超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中15種N-亞硝胺化合物

汪 毅，梁文耀，何國山，陳張好，周智明，吳 謙，席紹峰，譚建華*

（1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家化妝品質(zhì)量檢驗檢測中心（廣州），廣東 廣州 511447；2.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663）

N-亞硝胺化合物是一類具有N-亞硝基結(jié)構(gòu)的化合物，因取代基的不同，形成了種類繁多的同系物，目前已發(fā)現(xiàn)超過300種［1］。N-亞硝胺化合物大多具有致癌性［2］，在飲用水、食品、煙草、化妝品中均有N-亞硝胺化合物檢出情況［3-6］，對人體健康構(gòu)成威脅。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）［7］與歐盟化妝品法規(guī)（EC）No 1223/2009［8］均將N-亞硝胺化合物列入禁用目錄，并規(guī)定化妝品產(chǎn)品中N-亞硝胺化合物不得超過50 ng/g?；瘖y品中N-亞硝胺化合物的主要來源為原料直接帶入或原料經(jīng)亞硝化反應(yīng)產(chǎn)生。

文獻報道化妝品中可能檢出的N-亞硝胺化合物有N-亞硝基二乙醇胺（NDELA）、N-亞硝基二甲基胺（NDMA）等［6，9-14］，檢測方法主要有氣相色譜-熱能分析法（GC-TEA）［15］、液相色譜-熱能分析法（LCTEA）［16］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［3，5，10，12-14］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）［6，9，11，17］、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（LC-HRMS）［4，18］、氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法（GC-HRMS）［19］。N-亞硝胺化合物通常痕量存在于化妝品中，對方法的靈敏度要求極高。國家標準GB/T 29669-2013 采用GC-MS/MS 測定10 種N-亞硝胺化合物［20］，但方法的檢出限不能滿足50 ng/g 的限量要求。另外，由于N-亞硝胺為一大類化合物，物化性質(zhì)差異很大，現(xiàn)有文獻采用LC-MS/MS 技術(shù)［3，5，10，12-14］進行測定時主要針對部分性質(zhì)差異較小的N-亞硝胺化合物，方法所涉及的化合物覆蓋范圍不足。因此，亟需建立準確、靈敏、覆蓋范圍廣的N-亞硝胺化合物檢測方法。

本研究根據(jù)15種N-亞硝胺化合物的物化性質(zhì)和不同化妝品的基質(zhì)特點，通過系統(tǒng)優(yōu)化前處理方法和儀器分析條件，最終采用分組提取，結(jié)合亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液沉淀大分子和飽和氯化鈉-乙腈鹽析等凈化方法，解決了部分N-亞硝胺化合物穩(wěn)定性差、易被干擾且多組分測定時存在的溶劑效應(yīng)等問題，建立了覆蓋化妝品中15種N-亞硝胺化合物的UPLC-MS/MS檢測方法。方法的準確度、精密度和靈敏度可滿足化妝品中N-亞硝胺化合物的痕量檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX Triple Quad? 5500+超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀配有大氣壓化學(xué)電離源（APCI）（美國SCIX 公司）；BSA224S-CW 電子天平（德國賽多利斯公司）；MS3 basic 渦旋振蕩器（德國IKA 公司）；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

15 種N-亞硝胺化合物對照品和5 種N-亞硝胺化合物同位素內(nèi)標信息詳見表1，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL于甲醇，均購于上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙酸銨、氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實驗用純水（18.2 MΩ?cm）由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。化妝品的實際樣品為市售產(chǎn)品。

表1 N-亞硝胺化合物對照品和同位素內(nèi)標信息Table 1 Reference materials and isotope internal standard compounds information of N-nitrosamine compounds

（續(xù)表1）

1.2 標準溶液的配制

分別準確移取NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA 對照品溶液各100 μL，置于10 mL棕色容量瓶中，用水定容，即得質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL的混合標準溶液（水）；分別準確移取NDELA-D8、NDMA-D6、NPYR-D4、NDEA-D4內(nèi)標溶液100 μL 于10 mL 棕色容量瓶中，用水定容，配制成質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL的混合內(nèi)標溶液；用水配制成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50 ng/mL，內(nèi)標濃度為10 ng/mL 的標準工作溶液（水）。按相同的操作用乙腈配制NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA，內(nèi)標為NDBA-D18的標準工作溶液（乙腈）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 水劑樣品稱取試樣約0.5 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 具塞比色管中，加入50 μL 混合內(nèi)標溶液（水），混勻，用水定容至5 mL，超聲提取10 min，經(jīng)微孔濾膜過濾后，濾液作為待測溶液測定NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA。

稱取試樣約0.5 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 具塞比色管中，加入50 μL 內(nèi)標溶液（乙腈），混勻，用乙腈定容至5 mL，超聲提取10 min，經(jīng)微孔濾膜過濾后，濾液作為待測溶液測定NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA。

1.3.2 膏霜乳液樣品稱取試樣約0.5 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 具塞塑料離心管中，加入50 μL混合內(nèi)標溶液（水），混勻，用水定容至5 mL，超聲10 min，加入100 μL 2.5%亞鐵氰化鉀溶液和100 μL 5%乙酸鋅溶液，混勻，靜置5 min 后，以5 000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后，濾液作為待測溶液測定NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA。

稱取試樣約0.5 g（精確至0.000 1 g）于10 mL 塑料離心管中，加入50 μL 內(nèi)標溶液（乙腈），混勻，加入2 mL 飽和氯化鈉水溶液，混勻后，加入5 mL 乙腈，超聲提取10 min，以5 000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后，濾液作為待測溶液測定NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA。

1.4 儀器條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-Aq 色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm，美國安捷倫公司）；流動相：A為0.2 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min，2% B；2.0～10.0 min，2%～98% B；10.0～12.0 min，98% B；12.0～12.1 min，98%～2% B；12.1～15.0 min，2% B；流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。電離方式：APCI+；氣簾氣：0.172 MPa；針電流：3 mA；源溫度：450 ℃；噴霧氣：0.207 MPa；噴撞氣：0.062 1 MPa；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式，15種亞硝胺化合物和5種同位素內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 N-亞硝胺化合物和同位素內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of N-nitrosamine compounds and isotope internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

電噴霧離子源（ESI）一般適用于分子量稍大、極性較強的化合物，大氣壓化學(xué)電離源（APCI）適用于分子量較小、極性稍弱的化合物。本研究的15種N-亞硝胺化合物的分子量和極性差異較大，導(dǎo)致其在ESI和APCI兩種離子源的響應(yīng)有較大差異。由于NDMA、NMEA、NDEA分子量較小且具有一定揮發(fā)性，這些化合物在APCI+模式下有較高的響應(yīng)，但在ESI+模式下響應(yīng)非常低。對于NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA 等化合物，由于支鏈的碳鏈不斷加長，分子量變大，在APCI+模式下響應(yīng)強度低于ESI+，但仍然能夠滿足靈敏度要求。進一步分析基質(zhì)加標樣品時發(fā)現(xiàn)，膏霜乳液類化妝品在ESI+下相比APCI+更易出現(xiàn)基質(zhì)干擾和抑制，特別是對于出峰時間較慢的NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA 等化合物，其原因可能是因為化妝品中各類高含量表面活性劑等基質(zhì)所致。因此，本研究選擇APCI+模式，并通過進一步優(yōu)化源溫度、噴霧氣、針電流參數(shù)使15 種N-亞硝胺化合物獲得最高的儀器靈敏度。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇考察了Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國賽默飛公司）、Agilent Poroshell Bonus-RP（50 mm×4.6 mm，2.7 μm，美國安捷倫公司）、Agilent Poroshell SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國安捷倫公司）、Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm，美國Phenomenex 公司）、Agilent Poroshell SB-Aq 色譜柱（100 mm×3 mm，2.7 μm，美國安捷倫公司）5 種色譜柱對N-亞硝胺化合物的分離情況。結(jié)果顯示，化合物在5 種色譜柱上均能實現(xiàn)分離，柱徑和填料粒徑越小，峰形越尖銳，但柱壓越高，其中Aq柱對親水性化合物保留較好，能使化合物與基質(zhì)干擾分離。考慮到APCI 需要較高流速，且分離NDELA 和NDMA 需要高比例水相，同時為了減少化妝品基質(zhì)成分的干擾，最終選用Agilent Poroshell SB-Aq 色譜柱進行分離。

2.2.2 流動相的選擇考察了水+甲醇（A）、0.1%甲酸水+甲醇（B）、0.1%甲酸水+0.1%甲酸甲醇（C）、1 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）+甲醇（D）、1 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）+乙腈（E）5 組不同流動相對化合物峰形和響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，使用流動相A、B、C 時，15 種N-亞硝胺化合物均能正常出峰，但NDMA、NMEA 和NPYR 檢測離子對的基線響應(yīng)較高，信噪比偏低，靈敏度下降。甲酸的加入能使化合物響應(yīng)增大，但對基線響應(yīng)偏高的現(xiàn)象無改善，且多個化合物的基線響應(yīng)波動增大。使用流動相D 時，乙酸銨的加入明顯降低基線響應(yīng)和改善峰形，但同時也會抑制部分化合物的電離，降低響應(yīng)，但總體來說提高了信噪比，特別是提高了NDMA、NMEA 和NPYR 的信噪比。流動相E 用乙腈代替甲醇作為有機相，峰形變得更尖銳，但所有化合物的響應(yīng)明顯降低。分析其原因可能是在APCI+模式下，甲酸的加入能提供H+質(zhì)子，有助于化合物電離的同時也提高了背景化合物的響應(yīng)。乙酸銨的加入，使得流動相離子強度增加，電子轉(zhuǎn)移速率增加，目標化合物和背景化合物同時抑制電離，乙酸銨在一定濃度下，可提高目標化合物的信噪比。

在流動相D 的基礎(chǔ)上進一步對比了不同乙酸銨濃度（0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L）對化合物峰形及響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，隨著乙酸銨濃度的增大，基線響應(yīng)降低，0.5 mmol/L時基線響應(yīng)達到最低，繼續(xù)增大乙酸銨濃度，對基線影響不明顯?；衔镯憫?yīng)則隨乙酸銨濃度的增大而降低，NMOR 較為明顯。為了兼顧基線響應(yīng)和化合物響應(yīng)，達到最優(yōu)信噪比，最終選取0.2 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）+甲醇作為流動相。優(yōu)化條件下15 種N-亞硝胺化合物和5 種同位素內(nèi)標的提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 15種N-亞硝胺化合物和5種同位素內(nèi)標提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of 15 N-nitrosamine compounds and 5 isotope internal standards

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取方式的優(yōu)化15 種N-亞硝胺化合物的性質(zhì)差異較大，logKow 從-1.28 到7.07，可溶于甲醇、乙腈等有機溶劑且部分可溶于水。實驗首先考察了不同上機溶液（純水、10%～90%甲醇水、10%～90%乙腈水、甲醇和乙腈）對溶劑效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA 這8種脂溶性較低的N-亞硝胺化合物對上機溶液較為敏感，溶劑效應(yīng)較強，有機相比例增大時，峰形嚴重展寬。同時，隨著有機相比例增大，脂溶性較強的NDiNA 響應(yīng)逐步提高，原因可能是由于有機相比例提高，增大了溶解度，使其響應(yīng)提高（見圖2）。因此，由于溶劑效應(yīng)和溶解度的雙重影響，本研究中的15種N-亞硝胺化合物很難選取同一種上機溶液。

圖2 不同上機溶液中N-亞硝胺化合物的提取離子色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatograms of N-nitrosamine compounds in different solutions

為避免溶劑效應(yīng)，實驗進一步以乙腈為提取溶劑，考察增加氮吹、復(fù)溶的方式對N-亞硝胺化合物加標回收率的影響。結(jié)果顯示，15 種化合物的加標回收率均小于80%，分子量較小的NDMA、NMEA、NDEA等的回收率甚至低于50%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，即使嚴格控制溫度、避光和氮氣流量條件，氮吹過程中N-亞硝胺化合物仍有較大損失，說明該類化合物的穩(wěn)定性較差。因此整個實驗過程應(yīng)避免使用氮吹處理。如果采用純水對提取液稀釋的方式降低溶劑效應(yīng)，上機溶液中乙腈的比例需稀釋至低于20%，但該操作將方法檢出限提高了5倍，無法滿足50 ng/g的法規(guī)限量要求。因此，本研究將15種N-亞硝胺化合物根據(jù)極性大小分為兩組，第一組為NDELA、NDMA、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA，第二組為NMPhA、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA、NDCH、NDiNA，分別用水和乙腈進行提取。

進一步實驗發(fā)現(xiàn)，對于第一組化合物采用水作為提取溶劑，膏霜、乳液樣品含較多脂質(zhì)和增稠劑，提取后難于過濾，水劑基質(zhì)則能很好實現(xiàn)提取和過濾。而在膏霜、乳液基質(zhì)提取液中加入亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液沉淀大分子，離心后，可順利完成過濾操作。該條件下，NDELA 等8 種N-亞硝胺化合物的加標回收率均大于85%，且上機測定時色譜峰形尖銳。對于第二組化合物直接采用乙腈進行提取，但部分膏霜樣品因含有高含量的表面活性劑等，造成較為嚴重的基質(zhì)干擾。采用飽和氯化鈉-乙腈鹽析萃取法能大大降低基質(zhì)效應(yīng)，NMPhA等7種N-亞硝胺化合物的加標回收率均在85%以上。

2.3.2 提取時間的優(yōu)化選取超聲提取方式進行樣品的前處理，并考察了不同超聲時間（5、10、15、20 min）對化合物的提取效果（見圖3）。結(jié)果顯示，超聲時間達到10 min 時，15 種N-亞硝胺化合物的加標回收率均可達到85%以上，進一步延長超聲時間對提取效果影響不大，但在超聲時間達到20 min 時部分N-亞硝胺的回收率呈下降趨勢，可能是發(fā)生了降解轉(zhuǎn)化所致。因此本研究選取10 min 作為最佳超聲提取時間。

圖3 超聲時間對15種N-亞硝胺化合物回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on the spiked recoveries of 15 N-nitrosamine compounds

2.3.3 固相萃取凈化效果的考察采用固相萃取的凈化方式考察了Waters Oasis HLB（60 mg，3 mL）、Waters Oasis WCX（60 mg，3 mL）、Waters Oasis MCX（60 mg，3 mL）（美國沃特世公司）和CNW C18（60 mg，3 mL，上海安譜公司）4 種萃取小柱對N-亞硝胺化合物的加標回收率。結(jié)果顯示，使用HLB 和C18小柱時，過柱和氮吹等操作導(dǎo)致部分化合物損失嚴重，且強極性的NDELA和NDMA在固相萃取小柱上保留較弱，導(dǎo)致直接流出，回收率低于10%；而NDiNA 在小柱上保留過強，難于洗脫，使得回收率偏低。使用WCX 和MCX 時，上樣和洗脫需用氨水和甲酸調(diào)節(jié)pH 值，由于N-亞硝胺化合物對酸堿較敏感，操作過程中導(dǎo)致化合物降解，回收率無法達到理想效果。因此，本研究最終未采用固相萃取的凈化方式，而是通過“2.3.1”對提取方式進行系統(tǒng)優(yōu)化以提升方法的準確性和精密度。

2.4 線性關(guān)系、方法檢出限與定量下限

按“1.4”儀器條件，將質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50 ng/mL，內(nèi)標濃度為10 ng/mL 的標準工作溶液由低到高進行測定。以標準溶液濃度與同位素內(nèi)標濃度之比為橫坐標，對應(yīng)的峰面積與同位素內(nèi)標峰面積之比為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，所有化合物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.995。分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）計算方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。表3 列出了15 種N-亞硝胺化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量下限。

表3 15種N-亞硝胺化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、方法檢出限及定量下限Table 3 Linear regression equations，correlation coefficients（r2），detection limits and quantitation limits of 15 N-nitrosamine compounds

（續(xù)表3）

2.5 回收率與相對標準偏差

平行稱取3 種空白基質(zhì)（水劑、乳液、膏霜）樣品各6 份，每份約0.5 g，共3 組，分別加入適量混合標準溶液和內(nèi)標溶液，使得加標水平分別為25、50、100 ng/g（1/2倍限量值、限量值、2倍限量值），按“1.3”處理后進行測定，15種N-亞硝胺化合物的加標回收率與相對標準偏差（RSD）結(jié)果見表4。從表中可以看出，3 種基質(zhì)在不同加標濃度下化合物的平均回收率為88.0%～111%，RSD 為1.4%～9.8%。結(jié)果顯示，該方法準確可靠，精密度高。

表4 15種N-亞硝胺化合物的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 15 N-nitrosamine compounds（n=6）

（續(xù)表4）

2.6 實際樣品測定

收集水劑、乳液、膏霜等類型市售化妝品樣品71 批次，采用本方法對15 種N-亞硝胺化合物進行測定。檢測結(jié)果見表5。13 批次樣品檢出NDELA，其中12 批次均小于限量值50 ng/g，1 批次潔面泡泡樣品中檢出705 ng/g的NDELA，超出限量值。化妝品樣品中常檢出NDELA，這與化妝品較多使用三乙醇胺（TEA）相關(guān)原料有關(guān)。分析NDELA 超限量值樣品的配方表，發(fā)現(xiàn)其使用月桂醇硫酸酯TEA鹽作為原料，此原料可能帶入NDELA，導(dǎo)致其超過限量值，建議加強原料的質(zhì)量控制。

表5 市售樣品中N-亞硝胺化合物的檢測結(jié)果Table 5 Test results of N-nitrosamine compounds in commercially available samples

3 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)和超高效液相色譜條件，調(diào)整前處理方法以及采用同位素內(nèi)標等方式，建立了UPLC-MS/MS測定化妝品中15種N-亞硝胺化合物的分析方法。方法針對性較強、測定結(jié)果準確可靠，檢出限滿足相關(guān)限量要求，適用于化妝品中15種N-亞硝胺化合物的痕量測定。該方法有效彌補了現(xiàn)有標準方法的不足，通過對市售化妝品的檢測，發(fā)現(xiàn)NDELA常檢出且存在超限量值情況。本方法的建立將為化妝品中N-亞硝胺化合物的監(jiān)測和風(fēng)險評估提供更多的技術(shù)手段，為化妝品監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供重要的技術(shù)支撐。