基于納米生物條形碼和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器用于蛋白激酶活性分析

張慧蓮，蘇愛雯，吳永菊，張艷麗*，王紅斌，楊文榮，2，龐鵬飛*

（1.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南省教育廳環(huán)境功能材料重點實驗室，云南 昆明 650504；2.迪肯大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，澳大利亞維多利亞州 吉朗 3217）

蛋白激酶（PKA）催化蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)最普遍和最重要的翻譯后修飾方式之一，在許多細(xì)胞生理過程中發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞周期進(jìn)展、基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化和凋亡等［1-4］。磷酸化過程的異常和激酶活性的過度表達(dá)與許多人類疾病密切相關(guān)，如糖尿病、阿爾茨海默病、心血管疾病和癌癥等［5-7］。此外，由于許多疾病與PKA介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路的擾動有關(guān)，找到下調(diào)蛋白激酶活性的潛在抑制劑對于發(fā)現(xiàn)新的藥物具有重要作用［8-10］。因此，蛋白激酶活性測定及其抑制劑篩選對于基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷以及酶靶藥物的開發(fā)均具有重要意義。傳統(tǒng)測定蛋白激酶活性的方法有放射性同位素標(biāo)記法［11］、質(zhì)譜法［12-13］、拉曼光譜法［14］、熒光法［15-18］、比色法［19-22］和電化學(xué)法［23-28］等。這些檢測方法和技術(shù)在一定程度上促進(jìn)了對蛋白激酶活性的研究，然而也普遍存在一定的局限性，如放射性危害、專用儀器昂貴和操作繁瑣耗時等缺點。電化學(xué)方法因具有響應(yīng)快速、易于小型化以及良好的靈敏度和選擇性等突出優(yōu)點，受到研究者的廣泛關(guān)注，并成為測定激酶活性的替代方法［29-31］。

生物條形碼（Bio-barcode）是指DNA 分子序列中四種堿基按照一定的排列規(guī)則表達(dá)一組信息，可對目標(biāo)物進(jìn)行標(biāo)注和識別的DNA 分子片段［32-33］。作為一種新型的分析診斷工具，生物條形碼技術(shù)具有靈敏度高、檢測快速、操作簡單及重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞、病毒及小分子的檢測［34］。利用生物條形碼技術(shù)的間接信號放大作用，可改善和提高傳統(tǒng)免疫檢測方法的缺陷和不足，實現(xiàn)對DNA 和蛋白質(zhì)的超高靈敏檢測［35-37］。隨著納米技術(shù)和納米材料的發(fā)展，將生物條形碼技術(shù)和納米技術(shù)相結(jié)合，并將生物條形碼和識別元件修飾在納米材料（如金納米粒子）表面形成具有識別和放大功能的納米生物條形碼技術(shù)，在藥物控釋、體內(nèi)篩選、基因調(diào)控、生物成像和納米生物傳感等方面受到極大關(guān)注［38-39］。作為一種生物信號放大技術(shù)，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）是一種立足點介導(dǎo)的鏈置換（Toehold- mediated strand displacement）反應(yīng)，其級聯(lián)放大雜交反應(yīng)由目標(biāo)分析物引發(fā)，形成長的雙鏈DNA 產(chǎn)物［40-41］。HCR 由于其無酶、簡單、高效的擴增特點，受到越來越多研究者的關(guān)注，已被用來構(gòu)建不同種類的生物傳感器，用于核酸、小分子、細(xì)胞和蛋白質(zhì)等檢測［26，42-44］。此外，HCR 在生物成像和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也引起了極大的關(guān)注［45］。目前，基于生物條形碼和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雙重信號放大策略構(gòu)建的生物傳感檢測方法鮮有報道［46］。因此，本研究以MoS2/AuNPs納米復(fù)合材料作為電極修飾材料，結(jié)合納米生物條形碼（S1-AuNPs-Ab）和HCR 雙重信號放大策略構(gòu)建了一種電化學(xué)生物傳感器用于蛋白激酶A（PKA）活性分析。底物肽鏈通過Au-S鍵修飾到MoS2/AuNPs電極表面，當(dāng)存在目標(biāo)物條件時，底物肽鏈被磷酸化，并與S1-AuNPs-Ab 探針特異性結(jié)合，S1-AuNPs-Ab 探針中S1 鏈作為引發(fā)鏈，可誘導(dǎo)發(fā)夾DNA（H1 和H2）在電極表面發(fā)生HCR 反應(yīng)。HCR 反應(yīng)產(chǎn)物吸附亞甲基藍(lán)（MB）電活性分子，產(chǎn)生放大的電化學(xué)響應(yīng)信號，從而實現(xiàn)對PKA活性的靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Autolab PGSTAT302N 電化學(xué)工作站（瑞士萬通中國有限公司）；UV-2600i 紫外可見分光光度計（日本島津制作所）；JEM-2100 透射電子顯微鏡（日本JEOL）；Sigma 300 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國Zeiss）；DYCP-31BN 瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）；TGL-16G離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

蛋白激酶A（PKA，催化亞基來自牛心臟）購自New England Biolabs 公司（NEB，廣州）；半胱氨酸修飾的底物肽鏈（Peptide，CLRRASLG）購自吉爾生化（上海）有限公司；磷酸化絲氨酸抗體（Phosphoserine antibody）購自亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）和四氯金酸（HAuCl4?4H2O）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三磷酸腺苷（ATP）、T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）、堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化物酶（HRP）、溶菌酶（Lysozyme）、L-半胱氨酸（L-cysteine）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；N-［2-［p-溴苯丙烯鹽基氨基］乙基］-5-異喹啉磺酰胺二鹽酸鹽（H-89）購于美國EMD Biosciences 公司；六氰合鐵酸鉀（K3Fe（CN）6）、六氰亞鐵酸鉀（K4Fe（CN）6·3H2O）、檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）購于天津市豐川科技有限公司。DNA 寡核苷酸鏈由寶生物工程（大連）有限公司合成并純化，堿基序列詳見表1。所用試劑均為分析純，使用時未經(jīng)進(jìn)一步純化，溶液采用水配制。實驗用水均為去離子水。

表1 DNA寡核苷酸鏈堿基序列Table 1 Base sequences of the designed DNA oligonucleotides

1.2 MoS2的制備

采用水熱合成法制備MoS2納米片［47-48］，稱取2.4 g Na2MoO4·2H2O 超聲溶解于50 mL 水中，用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 值至6.5，加入3.6 gL-cysteine，攪拌混勻5 min 后，將上述混合溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 高壓釜中，200 ℃加熱48 h。自然冷卻至室溫后，離心分離，收集沉淀產(chǎn)物，再用無水乙醇和水反復(fù)洗滌產(chǎn)物數(shù)次，70 ℃下真空干燥12 h，得到MoS2納米片。

1.3 AuNPs的制備

利用檸檬酸鈉還原HAuCl4方法制備AuNPs，量取50 mL 1.0 mmol/L 的HAuCl4溶液并攪拌煮沸，迅速加入5 mL 40 mmol/L 檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸并攪拌15 min，酒紅色溶液自然冷卻至室溫，得到AuNPs溶液，4 ℃下儲存，備用。

1.4 納米生物條形碼S1-AuNPs-Ab的制備

根據(jù)文獻(xiàn)報道方法［32，49］改進(jìn)后制備生物條形碼S1-AuNPs-Ab 探針：量取30 μL 上述制備的AuNPs溶液，分別各加入10 μL 70 μmol/L S1 和1 μmol/L Ab，輕微振蕩過夜，得到S1-AuNPs-Ab 探針。S1 和Ab 使用前需經(jīng)TCEP 活化，制備的S1-AuNPs-Ab 在鹽溶液（0.1 mol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl）中老化24 h 后，12 000 r/min 離心30 min，去除多余的殘余物。S1-AuNPs-Ab 用水洗滌和離心3 次，溶解于25 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，保存于4 ℃，備用。

1.5 生物傳感器的制備

將玻碳電極（GCE，直徑為3 mm）依次用粒徑為0.3和0.05 μm 的Al2O3粉在拋光布上打磨拋光，再依次用水、乙醇、水超聲清洗，氮氣吹干，備用。在GCE 表面滴涂5 μL MoS2溶液（2 mg/mL），自然晾干后，再滴涂5 μL 上述制備的AuNPs 溶液，自然干燥。取10 μL 500 μmol/L 底物肽溶液（10 mmol/L PBS，pH 7.4，15 mmol/L TCEP）滴涂于修飾電極表面，室溫孵育過夜。然后，將電極浸入100 μmol/L ATP和不同濃度PKA溶液進(jìn)行磷酸化60 min。之后，在修飾電極表面滴涂5 μL 1% BSA溶液和5 μL S1-AuNPs-Ab 探針，室溫孵育60 min。最后，在電極表面分別滴涂5 μL H1 和H2 溶液，室溫孵育80 min后，滴加5 μL MB溶液，用PBS緩沖液淋洗電極，得到電化學(xué)生物傳感器。

1.6 細(xì)胞裂解液樣品的制備

選擇人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和肝癌細(xì)胞（HepG-2）為實際樣品，在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃和5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)細(xì)胞樣品中加入1 mL 細(xì)胞裂解緩沖液（4 ℃預(yù)冷），放置反應(yīng)30 min，待細(xì)胞全部裂解后，于12 000 r/min離心20 min，取上清液于20 ℃儲存，備用。

1.7 電化學(xué)測量

采用循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜法（EIS）對傳感器的制備過程進(jìn)行表征，CV 電位掃描范圍為-0.2 V 至0.6 V，掃速為100 mV/s，EIS 頻率范圍為0.1 Hz～100 kHz，電位振幅為10 mV。利用差分脈沖伏安法（DPV）在0.1 mol/L PBS（pH 7.4，0.1 mol/L MgCl2）緩沖液中對PKA 活性進(jìn)行定量檢測，DPV電位掃描范圍為-0.5 V 至0 V，振幅設(shè)置為0.05 V，調(diào)制時間為0.02 s，間隔時間為0.5 s。所有電化學(xué)測量均在室溫條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的設(shè)計原理

基于納米生物條形碼和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雙重信號放大策略構(gòu)建PKA 電化學(xué)生物傳感器的制備過程和設(shè)計原理如圖1 所示。依次在GCE 表面修飾MoS2納米片和AuNPs 以增強電極的電催化活性。半胱氨酸修飾的底物肽鏈（Peptide）通過Au-S 鍵固定到修飾電極表面。當(dāng)存在PKA 和ATP 時，底物肽鏈被磷酸化（P-peptide），生物條形碼S1-AuNPs-Ab 探針通過Ab 抗體與P-peptide 特異性結(jié)合，修飾到電極表面。S1-AuNPs-Ab 探針中的S1 作為引發(fā)鏈，誘發(fā)H1 和H2 發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，并產(chǎn)生HCR。最后，HCR產(chǎn)物長鏈dsDNA通過吸附MB電活性分子，實現(xiàn)電化學(xué)響應(yīng)信號放大，實現(xiàn)PKA活性的定量分析。

圖1 電化學(xué)生物傳感器的制備過程和檢測PKA活性的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of fabrication process and detection principle of electrochemical biosensor for detection of PKA activity

2.2 電極修飾材料的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和能量色散譜法（EDS）對電極修飾材料MoS2和AuNPs 的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。由圖2A 可見，制備的MoS2呈現(xiàn)類石墨烯的二維納米片狀結(jié)構(gòu)，平均直徑為200 nm。圖2A 中插圖為MoS2高分辨TEM 圖，可觀察到類石墨烯的褶皺結(jié)構(gòu)，其晶格間距為0.68 nm。EDS 能譜分析表明（圖2B），除基底硅片中Si 元素外，僅出現(xiàn)Mo 和S 元素的特征峰，也說明MoS2納米片成功制備。圖2C 為AuNPs 的TEM 圖，由圖可見，制備的AuNPs 粒子呈均勻分散的球形，平均粒徑為15 nm。

圖2 MoS2的掃描電鏡圖（A）、X射線能譜圖（B），以及AuNPs的透射電鏡圖（C）Fig.2 SEM image（A） and EDS spectrum（B） of MoS2，and TEM image of AuNPs（C）

2.3 納米生物條形碼S1-AuNPs-Ab的表征

圖3A 為AuNPs（曲線a）及S1-AuNPs-Ab（曲線b）的紫外-可見吸收光譜。由圖可見，AuNPs 在520 nm處有一特征吸收峰，AuNPs表面修飾DNA S1和Ab后，其特征吸收峰紅移至527 nm，且在258 nm處出現(xiàn)DNA的特征吸收峰，表明成功制備了S1-AuNPs-Ab探針。

圖3 AuNPs（a）及S1-AuNPs-Ab（b）的紫外-可見吸收光譜圖（A），以及傳感器在加入20 U/mL PKA前（a）后（b）的DPV響應(yīng)曲線（B）Fig.3 UV-Vis absorption spectra of AuNPs（a） and bio-barcode S1-AuNPs-Ab（b）（A） and DPV curves of fabricated biosensor before（a） and after（b） adding 20 U/mL PKA（B）

2.4 可行性研究

為了驗證所設(shè)計傳感器的可行性，本實驗測試了傳感器在加入目標(biāo)物PKA 前后的DPV 響應(yīng)。如圖3B 顯示，加入PKA 前，傳感器僅呈現(xiàn)弱的背景電流信號（曲線a）；當(dāng)加入20 U/mL PKA 后，DPV 的峰電流響應(yīng)信號顯著增強（曲線b）。實驗結(jié)果表明，底物肽鏈被PKA 磷酸化后，結(jié)合S1-AuNPs-Ab 探針和HCR可放大電化學(xué)響應(yīng)信號，實現(xiàn)PKA活性的定量測定。

此外，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗進(jìn)一步驗證了雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的可行性（圖4）。泳道1 為20 bp Marker，泳道2 為DNA 引發(fā)鏈S1，泳道3 和泳道4 分別為H1 和H2，泳道5 為H1 + H2，泳道6 為S1 +H1+H2。泳道6中出現(xiàn)新的連續(xù)條帶，表明在引發(fā)鏈S1的存在下產(chǎn)生HCR 反應(yīng)，說明本實驗結(jié)合生物條形碼和HCR反應(yīng)技術(shù)放大電化學(xué)響應(yīng)信號是可行的。

圖4 不同反應(yīng)過程中的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of different reaction processes

2.5 修飾電極的電化學(xué)表征

采用循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）對傳感器的修飾過程進(jìn)行電化學(xué)表征，結(jié)果如圖5 所示。通過CV 峰電流、峰電位（ΔE）和EIS 等效電路中的電荷轉(zhuǎn)移阻抗（Rct）研究了傳感器的制備和修飾過程。由圖5A 所示，GCE（曲線a）表面修飾MoS2后，CV 曲線的峰電流明顯增大（曲線b），進(jìn)一步修飾AuNPs 后，由于其優(yōu)良導(dǎo)電性和大比表面積，CV 曲線中的氧化還原峰電流顯著增強（曲線c）。修飾底物肽鏈后，生物分子的惰性本質(zhì)阻礙了電極表面電子傳遞，CV 曲線峰電流減?。ㄇ€d）。底物肽鏈發(fā)生磷酸化（曲線e）和結(jié)合S1-AuNPs-Ab 探針（曲線f），由于磷酸基團(tuán)和DNA 表面所帶負(fù)電荷與電活性分子的靜電排斥作用，使得CV 曲線峰電流繼續(xù)下降。S1-AuNPs-Ab 探針中S1 發(fā)生HCR 后（曲線g），CV 曲線峰電流進(jìn)一步降低。EIS 譜圖中（圖5B），電子轉(zhuǎn)移阻抗（Rct）變化過程與CV相反。修飾AuNPs后，Rct減?。ㄇ€b），之后隨修飾步驟增加，Rct逐漸增大。以上實驗結(jié)果表明，該電化學(xué)傳感器成功制備。

圖5 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖（A）和電化學(xué)阻抗譜（B）Fig.5 CV（A） and EIS（B） curves of different modified electrodes

2.6 實驗條件的優(yōu)化

為獲得最佳的傳感分析檢測性能，對傳感器制備過程和測試條件（如MoS2和AuNPs 物料比、ATP濃度、磷酸化時間、S1-AuNPs-Ab 孵育時間和HCR 時間）進(jìn)行優(yōu)化（如圖6 所示）。隨MoS2和AuNPs 物料比從3∶1 變化到1∶3，在二者物料比為1∶1 時，得到最大峰電流響應(yīng)（圖6A）。ATP 濃度從0 增加到200 mmol/L，傳感器響應(yīng)電流逐漸增加，且在100 mmol/L 時達(dá)到飽和（圖6B）。底物肽鏈磷酸化時間從0 增加到120 min，響應(yīng)電流在60 min 時趨于飽和（圖6C）。底物肽鏈磷酸化后與S1-AuNPs-Ab 探針的孵育時間為60 min 時，傳感器響應(yīng)電流達(dá)到飽和值（圖6D）。對不同HCR 時間（0、20、40、60、80、100、120 min）的優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)HCR時間為80 min時，響應(yīng)峰電流達(dá)到穩(wěn)定和最大值。因此，本實驗選擇MoS2和AuNPs 物料比為1∶1，ATP 濃度為100 mmol/L，底物肽鏈磷酸化時間為60 min，S1-AuNPs-Ab 孵育時間為60 min，HCR 時間為80 min 作為最佳實驗條件，此時傳感器呈現(xiàn)出最佳的分析性能。

圖6 實驗條件的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the experimental conditions

2.7 PKA活性檢測

在上述最優(yōu)實驗條件下，采用DPV 法測定電化學(xué)傳感器對不同濃度PKA 的響應(yīng)峰電流，如圖7A所示。隨著PKA 濃度的增加（0、10-3、10-2、10-1、1、2、5、10、20 U/mL），DPV 峰電流增大。DPV 峰電流與PKA濃度在10-3～20 U/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（圖7B），其線性方程為I（μA） = 0.24lgρ（U/mL）+1.18，檢出限（S/N=3）為3×10-4U/mL，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.993 6。表2 對比了本工作與已報道方法檢測PKA 活性的分析性能，由表2 可見，該傳感器具有線性范圍寬和檢出限低的優(yōu)點，本工作為PKA 的檢測分析提供了一種新的傳感分析平臺。

圖7 傳感器對不同濃度PKA的DPV響應(yīng)曲線（A）及DPV峰電流與PKA濃度的關(guān)系曲線（B）Fig.7 DPV curves of biosensor to different concentrations of PKA（A），and relationship between DPV current and PKA concentration（B）

表2 不同方法檢測PKA活性的分析性能比較Table 2 Comparison of analytical performance of the proposed electrochemical biosensor with other reports for PKA activity assay

2.8 抑制劑分析

為了進(jìn)一步驗證該方法對PKA 抑制劑的篩選和分析能力，在上述相同實驗條件下，加入不同濃度的H-89 作為抑制劑，測定傳感器對PKA 的電化學(xué)響應(yīng)。如圖8 所示，隨著磷酸化過程中H-89 濃度的增加，傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號逐漸減小，表明PKA 活性受到的抑制作用增強，其半數(shù)最大抑制濃度（IC50）為91 nmol/L，與文獻(xiàn)報道一致［25，54］。實驗結(jié)果表明，該傳感分析方法可用于PKA 抑制劑的分析和篩選，為PKA相關(guān)藥物的發(fā)現(xiàn)提供幫助。

圖8 H-89對PKA活性的抑制實驗Fig.8 Inhibition effect of different concentrations of H-89 on PKA activity

2.9 傳感器的選擇性、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

為評價傳感器的選擇性和抗干擾能力，考察了傳感器對其它不同蛋白和激酶的電化學(xué)響應(yīng)。如圖9所示，相較于其它干擾物，傳感器對10 U/mL PKA 呈現(xiàn)明顯的電化學(xué)響應(yīng)信號，而對于過量的干擾物T4多聚合核苷酸激酶（T4 PNK，40 U/mL）、牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL）、辣根過氧化物酶（HRP，1 mg/mL）、溶菌酶（Lysozyme，5 mg/mL）和堿性磷酸酶（ALP，2 mg/mL）均無明顯的響應(yīng)電流變化。為了考察傳感器的重現(xiàn)性，采用相同的修飾過程制備5 支修飾電極，分別測試其對10 U/mL PKA 的DPV 峰電流響應(yīng)信號。結(jié)果顯示，5 支修飾電極對相同濃度的PKA 響應(yīng)電流相近，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于4.5%。通過測試修飾電極不同儲存時間（4 ℃）后對PKA的電流響應(yīng)信號以考察傳感器的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，當(dāng)傳感器儲存3周后，其對PKA的電流響應(yīng)信號仍保持在初始值的92%以上。以上結(jié)果說明，本實驗構(gòu)建的電化學(xué)傳感器具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可用于實際樣品中PKA活性的分析。

圖9 傳感器的選擇性Fig.9 Selectivity of the proposed electrochemical biosensor

2.10 實際樣品的測定

為驗證該方法對實際樣品中PKA 活性檢測的可行性，選取人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和肝癌細(xì)胞（HepG-2）的裂解液作為實際樣品，采用加標(biāo)回收法測定電化學(xué)響應(yīng)和回收率。2種細(xì)胞裂解液中分別加入不同濃度的PKA，測定其電化學(xué)響應(yīng)信號，實驗結(jié)果如表3 所示。該電化學(xué)傳感器測定實際細(xì)胞裂解液中PKA 的回收率為92.4%～101%，RSD 為2.7%～4.2%，表明該方法對細(xì)胞裂解液中PKA 活性的測定具有可行性。

表3 人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和肝癌細(xì)胞（HepG-2）裂解液中PKA活性的測定結(jié)果Table 3 Determined results of PKA activity in cell lysates of MCF-7 and HepG-2（n=3）

3 結(jié) 論

本文結(jié)合納米生物條形碼和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的雙重信號放大策略構(gòu)建了一種電化學(xué)生物傳感器用于蛋白激酶活性的靈敏測定。以MoS2/AuNPs納米復(fù)合材料作為電極修飾材料，增強電極的電催化活性。底物肽鏈通過Au-S鍵修飾到電極表面，當(dāng)存在目標(biāo)物PKA 時，底物肽鏈發(fā)生磷酸化，與納米生物條形碼S1-AuNPs-Ab 探針特異性結(jié)合。S1-AuNPs-Ab 探針中S1 作為引發(fā)鏈，誘發(fā)HCR。HCR 產(chǎn)物吸附MB 電活性分子，產(chǎn)生放大的電化學(xué)響應(yīng)信號，從而實現(xiàn)對PKA 活性的定量分析。該電化學(xué)傳感器具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可用于實際樣品細(xì)胞裂解液中PKA 的測定，該方法同樣對蛋白激酶抑制劑篩選和激酶相關(guān)藥物的發(fā)現(xiàn)具有參考價值。