗糖添加量對(duì)PLD 活性的影響Fig.13 Effect of addition amount of sucrose on PLD activity

3 結(jié)論

(1)以蠟樣芽孢桿菌B.cereusCICC 20551 為出發(fā)菌株,采用紫外線與硫酸二乙酯對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變,同時(shí)利用本文建立的PLD 酶活性高效篩選方法,篩選出一株高產(chǎn)PLD 的突變菌株S6-UD46,培養(yǎng)48 h 時(shí)該菌株的PLD 產(chǎn)酶量可達(dá)0.52 U/mL,與原始菌株相比酶活性提高了62.5%。

(2)對(duì)突變菌株S6-UD46 的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到最佳發(fā)酵條件為:以20 g/L 牛肉膏為氮源,10 g/L 蔗糖為碳源,在OD600達(dá)到4 左右時(shí)加入40 g/L 卵磷脂(PC 含量＞90%)進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶,在37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)48 h,PLD 的酶活性可達(dá)3.22 U/mL,是優(yōu)化前的6.19 倍。